Murine chirurgische model van actuele elastase geïnduceerde dalende thoracale aorta aneurysma

Samenvatting

We beschrijven een chirurgisch protocol voor het consequent induceren van robuuste aflopend thoracische aorta aneurysma bij muizen. De procedure omvat linker Thoracotomie, thoracische aorta blootstelling, en plaatsing van een spons gedrenkt in varkens alvleesklier elastase op de aorta wand.

Samenvatting

Volgens het centrum voor ziektecontrole, aorta aneurysma (AAs) werden beschouwd als een leidende doodsoorzaak in alle rassen en beide geslachten van 1999-2016. Een aneurysma vormt een gevolg van progressieve verzwakking en uiteindelijke verwijding van de aorta, die kan scheuren of scheuren zodra het een kritische diameter bereikt. Aneurysmata van de afdalende aorta in de borst, genaamd dalende thoracale aorta aneurysmata (dtaa), vormen een groot deel van de aneurysma gevallen in de Verenigde Staten. Onopgenomen dTAA ruptuur is bijna universeel dodelijk, en electieve reparatie heeft een hoge mate van morbiditeit en sterfte. Het doel van ons model is om dTAA specifiek te bestuderen, om de pathofysiologie van dTAA te verhelseren en om moleculaire doelen te zoeken om de groei te stoppen of de grootte van dTAA te verkleinen. Door een Murine model te hebben om thoracische pathologie nauwkeurig te bestuderen, kunnen gerichte therapieën worden ontwikkeld om specifiek dTAA te testen. De methode is gebaseerd op de plaatsing van de varkens alvleesklier elastase (PPE) direct op de buitenste muriene aorta wand na chirurgische blootstelling. Dit creëert een destructieve en inflammatoire reactie, die de aorta wand verzwakt en zorgt voor aneurysma vorming gedurende weken tot maanden. Hoewel Murine-modellen beperkingen hebben, produceert ons dTAA-model robuuste aneurysmata van voorspelbare grootte. Bovendien kan dit model worden gebruikt om genetische en farmaceutische doelstellingen te testen die de groei van dTAA kunnen arresteren of ruptuur voorkomen. Bij menselijke patiënten zouden interventies zoals deze kunnen helpen voorkomen dat aneurysmaruptuur, en moeilijke chirurgische interventie.

Inleiding

Het doel van deze methode is het bestuderen van de ontwikkeling, pathofysiologie, en structurele veranderingen in de Murine dalende thoracale aorta tijdens aorta aneurysma vorming. Ons model biedt een reproduceerbare en consistente methode om thoracische aorta aneurysma (dTAA) in muizen te induceren, waardoor het testen van verschillende genetische en farmacologische remmers mogelijk is. Dit werk kan helpen bij het identificeren van geneesmiddelen en gentherapieën die kunnen worden vertaald naar een levensvatbare behandelingsstrategie voor mensen met dTAA-ziekte.

dtaas vorm wanneer de wand van de thoracale aorta wordt verzwakt en verwijde na verloop van tijd tot het bereiken van een kritische diameter wanneer scheuren of ruptuur kan dan optreden. Klinisch kan dTAA in stilte vooruitgang boeken, in omvang toenemen totdat de structuur van de aorta wand zo vervormd is dat het uiteindelijk faalt, met catastrofale gevolgen. De symptomen ontwikkelen zich meestal alleen wanneer het aneurysma een gevaarlijke omvang heeft bereikt (100-150% verwijding) en een hoog risico op dissectie of ruptuur^1,2. dtaa ruptuur is bijna universeel dodelijk³, en electieve chirurgische reparatie draagt significante morbiditeit^4,5. Bovendien, de meeste patiënten dragen de diagnose van een aorta aneurysma voor ongeveer 5 jaar voor chirurgische reparatie^6,7. Dit venster geeft een geschikt moment om niet-chirurgisch in te grijpen. Dus, medische therapieën voor de behandeling of trage progressie van dTAA zijn nodig en zou een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van aneurysma onderzoek vertegenwoordigen. Er zijn momenteel geen medische behandelingen voor dTAA beschikbaar, vooral vanwege een onvolledig begrip van dTAA-pathogenese.

In de afgelopen 20 jaar zijn verschillende dTAA diermodellen ontwikkeld, maar elk van deze modellen waren verschillend van onze eigen en niet produceren robuuste aneurysma. Het meest vergelijkbare Murine dTAA-model is ontwikkeld door Ikonomidis et al.⁸, met directe toepassing van CACL₂ op de adventitia van de aorta. Hoewel ons model is aangepast aan veel van de technieken die door Ikonomidis zijn uiteengezet, is ons model op drie verschillende manieren uniek. Ten eerste, in ons model de aorta wordt blootgesteld aan actuele elastase voor 3-5 minuten, in vergelijking met 15 minuten van CaCl₂ blootstelling. Ten tweede, aorta dilatatie treedt op in 2 weken, in vergelijking met 16 weken in de CaCl₂ model. Ten slotte produceert ons model consequent aneurysmata van ongeveer 100% dilatatie, in vergelijking met de aorta dilataties van 20-30% geproduceerd door CaCl₂ -toepassing (die niet echt als aneurysmata kan worden beschouwd omdat ze worden gedefinieerd als een toename in aorta diameter > 50%). Er zijn andere niet-chirurgische Murine modellen van aneurysma vorming, zoals de APO E knock-out muis, die robuuste aneurysmata vormen met infusie van angiotensine II. Echter, deze muizen ontwikkelen supra-nier of stijgende thoracale aorta aneurysma in plaats van aneurysma specifiek in de dalende thoracale aorta^9,10.

Het rationele voor dit protocol is om een eenvoudige, goedkope en tijd geschikte manier te hebben om dTAA in een muriene model te bestuderen. Het muismodel biedt een unieke kans om veel genetische en celspecifieke Knockouts te gebruiken die zijn gevonden om impactvol te zijn in andere vasculaire ziekten. Het gebruik van onze specifieke taa model is goed ontvangen en experimenten met behulp van het zijn gepubliceerd in hoge impact tijdschriften^11,12. Op dit punt, het model is gebruikt voor het onderzoeken van mogelijke genetische en farmacologische behandelingen die een significant effect in de abdominale aorta aneurysma (AAA) Murine modellen had; echter, als ons lab heeft uitgebreid gebruik van de dTAA model, we zijn het vinden van doelen die uniek zijn voor dTAA formatie die kan worden gebruikt als gerichte therapieën bij de mens.

Dit model is het meest geschikt voor laboratoria die Murine micro-chirurgische capaciteiten hebben. Hoewel het technisch uitdagend, het kan worden uitgevoerd consequent zelfs door onderzoekers zonder voorafgaande chirurgische ervaring. Voor een onderzoeker zonder muriene chirurgische ervaring kan het model worden beheerst in ongeveer 20 operatieve sessies (of ongeveer 50 muizen). Voor de onderzoeker met voorafgaande chirurgische ervaring, het model kan worden beheerst in 5 operatieve sessies (ongeveer 20 muizen). We geloven met een video van hoge kwaliteit, de tijd tot meesterschap kan verder worden gereduceerd. Nadat de vaardigheid is bereikt, kan de procedure worden voltooid in 35 minuten voor de operatie, en 20 minuten voor de Terminal oogst. De chirurgen in ons laboratorium kunnen 10-12 volledige operaties per dag voltooien, met een operatieve sterfte graad van 5-10%. De meest voorkomende oorzaak van sterfte is long letsel bij binnenkomst op de borst, verdoving toxiciteit, of scheur van de aorta tijdens dissectie. Naast dTAA-onderzoek dient dit model ook als een leidraad voor veilige en gemakkelijke toegang tot de thoracale aorta en Lung Hilum voor onderzoekers die andere interventies in de borstkas bestuderen.

Protocol

De dieren protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Virginia institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (nr. 3634).

1. inductie van anesthesie en intubatie

1. Plaats een 8-10-week oude mannelijke C57BL/6-muis in een gesloten kamer met een continue stroom van 5% Isofluraan en zuurstof mengsel gedurende 5 minuten, totdat de ademhaling zichtbaar wordt vertraagd.
   Opmerking: afhankelijk van het experimentele protocol kunnen verschillende stammen, geslachten en leeftijden van muizen worden gebruikt. Vrouwelijke muizen zijn mogelijk moeilijker te intuberen vanwege kleinere afmetingen en dus kleinere luchtweg.
2. Intuberen de muis zoals beschreven door Vandivort et al.¹³.
   Opmerking: de intubatie stap is het moeilijkste deel van dit model om te leren en uit te voeren. De hierboven genoemde auteurs doen uitstekend werk met uitleg over de stappen in hun video.

2. de muis vastzetten op de chirurgische kaart

1. Verbind de Endotracheale (ET) buis, bevestig de borst stijging en leg de muis in de juiste laterale decubitus positie. Draai Isofluraan tot ongeveer 3% en breng smering aan op beide ogen. De ventilator moet worden ingesteld om ongeveer 200 ademingen per minuut en 225 μL getij volume te leveren.
   Opmerking: toxiciteit is snel als Isofluraan 5% wordt achtergelaten. Echter, de respons op Isofluraan is variabel, dus anestheticum debiet moet zodanig worden getitreerd dat spontane diafragmatische contracties ongeveer elke 10-20 s optreden en oxygenatie voldoende blijkt bij de inspectie van de slijmvliezen en het blootgestelde weefsel.
2. Bevestig de ET-buis aan het bord met tape. Strek de rechterarm rostrally zodat de voorste poot is in lijn met de neus en bevestig het met tape.
3. Trek de staart voorzichtig aan om een spannings lijn te creëren tussen de rechter arm en de staart, waardoor de wervelkolom wordt geproduceerd.
   Opmerking: het vastzetten van zowel de staart als de rechterpoot in de lijn voorkomt dat de ET-buis wordt iningevoegd of ontzet.
4. Plak het linker been in zijn natuurlijke positie. Teken de linker arm ventraal over gerold gaas en tape naar beneden.

3. voorbereiding voor chirurgie

1. Scheer de linkerflank van de muis met elektrische Clippers van linker schouder naar linker buik.
2. Gebruik een katoen getipt applicator om Betadine oplossing te poetsen over de operatieplaats. Gebruik een nieuwe, met katoen getipt applicator om de 70% ethanol oplossing over de operatieplaats te poetsen. Laat drogen. Plaats een steriele Drape.
3. Let op: Zorg ervoor dat alle ethanol volledig is gedroogd voordat u doorgaat als elektrocauterie wordt gebruikt en de ethanol kan ontsteken.

4. intrede in thorax

1. Maak een 1 cm laterale incisie op het middelpunt van de hemithorax met behulp van een chirurgische schaar. Gebruik handheld elektrocauterie om spier lagen te verdelen totdat de ribben zichtbaar zijn.
2. Direct een 2 mm deel van de rib te cauteriseren.
   Let op: bij het gebruik van elektrocauterie op de rib, Let op de spontane ademhaling frequentie. Als de muis een diafragmatische contractie heeft tijdens het cauterie, kan de tip de thorax binnengaan en de longen doorprikken, wat meestal fataal is in dit model.
3. Gebruik een bevokelde, fijne, met katoen getipt applicator in de rib-ruimte die superieur is aan het dichtgeschroeid gedeelte, draai de punt op het weefsel om in de pleurale ruimte te breken. Plaats de bevoafde 3 mm x 2 mm spons in de thorax om de longen in te klappen.
   Opmerking: laat alleen zachte, natte, sponzen contact opnemen met de longen, omdat het uiterst delicaat is.
4. Gebruik een schaar om langs het bovenste deel van de gecauteriseerde rib te snijden, totdat het diafragma zichtbaar is.

5. aorta blootstelling

1. Plaats rib-OPROLMECHANISMEN en gebruik ze om de Thoracotomie incisie te openen. Verwijder voorzichtig de spons van het oppervlak van de longen.
2. Plaats bevoafd 6 mm x 4 mm spons, zodat het de longen bedekt, met uiteinden die rostraal en caudally wijzen. Plaats de (brede) Long oprol trekker op de spons en schuif de oprol trekker voorzichtig totdat de aflopend thoracale aorta wordt blootgesteld.
3. Gebruik #7 tang om het bindweefsel en vet van de aorta te ontleden voor een gedeelte van ongeveer 5 mm.
   Opmerking: kleine aders kunnen dwars door de aorta lopen; Vermijd het scheuren tijdens het dissectie (het gebruik van ten minste 14x vergroting kan helpen om deze complicatie te voorkomen).

6. blootstelling aan elastase

1. Verzadigd 0,5 mm x 1 mm spons met 12 μL varkens alvleesklier elastase en plaats het op het blootgestelde oppervlak van de aorta.
   Opmerking: laat de spons de contralaterale Long niet aanraken.
2. Na de vooraf bepaalde tijd (meestal 3-5 min), verwijder de elastase spons met #7 Tang. Verwijder de Long oprol trekker. Irrigeren de borstholte met 1 mL steriele zoutoplossing.
   Opmerking: Verwijder de Long oprol trekker voor irrigatie met zoutoplossing, omdat het de Long spons verzadigd en zacht kan maken, waardoor het gemakkelijker wordt om te verwijderen van het oppervlak van de longen.
3. Gebruik gerold 2 "x 2" gaas om de resterende zout irrigatie te absorberen. Draai Isofluraan tot 2%.

7. sluiting van de borst

1. Verwijder de Long spons. Verwijder de caudal Lung retractor. Verwijder de rostrale migratoire Lung retractor.
2. Plaats 3 onderbroken 6-0 niet-absorbabele hechtingen om de ribben te verzetten, binden een losse knoop in elk, maar niet vastbinden. Neem grote zorg om de longen niet met de hecht naald te raken.
3. Blaas de longen opnieuw op door de uitstroom buis op de ventilator te occluderen of door snel 0,5-1,0 mL lucht door de ET-buis te blazen door de 3-Way stop haan te maken.
   Let op: om Barotrauma te voorkomen, vermijd overmatig gebruik van de met lucht gevulde spuit en gebruik niet meer dan 1,0 mL lucht.
4. Binden niet-absorbabele hechtingen. Herbenadering van de spier lagen met een lopende 5-0 absorbabele multifilament hecht. Schakel Isofluraan uit tot 1%.
5. Nauwe huid met 7-10 onderbroken 5-0 niet-absorbabele hechtingen. Schakel Isofluraan in op 0%.

8. herstel

1. Toedienen van 6 μg (0,02 mL van een 0,3 mg/mL suspensie) van buprenorfine subcutaan. Verwijder de tape van de rechter voet, de staart en de linkerarm, gevolgd door de rechter armband.
2. Wanneer de muis ledematen beweegt, extubate door hem aan de staart te trekken om van de ET-buis te glijden. Plaats in de hoge zuurstofgehalte warmere kamer in rugligging.
   Opmerking: het is veilig om de muis van de zuurstof kamer naar de kooi te verplaatsen wanneer deze zich naar de normale staande positie kan wenden. Bovendien moeten muizen worden gecontroleerd op tekenen van pijn, nood, of het niet vaak gedijen voor de eerste 24-48 uur na de operatie en extra analgesie of zacht voedsel zoals aangegeven.

9. blootstelling aan aorta aneurysma (terminale oogst procedure)

Opmerking: in het algemeen wordt weefsel oogst uitgevoerd op 14 dagen, omdat dit de periode van maximale dilatatie vertegenwoordigt. Afhankelijk van het experiment kan de timing van de oogst procedure echter op elk moment tussen 3 dagen en 4 + weken worden uitgevoerd, afhankelijk van het experiment.

1. Intuberen en beveilig de muis naar het operatieve veld zoals hierboven beschreven (secties 1-3). Gebruik een schaar om de huid mediaal te verdrijven vanaf de linker flank naar de centrale buik en zorg dat het peritoneum niet binnenkomt.
2. Incise de huid van dorsale linker flank rostrally naar het niveau van de linker schouder. Dan in een hoek van 90 ° door de oksel naar het borstbeen.
   Opmerking: deze incisie moet volledig omcirkelen de oorspronkelijke huid incisie.
3. Met behulp van cauterie, ontleden huid flap naar het ventrale aspect van de muis, het blootstellen van de linker hemithorax. Gebruik een schaar om de buik binnen te gaan en de linker ribben marge van ventrale naar rugvin in te voeren om de onderzijde van het linker diafragma bloot te leggen. De laterale rand van het diafragma kan openen die gewenst is.
4. Indien niet gemaakt met de voorgaande stap, insnijden van het diafragma op de meest laterale rand. Plaats de punt van het cauterie in dit gat en cauteriseren het diafragma van de ribben marge naar de xyphoid proces. Met behulp van een vochtige fijngetipt katoen-getipt applicator, zachtjes vrij de longen van verklevingen aan de borstwand en duw Long medially.
   Opmerking: als verklevingen niet gemakkelijk uit de borstwand komen, gebruik cauterie om ze te verwijderen; Dit helpt voorkomen dat de longen scheuren die zware bloedingen kunnen veroorzaken.
5. Cauterize de binnenkant van de borstwand van RIB één aan de ribben marge, rugvin naar de mid axillaire lijn, maar ten minste 2 mm van de aorta. Snijd de borstwand langs de gecauteriseerde lijn.
   Opmerking: deze techniek vermijdt bloeden uit de intercostale slagaders.
6. Snijd langs de superieure marge van RIB One en vervolgens caudally langs de laterale rand van het borstbeen, het verwijderen van de linker ribbenkast. Plaats OPROLMECHANISMEN op de longen en trek mediaal. Plaats oprolmechanisme op diafragma en trek de caudally aan om zo veel mogelijk aorta bloot te leggen.
7. Gebruik een droge, met katoen getipt applicator om adhesies te verwijderen uit aorta aneurysma en een onaangetast distale segment. Meet de diameter van het onbeïnvloedde controle segment en het breedste deel van het elastase behandelde aneurysma met behulp van video micrometrie.
   Opmerking: de video micrometrie metingen worden gebruikt om de procentuele verwijding van het aneurysmale segment te berekenen in vergelijking met een controle segment met vergelijking 1. Een controle segment dat 0,5 mm distale naar het aneurysmale segment 1 is geselecteerd.
   
   Vergelijking 1
    
8. Pak aorta met Harms Tang, gewoon distale naar het behandelde segment. Gebruik een schaar om het distale naar de Tang te snijden en vervolgens de aorta uit de wervelkolom te ontleden. Snijd aorta proximale naar behandelde segment en verwijder aneurysmaal aorta.
9. Met behulp van een tuberculine spuit en naald, wassen van de aorta lumen met zoutoplossing en proces weefsel naar wens.

Resultaten

De toepassing van ons protocol resulteert in robuuste dTAA bij muizen in vergelijking met zout regelaars. De ontwikkelde TAAs zijn fusiform in vorm en komen alleen voor in het behandelde deel van de aorta (Figuur 1 en Figuur 2)¹¹. Figuur 2 toont een voorbeeld van een video micrometrie meting bij weefsel oogst. Met behulp van vergelijking 1, de aorta-verwijding is 130% in dit voorbeeld.

Discussie

De thoracale en abdominale aorta zijn cellullair en embryologisch verschillend, wat relevant is voor aneurysmaal ziekte^14,15,16. Daarom is een specifiek diermodel nodig om TAA te bestuderen. Hoewel andere Murine dTAA modellen zijn gepubliceerd⁸, onze is het enige model om dalende thoracale aorta dilatatie die kan worden beschouwd als echt aneurysmatische (meer dan 50% verwijding). Bovendien, ons model is ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Angiocatheter (22G)			Gebreekt voor ET Tube
Dumont Tweezers; Patroon #7 x2	Roboz	RS-4982
Graefe Tissue Forceps	Roboz	RS-5158
Harms Forceps x2	Roboz	RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Lengte	Roboz	RS-7800
KL 1500 LED Lichtbron	Leica	150-400
M205A Dissctie Microscoop	Leica	CH 94-35
Iris Schaar, 11cm, Tungsten Carbide	World Precision Instruments	500216-G
Metalen Clip board			Gebruik met de Muis Retractor Set
Muis Retractor Set	Kent	SURGI-5001	Heeft 2 korte en 1 lange fixatoren nodig
Muis Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Voeding met VS Connector	Harvard Apparatus	73-0043	MiniVent Ventilator voor Muizen (Model 845), Enkel Dier, Volume Gecontroleerd
Sigma Aldrich	Elastase uit porcien pancreas	E0258-50MG	Kan in verschillende maat flessen worden gekocht
Kleine Vaatcauterisatie Kit	Fine Science Tools	18000-00	Aanbevolen om oplaadbare AA batterijen te gebruiken
Veer Schaar, 10.5cm	World Precision Instruments	14127
Sterilisatie Wattenschijfjes (Sponzen)	Sugi	31603	Kan op maat worden gesneden
Surgi Suite Chirurgische Platform	Kent		Bevestig aan clip board
Tech IV Isoflurane Vap	Jorgensen Laboratories	J0561A	Anesthesie verdamper