Methodenartikel

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

12 september 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Samenvatting

Een van de belangrijkste obstakels op het gebied van extracellulair blaasje (EV) onderzoek vandaag is het vermogen om gezuiverde EV preparaten in een virale infectie setting te bereiken. De gepresenteerde methode is bedoeld om EVs uit de buurt van virionen (d.w.z. HIV-1) te isoleren, waardoor een hogere efficiëntie en opbrengst mogelijk is in vergelijking met conventionele ultracentrifugingsmethoden. Ons protocol bevat drie stappen: EV neerslag, dichtheidsgradiënt scheiding en deeltjes opname. Downstream assays (d.w.z. Western Blot en PCR) kunnen direct na het vastleggen van deeltjes worden uitgevoerd. Deze methode is voordelig ten opzichte van andere isolatie methoden (d.w.z. ultracentrifugatie) omdat het gebruik van minimale start volumes mogelijk maakt. Bovendien is het gebruiksvriendelijker dan alternatieve EV-isolatie methoden waarvoor meerdere ultracentrifugingsstappen nodig zijn. De gepresenteerde methode is echter beperkt in de reikwijdte van functionele EV-testen, omdat het moeilijk is om ongeschonden EVs uit onze deeltjes te eldelen. Bovendien is deze methode afgestemd op een strikt op onderzoek gebaseerde instelling en zou deze niet commercieel levensvatbaar zijn.

Inleiding

Onderzoek gecentreerd rond extracellulaire blaasjes (Ev's), in het bijzonder exosomen, een type EV variërend van 30-120 nm en gekenmerkt door de aanwezigheid van drie tetraspanin markers CD81, CD9 en CD63, is grotendeels gevormd door de ontwikkeling van methoden om te isoleren en Reinig de blaasjes van belang. De mogelijkheid om veelzijdige mechanismen te ontleden is belemmerd vanwege complexe en tijdrovende technieken die monsters genereren die bestaan uit een heterogene populatie van blaasjes die via verschillende trajecten worden gegenereerd met een breed scala aan inhoud, maten en Dichtheden. Hoewel dit een probleem is voor bijna alle EV-onderzoek, is het van bijzonder belang bij het bestuderen van EVS in de context van virale infectie, omdat virionen en virusachtige deeltjes (vlp's) vergelijkbaar in diameter kunnen zijn voor de blaasjes van belang. Zo is het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) ongeveer 100 nm in diameter, wat ongeveer even groot is als vele soorten Ev's. Om deze reden hebben we een nieuwe EV-isolatie workflow ontworpen om deze problemen aan te pakken.

De huidige gouden standaard van EV-isolatie is ultracentrifugatie. Deze techniek maakt gebruik van de verschillende blaasje dichtheden, waardoor de blaasjes kunnen worden gescheiden door centrifugeren met differentiële sedimentatie van hogere dichtheids deeltjes versus lagere dichtheids deeltjes in elke fase 1,2. Er zijn verschillende stappen voor het centrifugeren van lage snelheid vereist om intacte cellen te verwijderen (300-400 x g gedurende 10 min), celresten (~ 2.000 x g gedurende 10 min) en apoptotische lichamen/grote blaasjes (~ 10.000 x g gedurende 10 min). Deze initiële zuiveringen worden gevolgd door ultrasnelle ultracentrifugatie (100000-200000 x g voor 1.5-2 h) aan sediment EVS. Wasstappen worden uitgevoerd om de zuiverheid van de EV verder te waarborgen, maar dit resulteert in de vermindering van het aantal geïsoleerde ev's, waardoor de totale opbrengst 3,4wordt verlaagd. Het nut van deze methode wordt verder beperkt door de eis van een groot aantal cellen (ongeveer 1 x 108) en een groot monstervolume (≫ 100 ml) om adequate resultaten te bereiken.

Om de toenemende bezorgdheid aan te pakken, is het neerslaan van blaasjes met hydrofiele polymeren de laatste jaren een nuttige techniek geworden. Polyethyleenglycol (PEG), of andere verwante precipitatie reagentia, stelt de gebruiker in staat om de vesicles, virussen en eiwitten-of proteïne-RNA-aggregaten binnen een monster te trekken door simpelweg het monster met het reagens naar keuze te inbroed, gevolgd door een enkele lage-snelheid centrifugeren1,2,5. We hebben eerder gemeld dat het gebruik van PEG of gerelateerde methoden om EVs te precipderen in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie resulteert in een significant hogere opbrengst6. Deze strategie is snel, eenvoudig, vereist geen extra dure apparatuur, is gemakkelijk schaalbaar en behoudt de EV-structuur. Vanwege de promiscue aard van deze methode bevatten de resulterende monsters een verscheidenheid aan producten, waaronder vrije eiwitten, eiwitcomplexen, een reeks Ev's en virionen, waardoor verdere zuivering nodig is om de gewenste populatie te verkrijgen1 ,2,7,8.

Om de heterogeniteit van de uit verschillende neerslag methoden verkregen EVs te overwinnen, wordt dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DG) gebruikt om deeltjes beter te scheiden op basis van hun dichtheid. Deze methode wordt uitgevoerd met behulp van een stapsgewijze helling met behulp van een dichtheidsgradiënt medium, zoals iodixanol of sucrose, die de scheiding van EVs van eiwitten, eiwitcomplexen en virus-of virusachtige deeltjes (Vlp's) mogelijk maakt. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel er ooit werd gedacht dat DG een preciezere scheiding van EV-subpopulaties toeliet, het nu bekend is dat maten en dichtheden van verschillende blaasjes elkaar kunnen overlappen. Exosomen zijn bijvoorbeeld gekend om flotatie dichtheden van 1,08-1.22 g/ml9te hebben, terwijl blaasjes geïsoleerd van de Golgi (Copi+ of clathrin+) een dichtheden van 1.05-1.12 g/ml en die van het endoplasmische reticulum (copii+ ) sediment bij 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Bovendien, indien men exosomale fracties wil vergelijken tegen fracties die virale deeltjes bevatten, kan dit, afhankelijk van de dichtheid van het virus van belang, moeilijker worden — er zijn andere virussen dan HIV-1 die waarschijnlijk op hetzelfde dichtheden als exosomale positieve fracties2.

Tot slot is de verrijking van EV-Preps voor downstreamvisualisatie en functionele assays van vitaal belang voor EV-onderzoek. Het gebruik van EV-verrijkende nanodeeltjes, met name multi-functionele hydrogelpartikels met een diameter van 700-800 nm, is een cruciale stap in het bereiken van geconcentreerde EV-Preps. Ze bezitten een aromatische aas met een hoge affiniteit die is ingekapseld door een poreuze buitenste zeef schaal om selectiviteit te bevorderen. De nanodeeltjes die in deze studie worden gebruikt, omvatten twee verschillende preparaten met verschillende kern loten (reactieve rode 120 NT80; en Cibacron blauw F3GA NT82) die hebben aangetoond dat de inname van EVs uit verschillende reagentia en biovloeistoffen toeneemt (Zie de tabel met materialen )6,10,11,12,13,14,15. De deeltjes bieden een eenvoudige verrijking van EVS uit talrijke uitgangsmaterialen, waaronder iodixanol-fracties, supernatant van de celcultuur, evenals biovloeistoffen van patiënten zoals plasma, serum, cerebrale spinale vloeistoffen (CSF) en urine6,13 .

De hier gepresenteerde methode verbetert de efficiëntie van de huidige EV-zuiverings technieken door verschillende technologieën te combineren; EV neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, en deeltjes opname, om de workflow te stroomlijnen, monster vereisten te verminderen en de opbrengst te verhogen om een meer homogene EV-sample te verkrijgen voor gebruik in alle EV-onderzoek. Deze methode is met name nuttig bij het onderzoek naar EVs en de inhoud ervan tijdens virale infectie, omdat het een filtratie stap van 0,22 μm bevat om grote, ongewenste blaasjes en Vlp's uit te sluiten en de totale EV-populatie te scheiden op basis van dichtheid om effectief Isoleer EVs uit virionen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. filtratie en precipitatie van extracellulaire blaasjes (Ev's)

  1. Ter voorbereiding van de kweek supernatant van besmette of getransformuteerde cellen (d.w.z. cellijnen en/of primaire cellen), kweek ongeveer 10 mL laat-log cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een geschikt kweekmedium (D.W.Z. RPMI of DMEM met 10% foetale runderen serum [FBS]).
    Opmerking: Alle reagentia voor kweekmedium moeten vrij zijn van EVs en kunnen ofwel worden aangekocht (Zie tabel met materialen) of in eigen huis worden bereid door pre-ultracentrifugatie van serum bij 100.000 x g gedurende 90 min. Dit protocol is succesvol geweest voor verschillende veelgebruikte cellijnen, waaronder: CEM, Jurkat, 293T, U937 (niet-geïnfecteerde lijnen), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 en HTLV-1 geïnfecteerde lijnen), meerdere getransfunteerde cellen en primaire myeloïde en T-cellen (beide geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde); Dit protocol kan echter worden gebruikt voor elk celtype, met inbegrip van die die gespecialiseerde media of cultuur voorwaarden vereisen. De dichtheid van cellen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen. Het wordt aanbevolen dat de hoogste dichtheid na 5 dagen met minimale celdood wordt gebruikt.
  2. Centrifugeer de kweek op 3.000 x g gedurende 5 minuten tot pellet cellen en gooi de pellet weg.
  3. Filtreer de kweek supernatant met een steriel 0,22 μm filter en verzamel filtraat in een schone buis.
  4. Voeg gelijk volume PEG precipitatie reagens (1:1 ratio) toe aan gefilterde supernatant. Inverteer buis meerdere malen om een homogeen mengsel te garanderen.
    Opmerking: Niet Vortex.
  5. Incubate mengsel bij 4 °C 's nachts (O/N).
  6. Centrifuge mengsel bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) om een HETEROGENE EV pellet te leveren.
    Opmerking: EV pellet moet wit of gebroken wit in kleur verschijnen.
  7. Gooi de verarmd cultuur supernatant weg.
  8. Rebreng de EV pellet in 150 – 300 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en blijf op ijs.

2. constructie van een dichtheidsgradiënt

  1. Meng jodixanol-dichtheidsgradiënt medium met 1x PBS om 11 verschillende dichtheids fracties van 1 mL te maken van 6 tot 18% iodixanol in stappen van 1,2% in afzonderlijke micro centrifugebuizen, zoals weergegeven in Figuur 1a.
  2. Vortex elke buis te mengen.
  3. Laag dichtheids fracties in een voorgereinigde en droge swingende emmer ultracentrifuge buis beginnend met breuk #18 en eindigend met breuk #6 zoals aangegeven in Figuur 1b.
    Opmerking: Alle buizen moeten worden gezuiverd met behulp van een 10% bleekmiddel spray gevolgd doorspoelen 3x met gedeïoniseerd water en een laatste wassen van steriel gedeïoniseerd water vóór het laden van de gradiënt fracties.
  4. Voeg geresuspendeerde EV pellet (300 μL) toe aan de bovenkant van de gelaagde gradiënt in de ultracentrifuge buis.
  5. Ultracentrifuge bij 100, 00 x g bij 4 °c gedurende 90 min.
  6. Verwijder voorzichtig de 1 mL fracties uit de ultracentrifuge buis en breng elke fractie over in nieuwe micro centrifugebuizen.

3. verrijking van de EV-fracties uUsing nanodeeltjes

  1. Maak een 30% slurry van nanodeeltjes met gelijke volumes NT80, NT82 en 1x PBS.
    Opmerking: Het mengsel moet voorafgaand aan het gebruik worden getexed om de homogeniteit te waarborgen.
  2. Voeg 30 μL van de slurry toe aan elke micro centrifugebuis met de dichtheids fracties en pipet/Inverteer ze meerdere malen om te mengen.
  3. Draai EV-verrijkende nanodeeltjes-bevattende dichtheids fractie micro centrifugebuizen O/N bij 4 °C bij ongeveer 20 TPM.
  4. Centrifugeer dichtheids fractie micro centrifugebuizen bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  5. Gooi de vloeistof weg en was EV pellet twee keer met 1x PBS.
    Opmerking: Nanodeeltjes pellets kunnen worden bevroren bij-20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor verschillende downstream testen (d.w.z. PCR, Western Blot, massaspectrometrie, en andere testen).

4. Aanbevolen bereiding van nanodeeltjes pellet voor downstream assays

  1. Voor RNA-isolatie
    1. Respendeer de pellet in 50 μL geautoclaveerd gedeïoniseerd water, behandeld met 0,001% diethylpyrocarbonaat (DEPC) gefilterd door een 0,2 μm filter en isolaat RNA volgens het Protocol van de fabrikant van de kit.
  2. Voor gel elektroforese
    1. Rebreng de pellet direct in 15 μL Laemmli buffer.
    2. Warmte monster 3x bij 95 °C gedurende 3 min. Vortex zachtjes en spin naar beneden tussen elke warmte cyclus.
    3. Centrifugeer het monster voor 15 sec. bij 20.000 x g en laad al het geeleerde materiaal direct op de gel.
      Opmerking: voor de beste resultaten, beperk de hoeveelheid deeltjes geladen op de gel en voer de gel op 100 V om ervoor te zorgen dat eventuele resterende deeltjes zijn opgenomen in de putten.
  3. Voor trypsine spijsvertering
    1. Respendeer de pellet in 20 μL ureum vóór alkylatie en trypsinoisatie van het monster. Nanodeeltjes kunnen worden gepelleteerd door een 14.000 x g centrifugeren bij RT gedurende 10 min. monster met de trypsinized peptide kan worden overgebracht in een schone opvang buis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PEG-neerslag verhoogt de EV-opbrengst
Onze combinatie benadering van EV-isolatie is aanzienlijk efficiënter in termen van EV-terugwinning in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie, zoals blijkt uit de reductie van 90% in het volume van het benodigde startmateriaal. Ultracentrifugatie, de huidige gouden standaard in EV-isolatie, vereist ongeveer 100 mL cultuur supernatant om een adequate EV-prep voor downstream-assays te produceren, terwijl ons nieuwe protocol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methode zorgt voor een verbeterde EV-opbrengst en de scheiding van het virus van EVs met behulp van een gecombineerde benadering van isolatie. Relatief grote hoeveelheden uitgangsmateriaal (d.w.z. celsupernatant) kunnen vóór de EV-isolatie worden gefilterd door precipitatie, DG scheiding en verrijking van nanodeeltjes, resulterend in een eindvolume van ~ 30 μL, waardoor direct gebruik in een verscheidenheid van downstream assays. Het gebruik van nanodeeltjes verrijking is essentieel omdat, in vergelijking m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

B.L. is aangesloten bij Ceres Nanosciences Inc. die reagentia en/of instrumenten produceert die in dit artikel worden gebruikt. Alle andere auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We willen alle leden van het Kashanchi Lab bedanken, vooral Gwen Cox. Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, en NS099029 aan F.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CEM CD4+ CellenNIH AIDS Reagent Program117CEM
DPBS zonder Ca en Mg (1x)Quality Biological114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1PEG precipitatiereagens
Exosomen-gedeplete FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Foetaal bovien serumPeak SerumPS-FB3Serum
HIV-1 geïnfecteerde U937 CellenNIH AIDS Reagent Program165U1
Nalgene Spritzfilter 0.2 µm SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Reactive Red 120 kern
Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA kern
Optima XE-980 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
OptiPrep Dichtheidsgradiënt MediumSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti Zwaaiende-emmer RotorBeckman Coulter331362
Ultra-Clear Buis, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059

Referenties

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Purificatie van extracellulaire blaasjesvirusseparatiePEG precipitatiedensiteitsgradi ntseparatieverrijking van nanodeeltjesultracentrifugatieprotocolWestern blot analysePCR detectieverhoging van de EV opbrengstHIV 1 contaminatie

Gerelateerde artikelen