Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60017

⸱

17 augustus 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Samenvatting

ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).

Inleiding

Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3,4. Leden van de myosin klassen spelen verschillende rollen in een zeer diverse set van aandoeningen, zoals verschillende kankers, neurologische aandoeningen, skelet myopathieën, en Hypertrofische cardiomyopathie5,6. Gezien het grote aantal fysiologische en pathologische functies van deze moleculaire motoren, het is niet verwonderlijk dat ze steeds meer worden erkend als drugs doelen voor een verscheidenheid van voorwaarden7. Er is recentelijk aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontdekking van nieuwe myosine-remmers8,9,10 en Activators11, en om de eigenschappen van bestaande te verbeteren12, 13 , 14 , 15.

De Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is al lange tijd gebruikt om de ATPase-activiteit van verschillende enzymen te meten, zoals de sarcoplasmorische reticulum CA2 + pomp ATPase16, de DNA-reparatie ATPase RAD5417, de AAA + ATPase P9718 of de microtubulus motor kinesin19. Bij de assay wordt een ATP-regeneratiecyclus gebruikt. De adenosine difosfaat (ADP) gegenereerd door de ATPase wordt geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK), die transformeert één molecule van fosfoenolpyruvate (PEP) pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH). Dat, op zijn beurt, oxiderende een molecuul van NADH naar NAD. Daarom is de afname van de NADH-concentratie als functie van de tijd gelijk aan de ATP-hydrolysesnelheid. De ATP-regeneratiecyclus houdt de ATP-concentratie bijna constant en de ADP-concentratie laag zolang PEP beschikbaar is. Dit resulteert in lineaire tijd cursussen, waardoor het eenvoudig is om de initiële reactiesnelheden te bepalen en helpt bij het voorkomen van product remming door ADP19. Hoewel de NADH-gekoppelde ATPase-assay al is aangepast aan een 96-well formaat20, maken de hoge reactievolumes (~ 150 μL) het relatief duur vanwege de hoge vraag van reagentia, waardoor het minder vatbaar is voor een snelle screening van grote aantallen Verbindingen. Alternatieve methoden, zoals de Malachiet groene assay19,21, die berust op de opsporing van het fosfaat dat wordt geproduceerd door het ATPase-enzym, bleken geschikter te zijn voor miniaturisatie en screening met hoge doorvoer22 , 23 , 24. een eindpunt test heeft echter meer kans om beïnvloed te worden door verschillende artefacten (hieronder besproken), die onontdekt kunnen blijven bij afwezigheid van voltijdse cursussen.

Hier is de NADH-gekoppelde ATPase-assay geoptimaliseerd voor de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecuul remmers. Skelet en cardiale spier myosine II en de myosin-remmers blebbistatine8, para-aminoblebbistatine13 en para-nitroblebbistatine12 worden gebruikt om de kracht van de test aan te tonen, die gebaseerd is op NADH fluorescentie als uitlezen. Dit protocol is vatbaar voor screening van projecten gericht op elke ADP-producerende enzymen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding van voorraadoplossingen en reagentia

  1. Bereid dithiotreïtol (DTT) stockoplossing door kristallijne DTT in gedestilleerd water op te lossen tot een eindconcentratie van 1000 mm. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  2. Bereid ATP-voorraadoplossing door het oplossen van kristallijne ATP in gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  3. Bereid 10x NADH buffer met 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, n ′, n′-tetraazijnzuur (EGTA), en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C.
  4. Bereid 1x myosin buffer met 10 mM MOPS en 0,1 mM EGTA. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg bovine serumalbumine (BSA) en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.
  5. Bereid 1x actine buffer met 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg BSA en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.
  6. Bereid NADH stockoplossing door het oplossen van kristallijne NADH in 10x NADH buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5,5 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  7. Bereid PEP-voorraadoplossing voor door kristallijne PEP in 10x NADH-buffer op te lossen tot een eindconcentratie van 50 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  8. Bereid LDH-voorraadoplossing door gelyofiliseerd LDH-poeder op te lossen in een mengsel van glycerol en 10x NADH-buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 2000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  9. Bereid de PK stockoplossing door het oplossen van gelyofiliseerd PK poeder in een mengsel van glycerol en 10x NADH buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 10000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  10. Reconstitueer de gelyofiliseerd cardiale en skeletspier myosin II monsters door toevoeging van 100 μL gedestilleerd water voor het verkrijgen van 10 mg/ml stamoplossingen overeenkomend met ~ 37,9 μm en ~ 40,8 μM myosine concentraties (monomere), respectievelijk. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
  11. Bereid F-actin van konijnen spier aceton poeder zoals beschreven door Pardee en Spudich25.

2. meten van ATPase-activiteiten en remmende effecten van kleine molecuul remmers

  1. Maak een samengestelde plaat.
    1. Los verbindingen van belang in kwalitatief hoogwaardig dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Maak vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO.
    3. Breng de monsters over in een 384-goed polypropyleen plaat in drievaten (12,5 μL elk) met behulp van een meerkanaals pipet. Gebruik twee rijen op de samengestelde plaat voor één samengestelde (in plaats van drie kolommen) om het aantal putten mogelijk beïnvloed door de randeffecten te minimaliseren. Gebruik de laatste drie putjes in de tweede rij voor elke verbinding als negatieve controle (alleen DMSO). Gebruik de eerste en laatste rij op de plaat niet voor samengestelde verdunningen.
    4. Breng pure DMSO over naar de putjes van de eerste rij (gereserveerd voor NADH kalibratie).
    5. Gebruik de laatste rij voor positieve controle.
      Opmerking: para-aminoblebbistatin bij een concentratie van 4 mm in DMSO werd hier gebruikt.
  2. Bereid 4500 μL van 20 μM verdunde actine oplossing voor elke test plaat (384-well Black-Wall polystyreen microplaat) door het verdunnen van de actine stockoplossing in de actine buffer. Meng de oplossing grondig door het pipetteren op en neer 30x met behulp van een 5 mL pipet om viscositeit en heterogeniteit te verminderen door het breken van actine filamenten. Centrifugeer de oplossing om eventueel neergeprecipiteerd eiwit aanwezig te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis.
  3. Bereid de Master mix met LDH en PK enzymen ("enzym mix"). Combineer voor elke test plaat 171,4 μL LDH-oplossing, 171,4 μL PK-oplossing en 3189,3 μL of 3252,9 μL myosine-buffer voor assays waarbij respectievelijk cardiale of skeletspier myosine II wordt gecombineerd in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg geen myosin op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.
  4. Bereid de Master mix met alle ondergronden ("substraat mix"). Combineer voor elke plaat 162,1 μL ATP, 162,1 μL PEP en 324,1 μL NADH-oplossing in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg actine niet toe op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.
  5. Maak zeven stappen seriële 1:2 verdunningen van NADH voor kalibratie vanaf 250 μM.
    1. Meng 12,3 μL NADH stockoplossing met 257,7 μL myosin buffer in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
    2. Aliquot 135 μL myosin buffer in zeven 1,5 mL micro centrifugebuizen.
    3. Breng 135 μL oplossing van de eerste buis naar de tweede en meng door pipetteren. Herhaal dit tot de 7-ste buis is bereikt.
    4. Gebruik de laatste buis als no-NADH Control (alleen buffer).
  6. Gebruik een pipet met 8 kanalen en breng 20 μL van de NADH-kalibratieoplossingen over in de eerste rij van de test plaat in triplicaten.
  7. Voeg 68 μL cardiale of 4,2 μL skeletspier myosine II toe aan het enzym mengsel. Vortex kort.
  8. Met uitzondering van de eerste rij, Doseer met behulp van een geautomatiseerde dispenser 8,4 μL van de bereide myosin-enzym mix in elke put van de test plaat.
  9. Breng 100 nL van oplossingen van de samengestelde plaat naar de test plaat met enzym mengsel met behulp van een geautomatiseerd vloeistof behandelingssysteem uitgerust met een 100 nL PIN gereedschaps hoofd.
  10. Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.
  11. Voeg 4.052 μL van de gecentrifugeerde actine-oplossing toe aan de substraat combinatie. Vortex kort.
  12. Verdeel 11,6 μL van de actin-substraat mix in elke put van de test plaat (behalve de eerste rij) om de enzymatische reactie te starten met behulp van een geautomatiseerde dispenser.
  13. Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.
  14. Centrifugeer de test plaat bij 101 x g gedurende 30 sec.
  15. Zorg ervoor dat de binnentemperatuur van de plaat lezer is gestabiliseerd bij 25 °C. Laad de plaat en schud voor nog eens 30 sec. Deze schud stap is nodig om de vorm van het vloeibare oppervlak in elke put vergelijkbaar te maken en zorgt ervoor dat de plaat de meettemperatuur kan bereiken.
  16. Record NADH fluorescentie gedurende 30 min het scannen van de plaat in 45 s intervallen. Gebruik een 380 nm, 10 nm bandbreedte excitatie filter en een 470 nm, 24 nm bandbreedte-emissie filter in combinatie met een 425 nm cut-off dichroïde spiegel. Voer de meting uit in de hoge-concentratie modus. Optimaliseer het aantal flitsen, de gain van de detector, de afmetingen van de plaat en de meet hoogte voordat u de assays uitvoert.
    Opmerking: de uiteindelijke testcondities zijn 300 nM cardiale/20 nM skeletspieren myosine II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP in een buffer met 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO en 1 mM DTT. Het totale volume is 20 μL/goed. De hoogste uiteindelijke samengestelde concentratie is 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatine in 0,5% DMSO dient als de positieve controle en 0,5% DMSO alleen is de negatieve controle. Alle metingen worden uitgevoerd in triplicaten.

3. gegevens analyseren

  1. Plot de waargenomen fluorescentie intensiteit tegen de tijd voor elke put.
  2. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de fluorescentie reacties voor elke put te bepalen. De helling is evenredig met de consumptie snelheid van ATP (NADH), terwijl het snijpunt evenredig is aan de NADH-concentratie aan het begin van de meting (t = 0 s).
  3. Bouw een ijkcurve voor NADH door het aftekenen te plotten verkregen voor de eerste rij van de plaat tegen de concentratie van NADH. Zorg ervoor dat de onderschept lineair afhankelijk zijn van de NADH-concentratie.
    Opmerking: de onderschept schatten de reële fluorescentie intensiteiten bij t = 0 s met veel meer vertrouwen dan het gemiddelde van de intensiteit van de ruwe fluorescentie op t ≈ 0 s.
  4. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de NADH kalibratie lijn te verkrijgen.
    Opmerking: het snijpunt beschrijft het fluorescentie-achtergrond signaal (geen NADH aanwezig), terwijl de helling overeenkomt met de geëxtregeerde/theoretische fluorescentie intensiteit van een 1 M NADH-oplossing in dat specifieke experiment.
  5. Verdeel de helling van de fluorescentie respons verkregen voor de rest van de putjes door de helling van de NADH kalibratie lijn om fluorescentie veranderingen te converteren naar ATP verbruikspercentages.
  6. Plot de ATP-verbruikspercentages tegen de concentratie van de remmer.
  7. Om remmende constanten te bepalen, moet u de juiste statistische software gebruiken om de dosis-responsgegevens aan te passen aan de volgende kwadratische vergelijking die overeenkomt met een eenvoudig één-op-één bindend evenwichtsmodel:
    figure-protocol-1
    waarbij y het ATP verbruikspercentage is, ymin het ATP verbruiks tarief int de afwezigheid van remmer, ymax is het theoretische ATP verbruikspercentage bij 100% remming, KI is de remmende constante , [E]t en [I]t zijn de totale concentratie van het enzym (myosin) en inhibitor, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De standaardkaart voor screening-experimenten wordt weergegeven in Figuur 1. De eerste en laatste rij zijn gereserveerd voor NADH kalibratie en positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine, 0,5% DMSO), respectievelijk. De resterende rijen (B naar O) worden gebruikt om de remmende activiteit van verbindingen te testen. Hier worden vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO bereid en overgebracht van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen in het Protocol

Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van "niet-bindende" platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minima...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3575
ATP (Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzouthydraat)SigmaA7699
Aurora FRD-IB DispenserAurora Discovery, Inc.00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratorium Automatisering WorkstationBeckman CoulterA31841
BlebbistatinAMRIN/ACustom synthese
BSA (Bovine Serum Albumine, Protease-Vrij)Akron BiotechAK1391 
Centrifuge 5430 R, gekoeld, met Rotor FA-35-6-30Eppendorf022620663
Centrifuge 5430, niet gekoeld, met Rotor A-2-MTPEppendorf022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SigmaD2650
DTT (DL-Dithiothreitol) SigmaD5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-formaat; 8-kanaalsThermo Scientific4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-formaat; 8-kanaalsThermo Scientific4672080
EGTA (Ethyleen glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur) SigmaE3889
EnVision 2104 Multilabel Plate ReaderPerkinElmer2104-0010
Glycerol SigmaG2025
LDH (L-Lactaatdehydrogenase uit konijnenspier)SigmaL1254
MgCl2.6H2O (Magnesiumchloride hexahydraat) SigmaM2670
Microplate ShakerVWR  12620-926 
Microplate, 384 well, PP, klein volume, diep wel, natuurlijkGreiner Bio-One784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propaansulfonzuur) SigmaM1254
Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Rund hartspier)Cytoskeleton MY03
Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Konijnenskeletspier)Cytoskeleton MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, gereduceerd dinatriumzouthydraat)SigmaN8129
NaN3 (Natriumazied) Sigma71289
NaOH (Natriumhydroxide) SigmaS8045
Optische Filter CFP 470/24nm (Emissie)PerkinElmer2100-5850Barcode 240
Optische Filter Fura2 380/10nm (Excitatie)PerkinElmer2100-5390Barcode 112
Optisch Module: Beta LactamasePerkinElmer2100-4270Barcode 418
OriginPro 2017 softwareOriginLabN/A
para-AminoblebbistatinAMRIN/ACustom synthese
para-NitroblebbistatinAMRIN/ACustom synthese
PEP (Fosfo(enol)pyruvaat monokaliumzout)SigmaP7127
PK (Pyruaat Kinase uit konijnenspier)SigmaP9136
Konijnenspier Aceton PoederPel Freez Biologicals41995-2

Referenties

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141(2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305(2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

NADH koppelingMyosine II screeningseri le verdunningfluorescentiedetectieplaatlezervloeistofbehandelingkalibratiecurvedosis respons
Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.