Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

23.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59780

⸱

4 september 2019

 ,  ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Samenvatting

Genoom bewerking met het crispr-CAS-systeem heeft de mogelijkheid om de genomen van verschillende organismen nauwkeurig te bewerken enorm uitgebreid. In de context van zoogdiercellen vertegenwoordigt deze technologie een nieuw middel om Genome-brede genetische schermen voor functionele genomics-onderzoeken uit te voeren. Bibliotheken van Guide RNAs (sgRNA) gericht op alle open Lees frames toestaan de facile generatie van duizenden genetische verstoringen in een enkele pool van cellen die kunnen worden gescreend voor specifieke fenotypes om de genfunctie en cellulaire processen in een zonder vooringenomen en systematische wijze. CRISPR-CAS schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de genetische blauwdrukken voor cellulaire fenotypes te achterhalen. Bovendien kan differentiële analyse van schermen uitgevoerd in verschillende cellijnen en van verschillende kankersoorten genen identificeren die contextueel essentieel zijn in tumorcellen, waardoor potentiële doelen voor specifieke therapieën tegen kanker worden onthuld. Het uitvoeren van genoom-brede schermen in menselijke cellen kan ontmoedigend zijn, omdat dit de behandeling van tientallen miljoenen cellen inhoudt en een analyse van grote gegevenssets vereist. De details van deze schermen, zoals de karakterisering van de cellijn, overwegingen van CRISPR Library en het begrijpen van de beperkingen en mogelijkheden van CRISPR-technologie tijdens de analyse, worden vaak over het hoofd gezien. Hier is een gedetailleerd protocol voor de succesvolle prestaties van gegroepeerde genoom-Wide CRISPR Cas9 gebaseerde schermen.

Inleiding

CRISPR-CAS, kort voor geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen en CRISPR-geassocieerde nuclease, bestaat uit een enkelvoudig Nuclease eiwit (bijv. Cas9) in complex met een synthetische gids RNA (sgRNA). Dit RiboNucleoProteïne complex richt zich op het Cas9 enzym om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te induceren bij een specifieke genomische Locus1. Dubbel-gestrande pauzes kunnen worden gerepareerd via homologie gerichte reparatie (HDR) of, meer in het algemeen, door niet-homologeuze end-aansluiting (NHEJ), een foutgevoelig reparatie mechanisme dat resulteert in inbrengen en/of verwijderingen (INDELS) die vaak de genfunctie verstoren 1. de efficiëntie en eenvoud van crispr maakt een eerder onbereikbaar niveau van genomische targeting mogelijk dat ver overtreft eerdere genoom bewerkings technologieën [d.w.z. zink vinger nucleasen (znf) of transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen ( TALENS), die beide lijden aan een verhoogde ontwerp complexiteit, lagere transfectie-efficiëntie en beperkingen in multiplex Gene Editing2].

De basis onderzoekstoepassing van CRISPR single-Guide RNA-gebaseerde genoom Editing heeft wetenschappers toegestaan om de functies van individuele genen en de topologie van genetische interactie netwerken efficiënt en voordelig te ondervragen. De mogelijkheid om functionele genoom-brede schermen uit te voeren is sterk verbeterd door het gebruik van het CRISPR-CAS systeem, vooral in vergelijking met eerdere genetische perturbatie technologieën zoals RNA interferentie (RNAi) en Genval mutagenese. In het bijzonder lijdt RNAi aan hoge doel effecten en onvolledige knockdown, wat resulteert in een lagere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met crispr3,4,5, terwijl gentrap methoden alleen haalbaar zijn in haploïde cellen voor verlies-van-functie schermen, beperking van het bereik van celmodellen die kunnen worden verhoord6. Het vermogen van CRISPR om volledige genknock-out te genereren biedt een meer biologisch robuust systeem om Mutante fenotypes te ondervragen, met weinig ruis, minimale off-target effecten en consistente activiteit over reagentia5. Crispr Cas9 sgrna-bibliotheken die het hele menselijke genoom targeten, zijn nu algemeen beschikbaar, waardoor gelijktijdige opwekking van duizenden genknock-outs in een enkel experiment3,7,8,9 .

We hebben unieke CRISPR-Cas9 Genome-wide sgRNA lentivirale bibliotheken ontwikkeld, de Toronto knock-out (TKO) bibliotheken (beschikbaar via Addgene) die compact en sequence-geoptimaliseerd zijn om functionele genomics schermen met hoge resolutie te faciliteren. De nieuwste bibliotheek, TKOv3, richt zich op ~ 18.000 humane eiwit codering genen met 71.090 gidsen geoptimaliseerd voor het bewerken van efficiëntie met empirische data10. Daarnaast is TKOv3 beschikbaar als een bibliotheek met één component (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) die Cas9 en sgRNAs uitdrukken op een enkele vector, waardoor de noodzaak voor het genereren van stabiele Cas9-uitstellende cellen wordt verlicht, zodat het genoom-brede knock-out over een breed scala aan celtypen van zoogdieren. TKOv3 is ook beschikbaar in een vector zonder Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) en kan worden gebruikt in cellen die Cas911uitdrukken.

Een genoom-brede CRISPR Cas9 bewerkte celpopulatie kan worden blootgesteld aan verschillende groeiomstandigheden, waarbij de overvloed aan Sgrna's in de tijd wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing, waardoor een uitlezen wordt gegeven om de drop-out of verrijking van cellen te beoordelen met traceerbare genetische Verstoringen. CRISPR knock-out bibliotheken kunnen worden aangewend om genen te identificeren die, na perturbatie, cellulaire fitness defecten veroorzaken, matige geneesmiddel gevoeligheid (bijv. gevoelige of resistente genen), eiwit expressie reguleren (bijv., reporter), of zijn vereist voor een bepaalde Pathway functie en cellulaire toestand12,13,14. Differentiële fitness schermen in een kankercel lijn kunnen bijvoorbeeld zowel de uitputting als de reductie van oncogenen en verrijking of een toename van de tumor suppressors genen3,14,15identificeren. Evenzo kan het gebruik van tussenliggende doses therapeutische geneesmiddelen zowel de resistentie van de drug en sensibilisatie genen16,17onthullen.

Hier is een gedetailleerd screening protocol voor CRISPR-Cas9 verlies-van-functie screening met behulp van de Toronto knock-out libraries (TKOv1 of v3) in zoogdiercellen van bibliotheek generatie, screening van prestaties tot gegevensanalyse. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor screening met behulp van de Toronto knock-out Bibliotheken, het kan worden toegepast en schaalbaar te worden tot alle CRISPR sgRNA gepoolde bibliotheken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hieronder beschreven experimenten moeten de richtlijnen van het Instituut voor milieu gezondheid en veiligheid volgen.

1. gepoolde CRISPR sgRNA lentivirale bibliotheek plasmide versterking

  1. Verdun de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmide DNA-bibliotheek tot 50 ng/μL in TE (bijv. TKOv3).
  2. Electroporate de bibliotheek met behulp van elektrocompetente cellen. Stel in totaal vier elektroporation reacties in zoals hieronder beschreven.
    1. Voeg 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliotheek toe aan 25 μL ontdooide elektrocompetente cellen voor voorgekoelde cuvettes (1,0 mm) op ijs.
    2. Elektroporate met behulp van optimale instellingen voorgesteld door het Protocol van de fabrikant. Voeg binnen 10 s van de puls 975 μL van het Herstelmedium (of het SOC-medium) toe aan de Cuvette.
    3. Breng elektroporated cellen over naar een kweek buis en voeg 1 mL herstel medium toe. Incuberen buisjes in een schud incubator bij 250 rpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
  3. Stel een verdunnings plaat in om de bibliotheek te titer en bereken de efficiëntie van de transformatie.
    1. Pool alle 8 mL herstelde cellen en meng goed. Breng 10 μL van de gepoolde cellen over naar 990 μL terugwinnings medium voor een 800-voudige verdunning en meng goed.
    2. Plaat 20 μL van de verdunning op een voorverwarmde 10 cm LB + carbenicillaire (100 μg/L) agar plaat. Dit resulteert in een 40.000-voudige verdunning van de transformanten die zal worden gebruikt om de transformatie-efficiëntie te berekenen.
    3. Plaat 400 μL van herstelde cellen op elk plaatje over een totaal van 20 voorverwarmde 15 cm LB + carbenicillaire agar platen. Inbroed de platen voor 14 – 16 uur bij 30 °C.
      Opmerking: groei bij deze lagere temperatuur minimaliseert de recombinatie tussen Long-terminale herhalingen (LTR)18.
    4. Om de transformatie-efficiëntie te berekenen, telt u het aantal kolonies op de 40.000-voudige verdunnings plaat (stap 1.3.2). Vermenigvuldig het aantal kolonies geteld met 40.000 om het totale aantal kolonies op alle platen te verkrijgen. Ga verder als het totale aantal kolonies een bibliotheek dekking vertegenwoordigt die overeenkomt met minimaal 200x kolonies per sgRNA (meest optimale is 500-1000x).
      1. Het minimale kolonie nummer voor TKOv3 Library (71.090 sgRNA) is bijvoorbeeld 1,4 x 107, wat overeenkomt met 200x kolonies per sgrna. Als de kolonie vertegenwoordiging onvoldoende is, verhoog dan het aantal elektroporaties in stap 1,2 op basis van het aantal kolonies op de verdunnings plaat om de minimale dekking van de bibliotheek te bereiken.
  4. Oogst de kolonies zoals hieronder beschreven
    1. Aan elke 15 cm plaat, voeg 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) medium, dan schrait de kolonies af met een cel strooier. Breng met een pipet van 10 mL de geschuurd cellen over in een steriele erlenmeyer van 1 L of een fles.
    2. Nogmaals spoel de plaat met 5 mL LB + carbenicillin medium en breng de oplossing op de fles.
    3. Herhaal dit voor alle platen om cellen te pool van 20 platen in een steriele fles.
  5. Meng verzamelde cellen met een roerstaaf voor 1 uur bij kamertemperatuur (RT) om celklonters te breken. Breng cellen over naar vooraf gewogen centrifuge flessen en centrifugeer op 7.000 x g naar pellet bacteriën en gooi vervolgens de media weg.
  6. Weeg de natte celkorrel af en trek het gewicht van de centrifuge fles af om het uiteindelijke gewicht van de natte pellet te bepalen. Reinig plasmide DNA met behulp van een Maxi-of Mega schaal plasmide reinigingsset, afhankelijk van de hoeveelheid bacteriële pellet die elke kolom kan verwerken.

2. grootschalige CRISPR sgRNA Library lentivirus productie

Opmerking: alle stappen in dit gedeelte van het protocol worden uitgevoerd in een BSL2 + faciliteit in een klasse II, type a2 bioveiligheid Cabinet.

  1. Bereken het aantal platen van 15 cm dat nodig is voor de virus productie op basis van de schatting dat 18 mL van het virus meestal wordt geoogst van 1 15 cm plaat.
  2. Maak cellen voor transfectie door het zaaien van HEK-293T verpakkings cellen in low-antibiotische groeimedia (DMEM + 10% FBS + optioneel: 0.1 x pen/STREP) bij 8 x 106 cellen per 15 cm plaat in 20 ml media. Incuberen cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO2. Zorg ervoor dat de vergulde cellen 70% – 80% Confluent Health zijn en gelijkmatig worden verspreid op het moment van transfectie.
  3. Volgende dag, bereid drie transfectie plasmiden mengsel zoals beschreven in tabel 1 voor 15 cm platen. Bereken de hoeveelheid plasmide die nodig is voor één trans fectie en maak een mix van plasmiden voor het aantal platen, plus één om te worden getransffecteerd.
  4. Bereid een lipide-gebaseerde transfectie reagens voor elke trans fectie zoals beschreven in tabel 2. Aliquot verlaagde serum media in afzonderlijke micro centrifugebuizen van 1,5 mL voor het aantal te transfeen platen. Voeg transfectie reagens toe, meng zachtjes en inbroed gedurende 5 minuten bij RT.
  5. Voeg na 5 minuten incubatie de hoeveelheid DNA toe die nodig is voor één trans fectie naar het transfectie-reagens voor een 3:1-verhouding tussen reagens-tot-μg-DNA-complex. Meng zachtjes en inincuberen gedurende 30 min bij RT.
    Opmerking: daaropvolgende transfecties kunnen worden bereid in sets van vijf of minder, met 5 minuten intervallen om te optimaliseren voor tijd en te voorkomen dat overmatige incubatie.
  6. Breng na 30 minuten incubatie elke transfectiemix zorgvuldig over naar elke plaat van de verpakkings cellen. Voeg de hele mix toe met een 1 ml pipetpunt druppelsgewijs in een cirkelvormige, zigzagbeweging zonder de celmonolayer te verstoren. Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 18 uur bij 5% CO2.
  7. Bereid virale oogst media voor: 500 mL DMEM medium + 32 mL BSA kolf (20 g/100 mL, opgelost in DMEM, filter gesteriliseerd met 0,22 μm filter) + 5 mL 100x pen/STREP.
  8. Verwijder na 18 uur de media (gebruik de juiste behandeling van lentivirusafval zoals incubatie in 1% natriumhypochloriet gedurende 30 minuten voor verwijdering). Vervang voorzichtig met 18 mL virale oogst media naar elke plaat. Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 18 uur bij 5% CO2.
  9. Controleer na 24 uur de verpakkings cellen op abnormale en gesmolten morfologie als indicatie van een goede virus productie. Oogst dan het lentivirus door alle supernatant te verzamelen en over te brengen naar een steriele conische centrifugebuis.
  10. Draai de media met virus op 300 x g gedurende 5 minuten en pellet de verpakkings cellen. Aliquot het supernatant in een steriele polypropyleen buis zonder de pellet te verstoren.
  11. Bewaar het virus gedurende korte perioden bij 4 °C (minder dan 1 week) of onmiddellijk bij-80 °C voor langdurige opslag. Aliquot grootschalige virus Preps voor eenmalig gebruik volumes voor lange termijn opslag om te voorkomen dat bevriezen/ontdooien.

3. cellijn karakteriseren voor screening

  1. Selecteer de gewenste cellijn.
    1. Meet en noteer de geschatte verdubbelingstijd van de cellen.
    2. Bepaal de optimale celplating dichtheid voor het kweken van cellen elke 3 – 4 Cell doublings in een weefselkweek vaartuig naar keuze (bijv., 15 cm weefselkweek platen).
  2. Bepaal de puromycine concentratie te gebruiken in de gewenste cellijn voor selectie van TKO bibliotheken met puromycine resistentie marker als volgt:
    1. Zaadcellen in een 12-put plaat bij de dichtheid die nodig is om de samenvloeiing te bereiken na 72 h, vervolgens inincuberen 's nachts (37 °C, 5% CO2).
    2. De volgende dag, verandering in een medium met een verdunnings bereik van puromycine concentraties van 0 μg/mL tot 10 μg/mL, in stappen van 0,5 μg/mL. Inincuberen de cellen voor 48 h.
    3. Na 48 h, meet de levensvatbaarheid van de cel door celtelling of alamarBlue kleuring.
    4. Bepaal de laagste concentratie die 100% van de cellen in 48 h doodt. Gebruik deze concentratie te selecteren voor CRISPR Library getransduceerde celpopulaties in stappen 4,6 en 5.2.6.
      Opmerking: voor cellijnen met langere Verdubbelings tijden kunnen langere incubaties met puromycine worden getolereerd. Bepaal in deze situaties de Kill-curve voor de incubatietijd die nodig is voor < 3-cel doublings. Minimaliseer de tijd voor selectie om uitval van essentiële genen voor aanvang van de screening te voorkomen.
  3. Controleer cellen op gevoeligheid voor hexadimethrine bromide (tot 8 μg/mL) door een dosisrespons curve uit te voeren in dezelfde methode als gebruikt voor het meten van de gevoeligheid van puromycine (stap 3,2). Indien toxiciteit wordt waargenomen met < 8 μg/mL hexadimethrine bromide, niet gebruiken.

4. functionele titratie van gepoolde CRISPR lentivirusbibliotheek voor de bepaling van MOI

  1. Ontdooi een vers aliquot van de gepoolde CRISPR sgRNA Library lentivirus (bijv. LCV2:: TKOv3) en blijf op ijs.
  2. Ontwerp een reeks virus volumes om te testen tussen het bereik van 0 – 2 mL (d.w.z. 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL en 2 mL).
  3. Oogst doelcellen en zaadcellen in 15 cm platen bij de dichtheid die nodig is om de samenvloeiing te bereiken in 72 h.
  4. Voor elk virus volume dat moet worden getest, bereidt u dubbele platen voor. Voeg cellen, virus, hexadimethrine bromide (8 μg/mL) en media toe aan een eindvolume van 20 mL. Meng platen grondig, zitten platen niveau in incubator en incuberen voor 24 h (37 °C, 5% CO2).
  5. Na 24 uur, verwijder Virus met media en gooi (gebruik bioveiligheid voorzorgsmaatregelen voor de behandeling van lentivirus afval). Reinig desgewenst de plaat voorzichtig met een warme PBS om het virus te verwijderen.
  6. Voor elke virus aandoening, vervangen door 20 mL media met puromycine met behulp van de concentratie bepaald om cellen te doden in sectie 3, op één replicaatplaat. Voeg aan de andere plaat 20 mL verse media toe zonder puromycine. Inincuberen voor 48 h (37 °C, 5% CO2).
  7. Na 48 h, Controleer dat alle niet-geïnfecteerde cellen (0 mL virus aandoening) behandeld met puromycine zijn dood. Oogst alle platen afzonderlijk en dispergeer de cellen door herhaalde zachte pipetteren.
  8. Tel cellen van alle platen en bereken de MOI voor elk virus volume door het vergelijken van celtellingen met puromycine selectie naar celtellingen zonder puromycine (dat wil zeggen, +/-puromycine).
  9. Grafiek resultaten om te bepalen van het virus volume dat leidt tot 30% – 40% overleving van de cel met puromycine selectie versus zonder puromycine. Gebruik dit virus volume om een MOI van 0,3 – 0,4 te bereiken tijdens het scherm onder dezelfde weefselcultuur omstandigheden.

5. primaire scherm infectie, selectie en celpassaging

  1. Selecteer de CRISPR sgRNA bibliotheek dekking moet worden gehandhaafd op het hele scherm (aanbevolen minimum van 200-fold).
    1. Bepaal op basis van de bibliotheek dekking het aantal cellen dat nodig is om deze dekking per sgRNA te behouden en het aantal cellen dat nodig is voor infectie bij MOI 0,3 (tabel 3).
    2. Bepaal het aantal platen dat nodig is om de infectie in te stellen (tabel 4).
  2. Het infecteren van de cellen met CRISPR Library
    1. Oogst cellen en zaai het vereiste celnummer op elke 15 cm plaat.
    2. Voeg hexadimethrine bromide (8 μg/mL) toe aan alle platen.
    3. Voeg het virus toe op het volume dat nodig is voor MOI 0,3 om te screenen en de controle 2 platen. Voor het besturingselement 1 voegt u geen virus toe en vervangt u dat volume door media.
    4. Meng de platen grondig door te kantelen. Plaats de platen in de incubator en zorg dat ze een niveau hebben.
      Opmerking: batch infecties kunnen worden gedaan door het combineren van een Master mix van virus, media, en hexadimethrine bromide aan cellen in suspensie voor het beplating.
    5. Verwijder media en vervang met verse media die puromycine bevatten bij de concentratie bepaald in stap 3.2.4 tot de screening en controle 1 platen 24 h na virus infectie. Voeg verse media zonder puromycine toe aan de Control 2-plaat. Inincuberen van cellen voor 48 h (37 °C, 5% CO2).
    6. 48 h na toevoeging van puromycine, ervoor te zorgen dat alle niet-geïnfecteerde cellen zijn dood (controle 1) om te bevestigen puromycine activiteit, dan oogst de geïnfecteerde cellen.
  3. Het oogsten van geïnfecteerde celpopulatie en celpassaging
    1. Oogst de puromycine-geselecteerde cellen van alle zeef platen in één steriele container. Verzamel de cellen van elke regel plaat afzonderlijk. Dispergeer cellen door voorzichtig herhaald pipetteren.
    2. Tel cellen van gegroepeerde screening cellen, Control 1 en Control 2 afzonderlijk en bereken het aantal cellen per 1 mL.
    3. Bereken MOI en fold dekking als volgt bereikt:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. Verzamel drie replicaten van celpellets uit de samengevoegde cellen in de geselecteerde bibliotheek dekking voor genomische DNA-extractie. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min. was met PBS. Label de buizen en Vries droog de celpellets bij-80 °C (dit zijn T0 referentiemonsters).
    5. Splits de groep geïnfecteerde cellen in drie replicaatgroepen (bijvoorbeeld repliceer A, repliceer B, repliceer C), terwijl de bibliotheek dekking binnen elke replicaat behouden blijft. Zaadcellen met dezelfde zaaien dichtheid als normaal zou worden gebruikt bij het uitbreiden. Gebruik hetzelfde aantal cellen voor elke replicaatplaat en hetzelfde totale aantal cellen tussen replicaten.
    6. Doorgaan om cellen te passeren en oogst drie replicaten van celpellets uit elke repliceren van gepoolde cellen zoals hierboven, elke 3 – 8 dagen afhankelijk van de cellijn, voor maximaal 15 – 20 cel doublings. Oogst bij elke passage de cellen van alle platen in elke replicaatgroep met elkaar (d.w.z. alle cellen van een replicaat worden samen opnieuw gemengd, alle cellen van repliceer B-platen worden opnieuw gemengd, enz.).
    7. Label elke pellet met een tijd (T) en repliceer de benaming. Dit komt overeen met het aantal dagen na T0 dat de pellet wordt verzameld (bijv. T3_A, T3_B, T3_C, enz.).
  4. Voor de negatieve selectie drug schermen, toestaan cellen te herstellen voor ten minste één passage na T0 vóór de behandeling. Bij T3 of T6, splitst u de cellen van elke replicaatgroep (A, B, C) in medicamenteuze behandeling en controle populaties, met behulp van dezelfde zaaien dichtheid gebruikt in stap 5.3.5.
    1. Apart pool het aantal cellen dat is vereist voor de dekking van de bibliotheek voor elke replicatie in de groep medicamenteuze behandeling. Voeg de drug in tussenliggende concentraties (IC20-IC50). Zaai de cellen en incuberen (37 °C, 5% CO2) tot de volgende passage.
    2. Apart pool het aantal cellen dat is vereist voor de dekking van de bibliotheek voor elke replicatie in de controlegroep voertuig. Voeg de voertuigbesturing toe met hetzelfde volume als het medicijn (< 0,5% v/v). Zaai de cellen en incuberen (37 °C, 5% CO2) tot aan de volgende passage.
    3. Blijf de cellen passeren en oogst de celpellets voor genomisch DNA elke 3 dagen zoals beschreven in stap 5.3.5, terwijl het medicijn of voertuig bij elke passage wordt verversen.
  5. Voor de schermen positieve selectie of drug resistentie splitst u elke replicaatgroep op basis van het aantal cellen dat is vereist voor bibliotheek dekking. IC90 drug concentraties toevoegen aan elke replicatie. Bij IC90wordt een meerderheid van de cellen gedood. Laat resistente populaties groeien en verzamel celpellets (1 – 2 x 107 cellen) voor GENOMISCHE DNA-extractie.

6. CRISPR monstervoorbereiding en sequentiëren

  1. Genomische DNA-zuivering
    1. Inbroed de bevroren celpellets gedurende 5 – 10 minuten bij RT voor ontdooien.
    2. Voeg 1,4 mL PBS toe aan een centrifugebuis van 50 mL die een celpellet bevat. Vortex voor 20 s om de cellen te hervatten en rust gedurende 1 minuut. Pipetteer 15x met P1000 indien nodig om de resterende celklonten op te splitsen. Als u cellen overbrengt van een tube van 15 mL of 1,5 mL, hervat de cellen dan met 1 mL PBS, breng vervolgens cellen over naar een buis van 50 mL en spoel de originele buis met 400 μL PBS.
    3. Voeg 5 mL nuclei Lysisoplossing toe aan de geresuspendeerde cellen. Gebruik een pipet van 10 mL om het monster te mengen door 5x op en neer te pipetteren.
    4. Voeg 32 μL RNase A (20 mg/mL; om een eindconcentratie van 100 μg/mL) aan het nucleaire lysaat te verkrijgen en meng het monster door de buis 5x te inverteren. Inbroed het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 °C en laat het monster gedurende 10 minuten afkoelen bij RT.
    5. Voeg 1,67 mL eiwit precipitatie oplossing toe aan het lysaat en Vortex krachtig gedurende 20 sec. kleine eiwit klonten kunnen zichtbaar zijn na het mengen.
    6. Centrifugeer bij RT 4.500 x g gedurende 10 minuten.
    7. Breng met een pipet van 10 mL de supernatant over in een centrifugebuis van 50 mL die 5 mL isopropanol bevat. Meng voorzichtig de oplossing 10x door inversie totdat het DNA wordt waargenomen.
      Opmerking: DNA kan worden waargenomen als witte, draadachtige strengen die een zichtbare massa vormen.
    8. Centrifugeer op 4.500 x g gedurende 5 minuten bij RT om het DNA te pellet.
    9. Verwijder met een pipet van 10 mL voorzichtig het supernatant en Vermijd het afwerken van de DNA-pellet. Voeg 5 mL 70% ethanol toe aan RT naar het DNA. Draai de buis voorzichtig om de DNA-pellet en de zijkanten van de centrifugebuis te wassen.
    10. Centrifugeer op 4.500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    11. Verwijder met een pipet van 10 mL voorzichtig de 70% ethanol en Vermijd het afwerken van de DNA-pellet. Air-Dry genomisch DNA gedurende 10 minuten bij RT.
    12. Voeg 400 μL te oplossing toe aan de buis en laat het DNA oplossen door gedurende 1 uur bij 65 °C te broeien. Meng het DNA door zachtjes elke 15 min de buis te wrijven. Als het DNA niet volledig oplost, inbroed de buis bij 65 ° c voor een extra 1 h terwijl zachtjes het buisje elke 15 min, en laat het bij 4 °C 's nachts.
    13. Centrifugeer bij RT 4.500 x g gedurende 1 minuut en breng GENOMISCH DNA over naar een 1,5 ml-laag bindende buis.
    14. Kwantificeer en meet de zuiverheid van genomisch DNA op zowel de spectrofotometer (voor het totale gehalte aan nucleïnezuur) als op een fluor meter (voor dubbel-streng DNA-gehalte).
  2. (Optioneel) neerslaan genomisch DNA als er problemen met downstream PCR-amplificatie van de sgRNA als volgt zijn.
    1. Breng 400 μL genomisch DNA over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
    2. Voeg 18 μL van 5 M NaCl (eindconcentratie van 0,2 M) en 900 μL 95% ethanol toe.
    3. Inverteer buis 10x tot grondig gemengd, vervolgens Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij RT.
    4. Verwijder voorzichtig de supernatant en Vermijd het afstaan van de DNA-pellet. Was de DNA-pellet met 500 μL van 70% ethanol. Draai de buis voorzichtig om de DNA-pellet te wassen.
    5. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    6. Verwijder voorzichtig de supernatant en Vermijd het loskomen DNA pellet. Air-Dry genomisch DNA gedurende 10 minuten bij RT.
    7. Voeg 300 μL te toe om het DNA op te lossen zoals beschreven in stap 6.1.12.
    8. Kwantificeer en meet de zuiverheid van genomisch DNA zoals beschreven in stap 6.1.14.
  3. Voorbereiding van de bibliotheek CRISPR-sequencing
    1. Stel PCR 1 in zoals beschreven in tabel 5 met een totaal van 100 μg GENOMISCH DNA. Voeg 3,5 μg genomisch DNA per 50 μL-reactie toe en stel identieke 50 μL-reacties in om de gewenste dekking te bereiken. Tabel 6 bevat voorbeelden van primer sequenties voor versterking van LCV2:: TKOv3 sequencing bibliotheken. Tabel 7 bevat voorbeelden van primer sequenties voor de versterking van pLCKO2:: TKOv3 sequencing bibliotheken.
    2. De PCR 1-reacties in een Thermocycler versterken met behulp van het programma dat wordt beschreven in tabel 8.
    3. Controleer PCR 1 amplificatie door 2 μL van het PCR-product op een 1% agarose gel te draaien. PCR 1 levert een product van 600 BP.
    4. Pool alle individuele 50 μL reacties voor elk genomisch DNA monster en meng door vortexing.
    5. Stel één PCR-2-reactie (50 μL) in voor elk monster, zoals aangegeven in tabel 9 , waarbij 5 μL van het gepoolde PCR-1-product als template wordt gebruikt. Gebruik unieke index primer combinaties voor elk afzonderlijk voorbeeld om het groeperen van sequentiëren bibliotheek voorbeelden toe te staan.
    6. Versterk de PCR 2-reactie in een Thermocycler met behulp van het programma dat wordt beschreven in tabel 10.
    7. Reinig de agarose-gelapparatuur voor het zuiveren van versterkte producten met 0,1 N HCl gedurende 10 minuten voorafgaand aan het gieten van een gel. Bereid een 2% agarose gel met DNA vlek voor het zuiveren van PCR 2 versterkte producten.
    8. Voer het PCR 2-product uit op de 2% agarose-gel bij laag voltage (1,0 – 1,5 uur run). PCR 2 levert een product van 200 BP.
    9. Visualiseer de PCR-producten op een blauw licht transverlichter. Accijns de 200 BP band en zuiver DNA van de agarose gel Slice met behulp van een gel extraction Kit. Kwantificeer en meet de zuiverheid van de sequentiebibliotheek op zowel de spectrofotometer als de fluor meter.
      Opmerking: een typische gel-gezuiverde sequentie wisselaar varieert van 5 – 10 ng/μL en een totale opbrengst van 150 – 300 ng.
  4. Sequentiëren met hoge doorvoer
    1. Volg de CRISPR sequencing-bibliotheken op de volgende generatie sequencers.
    2. Sequentie referentie T0 samples met een hogere Lees diepte van 400-tot 500-fold bibliotheek dekking. Volgorde experimentele tijdpunt monsters voor drop-out schermen met een minimale Lees diepte van 200-fold. Voor sterke positieve selectie schermen is een minimale Lees diepte van 50-voudige dekking voldoende voor de identificatie van verrijkte Sgrna's.
      Opmerking: het is van cruciaal belang om het T0-monster te sequenties om de bibliotheek representatie voor een bepaald scherm te bepalen en als referentie te dienen voor het bepalen van sgRNA-vouw wijzigingen in de loop van de tijd.

7. gegevensanalyse

  1. Volg de reeks met behulp van Programma's zoals bowtie voor het toewijzen van reeks leesbewerkingen aan de referentie bibliotheek met behulp van de volgende parameters:-v2 (twee mismatches toestaan) en-M1 (alle gelezen die zijn toegewezen aan meer dan één reeks in de bibliotheek verwijderen).
  2. Normaliseer het aantal unieke in kaart gebrachte leesbewerkingen voor elke sgRNA voor een gegeven steekproef tot 10.000.000 leesbewerkingen per sample als volgt:
    figure-protocol-3107
  3. Bereken de LOG2 fold verandering van elke sgRNA voor elke replicaat op elk tijdpunt (TN) in vergelijking met het T0 monster (TN/T0). Voeg een pseudo Count van 0,5 leesbewerkingen toe aan alle gelezen tellingen om te voorkomen dat er onderbrekingen van nullen. Sluit Sgrna's uit met < 30 RAW-leesbewerkingen in het T0-monster, van de berekening en downstream analyse van de vouw-Change.
  4. Analyseer vouw veranderingen met de Bayesiaanse analyse van Gene essentie (bagel) algoritme < https:///hart-Lab/bagel >, met behulp van de essentiële en niet-essentiële trainings sets die eerder zijn gedefinieerd19 voor genessentialiteits schermen ( Aanvullende tabel S1) of drugz < https://-github.com/hart-Lab/DRUGZ > voor drug screens20.
  5. Bereken de precisie en terugroepen voor scherm prestatiebeoordeling met behulp van BF scores. Gebruik de essentiële set van stap 7,4 als de echte positieve lijst voor de functie precision_recall_curve van de bibliotheek Scikit-Learn voor python, samen met de bovenstaande subset van de BF-Score. U ook hetzelfde uitvoeren met het PRROC-pakket in R.
  6. Bereken de gemiddelde vouw verandering van alle geleiders voor elk gen. Genereer dichtheids percelen voor de essentiële en niet-essentiële genen (zie stap 7,4) in R of gelijkwaardige software. In R, als x. ESS is een vector die de log fold verandering waarden van essentiële genen en x. nonEss bevatten niet-essentiële genen, plot met behulp van de volgende opdracht:
    plot (dichtheid (x. ESS), xlab = "Mean logFC", Col = "rood", lwd = 2)
    lijnen (dichtheid (x. nonEss), Col = "blauw", lwd = 2)
    Opmerking: voor python versiedetails en pakketten gebruikt, zie scikit-Learn v 0.19.1: (gepubliceerd door Pedregosa et al.21).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Overzicht van de CRISPR-screening-workflow voor genoom schaal

Afbeelding 1 illustreert een overzicht van de gepoolde crispr-screening-werkstroom, beginnend met infectie van doelcellen met crispr Library lentivirus bij een lage Moi om te zorgen voor enkelvoudige integratie gebeurtenissen en adequate bibliotheek representatie (meestal 200-tot 1000 -fold). Na infectie worden cellen beh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege de eenvoud van gebruik en hoge buigbaarheid, is CRISPR-technologie op grote schaal goedgekeurd als het instrument van keuze voor precieze genoom bewerking. Gepoolde CRISPR-screening biedt een methode om duizenden genetische verstoringen te ondervragen in één experiment. In gepoolde schermen dienen sgRNA-bibliotheken als moleculaire barcodes, omdat elke sequentie uniek is en wordt toegewezen aan het beoogde gen. Door het genomisch DNA van de celpopulatie te isoleren, kunnen genen die het fenotype van belang veroor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door Genome Canada, het Ontario Research Fund en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaClPromegaV4221
50X TAE bufferBioShopTAE222.4
6 N Hydrochloric acid solutionBioShopHCL666.500
95% Ethanol
Alamar blueThermoFisher ScientificDAL1025
Blue-light transilluminatorThermoFisher ScientificG6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology gradeBioshopALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles MediumLife Technologies11995-065Cel culture media
Electroporation cuvettesBTX45-0134
ElectroporatorBTX45-0651
Endura electrocompetent cellsLucigen90293
Fetal Bovine SerumGIBCO12483-020
HEK293T packaging cellsATCCCRL-3216recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)SigmaH9268Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladderNew England BiolabsN3233S
Nanodrop spectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master MixNew England BiolabsM0544L
Opti-MEMLife Technologies31985-070Reduced serum media
Plasmid maxi purification kitQiagen12963
pMD2.G (envelope plasmid)AddgenePlasmid #12259lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid)AddgenePlasmid #12260lentiviral system
PuromycinWisent400-160-UG
QIAquick gel extraction kitQiagen28704
Qubit dsDNA BR assayThermoFisher ScientificQ32853
Qubit fluorometerThermoFisher ScientificQ33226
RNAse AInvitrogen12091021
S.O.C recovery mediumInvitrogen15544034
SYRB Safe DNA gel stainThermoFisher ScientificS33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 includedAddgeneAddgene ID #90203Genome-wide CRISPR library, includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9AddgeneAddgene ID #125517Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agaroseThermoFisher Scientific16500500
Wizard genomic DNA purification kitPromegaA1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentRoche06 365 809 001Lipid based transfection reagent

Referenties

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213(2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554(2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR genetische screensgepoolde CRISPR screensgenoomredigeringfunctionele genomicaguide RNA bibliothekenlentivirale transductieNext Generation Sequencinggene knockoutprecisie recall analyse
Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.