Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een muismodel van door salmonella gedreven intestinale fibrose dat lijkt op belangrijke pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn, waaronder Transmurale ontsteking en fibrose. Deze methode kan worden gebruikt om gastheerfactoren te evalueren die fibrotische uitkomsten veranderen met Mutant muizen gehandhaafd op een C57Bl/6 genetische achtergrond.

Samenvatting

Weefsel fibrose gekenmerkt door de pathologische accumulatie van extracellulaire matrix zoals collageen is het resultaat van aanhoudende ontsteking en disgereguleerde reparatie. In inflammatoire darmziekte (IBD), fibrose leidt tot terugkerende strictuur formaties waarvoor er geen effectieve therapie anders dan chirurgische resectie. Door zijn late aanvang zijn de processen die fibrose aandrijden minder bestudeerd en grotendeels onbekend. Daarom vormen fibrotische complicaties een grote uitdaging in IBD. In dit protocol wordt een robuust in vivo model van intestinale fibrose beschreven waarbij de pre-behandeling van streptomycine van C57Bl/6 muizen gevolgd door orale maagsonde met vaccin kwaliteit salmonella typhimurium δaroa Mutant leidt tot aanhoudende pathogenen kolonisatie en fibrose van de blindedarm. Methoden voor de voorbereiding van S. Typhimurium ΔAroA voor het inenten, kwantificeren van pathogenen in de blindedarm en milt, en het evalueren van de collageen afzetting in intestinale weefsels worden uitgelegd. Dit experimentele ziekte model is nuttig voor het onderzoeken van gastheerfactoren die CD-achtige intestinale fibrose verbeteren of verergeren.

Inleiding

Colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (cd) zijn de twee belangrijkste vormen van IBD en worden gekenmerkt als chronische en relapsing inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal ^1,2. Deze aandoeningen hebben een grote invloed op de kwaliteit van leven van patiënten. Symptomen van IBD omvatten abdominale pijn, diarree, misselijkheid, verlies van het gewicht, koorts, en vermoeidheid³. Recente studies hebben genetische en omgevingsfactoren geïdentificeerd die bijdragen aan pathogenese van ziekten; Er wordt gedacht dat dergelijke risicofactoren bijdragen tot de verstoring van de epitheliale barrière die resulteert in de translocatie of oversampling van luminal antigenen⁴. Als gevolg daarvan initieert dit een afwijkende ontstekingsreactie op de commensaal flora gemedieerd door intestinale immuuncellen⁴. Kenmerken van IBD-geassocieerde complicaties kunnen zich uitstrekken tot plaatsen buiten het GI-tractus die verschillende organen, met inbegrip van gewrichten, huid, en lever^1,2. Kenmerken van UC omvatten ernstige en diffuse ontsteking meestal gelokaliseerd in de dikke darm¹. Ziekte pathologie beïnvloedt de mucosa en het de van de darm resulterend in oppervlakkige mucosale ulceraties¹. Daarentegen kan CD elk deel van het GI-tractus beïnvloeden, hoewel bewijs van ziekte vaak wordt aangetroffen in de dikke darm en distale ileum². Bovendien, de ontsteking in de CD is transmural, invloed op alle lagen van de darmwand².

Verschillende IBD-gevoeligheids genen die zijn geïdentificeerd, duiden erop dat disregulatie van de epitheliale barrière of immuniteit essentieel is voor ziekteprogressie⁵. Mutaties in nucleotide oligomerisatie domein 2 (NOD2), uitgedrukt door monocyten, bleken geassocieerd te zijn met verhoogde gevoeligheid voor CD; Dit wijst op een verband tussen veranderde aangeboren immuundetectie van bacteriële componenten en de ziekte⁶. Meer recente genoom-brede associatie studies (GWAS) hebben aanvullende trajecten onthuld die mogelijk betrokken zijn bij de pathogenese van IBD, waaronder genetische variaties in: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R afhankelijke trajecten gekoppeld aan adaptieve immuniteit, MUC1, MUC19en PTGER4 bij onderhoud van de intestinale barrière en ATG16Lgemedieerde autophagy^7,8,9. Terwijl deze populatie gebaseerde genetica studies hebben ons begrip van IBD verbeterd, gevoeligheid allelen alleen zijn waarschijnlijk onvoldoende bij het initiëren en het ondersteunen van chronische ziekte³. Andere niet-genetische factoren, met inbegrip van wijzigingen in de samenstelling van de darm-microbiome en een afname van de diversiteit zijn in verband gebracht met intestinale ontsteking. Echter, het is onduidelijk of gut dysbiosis voorafgaat aan of is het gevolg van disgereguleerde immuunresponsen³. Hoewel de etiologie van IBD onduidelijk blijft, is ons begrip van de pathogenese van de ziekte verbeterd door experimentele Muismodellen van darmontsteking^10,11. Deze modellen vertegenwoordigen individueel niet volledig de complexiteit van de ziekte van de mens, maar ze zijn waardevol voor het verhelderende pathophysiologische trajecten die relevant kunnen zijn voor IBD en voor de validering van voorlopige therapeutische strategieën^{10, 11}. Dergelijke Muismodellen zijn meestal afhankelijk van de initiatie van ontsteking door chemische inductie of infectie, immuunceloverdracht of genetische manipulatie. Bovendien, deze strategieën omvatten vaak verstoringen in de epitheliale integriteit of modulatie van aangeboren of adaptieve immuniteit.

Salmonella heliobacter variëteiten zijn intestinale pathogenen die mensen en muizen kunnen infecteren. Na inname kan salmonella de darm koloniseren door directe invasie van Epitheelaan, M-cellen of antigeen die cellen¹²presenteren. Muizen besmet mondeling met S. Typhimurium resulteert in de kolonisatie voornamelijk van systemische sites zoals de milt en mesenterische lymfeklieren met een relatief lage overvloed in de GI Tract¹². Echter, voor behandeling van muizen met streptomycine verhoogt de efficiëntie van salmonella kolonisatie van de darm door het verminderen van de gastheer beschermende effecten van de normale microbiota¹³. Pathologische kenmerken van dit model zijn de verstoring of ulceratie van de epitheliale barrière, granulocyt rekrutering en ernstig oedeem¹³. Als alternatief, infectie met het vaccin grade S. Typhimurium ΔAroA Mutant leidt tot chronische kolonisatie van de blindedarm en Colon die tot dag 40 na infectie¹⁴blijft. De S. Tyhimurium ΔAroA stam heeft een defect in de biosynthese van aromatische aminozuren; Dit maakt de Mutante stam Avirulente en kan worden gebruikt als een zeer effectief vaccin¹⁵. Orale infectie bij muizen leidt tot een Th17-cytokine geassocieerde ontstekingsreactie, uitgebreide weefsel remodellering en collageen depositie. Weefsel pathologie wordt geassocieerd met verhoogde niveaus van Pro-fibrotische factor zoals TGF-β1, CTGF, en IGF¹⁴. De Transmurale fibrotische littekenvorming die in dit model wordt gerapporteerd, doet denken aan strictuur formaties die vaak in IBD worden waargenomen. De inductie van fibrose door salmonella vereist virulentie gecodeerd door salmonella pathogeniciteitseilanden (SPI)-1 en 2 ¹². Belangrijk is dat dit S. Tymphimurium ΔAroA infectie model is een nuttig systeem voor de studie van fibrotische reacties in Mutante muizen onderhouden op een C57/Bl6 achtergrond. De C57/Bl6-stam is extreem gevoelig voor S. Typhiumurim SL1344 infectie als gevolg van een verlies-van-functie-Mutatie in het gen coderen van de natuurlijke resistentie-geassocieerde macrofaag eiwit (nramp)-1^16,17. We hebben geconstateerd dat IL-17A en RORα-afhankelijke aangeboren lymfoïde cellen belangrijke bijdragers zijn aan pathogenese in dit model¹⁸.

Een belangrijke complicatie van cd is de disgereguleerde en overmatige depositie van extracellulaire matrix (ECM), inclusief collageen^2,19. Hoewel de GI tractus een relatief hoge capaciteit voor regeneratie heeft, fibrotische littekens kan ontstaan als gevolg van onopgeloste wondgenezing reacties die worden geassocieerd met chronische en ernstige ontsteking^20,21. In CD, dit resulteert in schadelijke effecten op weefsel architectuur leidt tot significante orgaanstoornis^21,22. De Transmurale aard van de ontsteking waargenomen in CD uiteindelijk voorafgaat aan de verdikking van de darmwand geassocieerd met symptomatische stenose of strictuur vorming²¹. Ongeveer een derde van de CD-patiënten vereisen intestinale resectie voor deze complicatie²². Er zijn geen effectieve anti-fibrotische therapieën in IBD, aangezien het gebruik van immunosuppressiva zoals Azathioprine of anti-tnfα-Biologics geen invloed heeft of slechts bescheiden de eis van chirurgische ingrepen heeft verlaagd^19,23 . Terwijl fibrose wordt beschouwd als het gevolg van chronische ontsteking, cellen van mesenchymale oorsprong zoals fibroblasten en pericytes worden verondersteld te zijn de primaire cellulaire bronnen van ecm in fibrotische littekens^21,24. Chronische S. Typhimurium ΔAroA-infectie is een robuust muismodel van intestinale fibrose dat inzicht kan bieden in de pathogenese van CD-achtige functies.

Protocol

Alle dier protocollen werden goedgekeurd door het Dierenzorg Comité van de University of British Columbia.

1. bereiding van salmonella typhimurium δaroa-culturen voor orale maagsonde van muizen

1. Uit een bevroren glycerol kolf van S. Typhimurium δaroa, bereid een streep plaat met behulp van LB agar bevattende 100 μg/ml streptomycine met een steriele enten lus. Inincuberen 's nachts bij 37 °C. Streak-platen kunnen tot een week worden bewaard bij 4 °C.
2. Een dag voorafgaand aan de infectie, bereiden antibioticum door het oplossen van 0,5 g van streptomycine in 2,5 mL water. Na filter steriliseren streptomycine oplossing, oraal een maagsonde de muizen met behulp van een lamp getipt 22G maagsonde naald en 1 mL spuit met 100 μL streptomycine oplossing (20 mg streptomycine/dosis). Gebruik een inoculerende lus, inoculeren 3 mL LB Bouillon (50 μg/mL streptomycine) in een cultuur buis met een enkele kolonie. Incuberen de salmonella cultuur aëroob bij 37 °c 's nachts met schudden bij 200 rpm.
3. Op de dag van de infectie, de uiteindelijke infectie dosis voorbereiden door het uitvoeren van 2 opeenvolgende 1/10 verdunningen van nachtelijke salmonella culturen in steriele PBS. Dit zou resulteren in een entmateriaal van 100 μL dat ongeveer 3 x 10⁶ kve bevat.
4. Gebruik een met een lamp getipt 22g maagsonde naald en een spuit van 1 ml om elke muis te maagsonde met 100 μL van de geprepareerde salmonella.
   Let op: bereid salmonella culturen met aseptische technieken. De uiteindelijke inoculatie concentratie van salmonella kan worden geverifieerd door seriële verdunningen op LB agar met streptomycine te beplating. De S. typhimurium ΔAroA stam kan worden verkregen door contact op te nemen met professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).

2. beoordeling van de salmonella lasten in weefsels

1. Bereid 2 mL Safe-lock, ronde bodemmicro buisjes met 1 mL steriel PBS en een geautoclaveerd RVS kraal. Weeg de buisjes vóór de weefsel inzameling af.
2. Resect cecal en milt weefsels van muizen die werden geëerd door blootstelling aan kooldioxide. Verzamel weefsel van individuele dieren in afzonderlijke buisjes. Weeg de buizen af om de weefsel gewichten te bepalen.
3. Homogeniseren met behulp van een mixer molen apparaat gedurende 15 minuten bij 30 Hz. Breng 900 μL PBS per put over in een 96-well 2 mL megablock. Pipetteer 100 μL weefsel homogenieert in de eerste put, meng goed en voer seriële verdunningen uit door 100 μL toe te voegen aan de volgende putjes totdat een 10^-6 verdunning wordt verkregen. Plaat 10 μL van elke verdunning in triplicaten op LB agar bevattende 100 μg/mL streptomcyin.
4. Tel en vermenigvuldig de gemiddelde kve met een factor 100 sinds 10 μL van het monster van 1000 μL is geplateerd en de juiste verdunningsfactor. Verdeel het weefsel gewicht totaal CFU door weefsel gewichten om kve per gram weefsel te bepalen.
   Opmerking: Houd alle monsters op het ijs of bij 4 °C tijdens de weefsel verwerking. Pipetpunten met brede opening gebruiken bij het uitvoeren van seriële verdunningen met weefselhomogenaten. Bereid de 96-well megablock met PBS op voorhand.

3. picrosirius rode kleuring en kwantificering van collageen.

1. Los cecal weefsels 's nachts op in 10% gebufferde formaline en bereid je voor op paraffine insluiten. Snijd 5-μm secties voor Picrosirius rode kleuring zoals eerder beschreven²⁵.
2. Leg samengestelde beelden van hele cecal-dwarsdoorsneden op een brightfield-Microscoop vast.
3. Open Fiji (ImageJ) en sleep het. TIF-afbeeldingsbestand naar de werkbalk.
4. Selecteer op de menubalk afbeelding ≫ Type > RGB-stapel om de afbeelding te splitsen in rode, groene en blauwe kanalen. Schuif de horizontale balk onder in het deelvenster om het kanaal in te stellen op groen.
5. Open afbeelding ≫ pas ≫ Threshold tool aan . Pas de minimum-en maximumlimieten aan om achtergrond signalen te elimineren. Zodra de gewenste drempelwaarde is ingesteld, sluit u het gereedschap drempel en gaat u naar analyseren ≫ metingen instellen. Controleer het gebied, de gebieds breuk, de limiet voor de drempel en het weergavelabel.
6. Poort de weefsel sectie met ofwel FreeHand selecties of veelhoek selecties gereedschap en meet de% gebied positief voor collageen door te klikken op analyseren > maatregel.
7. Normaliseer het absolute gebied positief voor collageen kleuring op weefselgebied.
   Opmerking: Fiji (ImageJ) is een open-source programma dat kan worden gedownload op https://fiji.sc. Afbeeldingen met dezelfde opnameomstandigheden (d.w.z. helderheid en focus) moeten identieke grenswaarden hebben voor nauwkeurige kwantificering. Als er achtergrondkleuring binnen het geselecteerde weefsel is, meet u het absolute gebied en trekt u het af van het gebied dat positief is voor collageen uit het hele weefsel.

Resultaten

Streptomycine behandeling gevolgd door orale infectie met S. Typhimurium ΔAroA leidt tot robuuste intestinale ontsteking en fibrose, vooral in de blindedarm (Figuur 1). Typische pathogeen lasten van 10⁸ tot 10⁹ kve per 1 g blindedarm en 10⁴ kve per 1 g milt kunnen worden teruggewonnen uit besmette dieren (Figuur 2). Beoordeling van fibrose in picrosirius rood gekleurd gekleurde cecal-secties duiden op piek fibrose 21 dag...

Discussie

Ons begrip van de pathogenese van IBD is sterk verbeterd door Muismodellen van darmontsteking. Hoewel dergelijke individuele modellen niet alle kenmerken van de complexe en multifactoriële menselijke ziekte recapituleren, ze zijn nuttig bij het identificeren van de belangrijkste kenmerken van ziekteprogressie. Fibrotische stricturen geassocieerd met IBD blijven een belangrijke onvervulde klinische behoefte, aangezien de huidige behandelingen niet effectief zijn bij het omkeren van de ziekte ontwikkeling. Bovendien is int...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Roestvrijstalen kralen	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock platen	Sarstedt	82.1972.002
Gavage naalden	FST	18061-22
Streptomycinesulfaat	Sigma	S9137
Mixermolen	Retsch	MM