A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).
Inleiding
Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van voorraadoplossingen en reagentia
- Bereid dithiotreïtol (DTT) stockoplossing door kristallijne DTT in gedestilleerd water op te lossen tot een eindconcentratie van 1000 mm. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
- Bereid ATP-voorraadoplossing door het oplossen van kristallijne ATP in gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
- Bereid 10x NADH buffer met 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, n ′, n′-tetraazijnzu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De standaardkaart voor screening-experimenten wordt weergegeven in Figuur 1. De eerste en laatste rij zijn gereserveerd voor NADH kalibratie en positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine, 0,5% DMSO), respectievelijk. De resterende rijen (B naar O) worden gebruikt om de remmende activiteit van verbindingen te testen. Hier worden vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO bereid en overgebracht van d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het Protocol
Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van "niet-bindende" platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minima.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzouthydraat) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratorium Automatisering Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthese |
| BSA (Bovine Serum Albumine, Protease-Vrij) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, gekoeld, met Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, niet gekoeld, met Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-formaat; 8-kanaals | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-formaat; 8-kanaals | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethyleen glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactaatdehydrogenase uit konijnenspier) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesiumchloride hexahydraat) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, klein volume, diep wel, natuurlijk | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propaansulfonzuur) | Sigma | M1254 | |
| Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Rund hartspier) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Konijnenskeletspier) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, gereduceerd dinatriumzouthydraat) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Natriumazied) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Natriumhydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optische Filter CFP 470/24nm (Emissie) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optische Filter Fura2 380/10nm (Excitatie) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optisch Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthese |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthese |
| PEP (Fosfo(enol)pyruvaat monokaliumzout) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruaat Kinase uit konijnenspier) | Sigma | P9136 | |
| Konijnenspier Aceton Poeder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
Referenties
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Po....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
