Methodenartikel

Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60135

⸱

17 januari 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.

Samenvatting

Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) bieden een waardevolle menselijke bron voor het bestuderen van de basiswetenschap van calcium (CA2 +) handling en signalering trajecten evenals high-throughput drug screening en toxiciteit testen. Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van de methoden die worden gebruikt voor het genereren van hoogwaardig iPSC-CMs dat moleculaire en functionele kenmerken consistent kan reproduceren over verschillende cellijnen. Bovendien wordt een methode beschreven om hun functionele karakterisering te beoordelen door de evaluatie van CA2 + handling-eigenschappen. Lage zuurstof (O2) voorwaarden, lactaat selectie, en langdurige tijd in de cultuur produceren hoge zuiverheid en hoge kwaliteit ventriculaire-achtige cardio myocyten. Vergelijkbaar met geïsoleerde volwassen rat cardiomyocyten (ARCMs), 3-maand-oude iPSC-CMs vertonen hogere CA2 + amplitude, sneller tempo van CA2 + reuptake (Decay-tau), en een positieve lusitropic respons op β-adrenerge stimulatie in vergelijking met dag 30 IPSC-CMS. De strategie is technisch eenvoudig, kostenbesparend en reproduceerbaar. Het biedt een robuust platform voor het modelleren van hartziekten en voor de grootschalige geneesmiddelen screening gericht op ca2 + handling eiwitten.

Inleiding

Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (IPSC-CMs) zijn een aantrekkelijk mens-gebaseerd platform om een grote verscheidenheid aan hartziekten in vitro1,2,3,4,5,6,7,8te modelleren. Bovendien kan IPSC-CMs worden gebruikt voor de voorspelling van patiënt reacties op nieuwe of bestaande geneesmiddelen, om hit verbindingen te scherm en nieuwe gepersonaliseerde drugs te ontwikkelen9,10. Echter, ondanks aanzienlijke vooruitgang, verschillende beperkingen en uitdagingen moeten worden overwogen bij het gebruik van iPSC-CMs11. Dientengevolge, methoden om cardiale differentiatie protocollen te verbeteren, om de efficiëntie en rijping van IPSC-CMs te verbeteren en om specifieke hartspier subtypen (ventriculaire, atriale en nodal) te genereren, zijn intens bestudeerd en hebben al geleid tot talrijke cultuur strategieën om deze hindernissen te overwinnen12,13,14,15.

Niettegenstaande de robuustheid van deze protocollen, is een belangrijke zorg voor het gebruik van iPSC-CMs de reproduceerbaarheid van lange en complexe procedures om hoogwaardige cardio myocytes te verkrijgen die dezelfde prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen. Reproduceerbaarheid is niet alleen essentieel bij het vergelijken van cellijnen met verschillende genetische achtergronden, maar ook bij het herhalen van cellulaire en moleculaire vergelijkingen van dezelfde cellijn. Celvariabiliteit, zoals well-to-well verschillen in iPSCs-dichtheid, kan cardiale differentiatie beïnvloeden, waardoor een lage opbrengst en cardiomyocyten van slechte kwaliteit worden gegenereerd. Deze cellen kunnen nog steeds worden gebruikt om experimenten uit te voeren waarvoor geen zuivere populatie CMs nodig is (bijvoorbeeld bij het uitvoeren van CA2 + tijdelijke metingen). Inderdaad, bij het uitvoeren van elektrofysiologische analyse zal het niet-CMs niet kloppen, noch spontaan noch onder elektrische stimulatie, dus het zal gemakkelijk zijn om ze uit de analyse uit te sluiten. Vanwege de slechte kwaliteit kan iPSC-CMs echter veranderde elektrofysiologische kenmerken vertonen (bijv. onregelmatige CA2 + voorbijgaande, lage CA2 + amplitude) die niet te wijten zijn aan hun genetische make-up. Daarom, vooral bij het gebruik van iPSC-CMs om cardiale ziekte te modelleren, is het belangrijk om de resultaten van een slechte kwaliteit CM met de ziekte fenotype niet te verwarren. Voorafgaand aan elektrofysiologische studies zijn zorgvuldige screening-en uitsluitings processen vereist.

Deze methode omvat geoptimaliseerde protocollen voor het genereren van hoge zuiverheid en hoge kwaliteit cardiomyocyten en om hun functie te beoordelen door het uitvoeren van CA2 + voorbijgaande metingen met behulp van een calcium en contractiliteit acquisitie en analysesysteem. Deze techniek is een eenvoudige, maar krachtige manier om onderscheid te maken tussen hoge efficiëntie en lage efficiëntie iPSC-CM-preparaten en een fysiologisch relevante karakterisering van humaan iPSC-CMs te bieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten met volwassen rat cardiomyocyten in deze studie werden uitgevoerd met goedgekeurde institutionele dierenverzorging en gebruiks Comité (IACUC) protocollen van de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï. De volwassen rat cardiomyocyten werden geïsoleerd van Sprague Dawley rat Hearts door de Langendorff-gebaseerde methode zoals eerder beschreven16.

1. voorbereiding van de media

  1. Bereid hiPSC media voor.
    1. Het supplement en het basale medium op kamertemperatuur (RT). Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 400 mL van het basale medium en 100 mL van het supplement en filter met behulp van een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  2. Bereid RPMI + B27.
    1. Evenwichts het B27 supplement en het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x-supplement en filter met een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  3. Bereid RPMI + B27 (-) insuline.
    1. Evenwicht tussen het B27 (-) insuline supplement en het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x-supplement en filter met een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  4. Maak selectie media (RPMI (-) glucose + B27 + lactaat).
    1. Evenwichts het B27 supplement en het basale medium (RPMI 1640 (-) glucose) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x supplement, Voeg 4 mM natrium lactaat in steriel water toe en filtreer met behulp van een 0,22 μm vacuümgestuurde filter. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  5. Bereid RPMI 20.
    1. Het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Meng foetaal runderserum (FBS) (20% eindconcentratie) en RPMI. Filter met een vacuüm filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C. Voor gebruik op RT.
  6. Bereid de doorgang van de media door het toevoegen van Rho-geassocieerde, spiraalvormige spoel met proteïne kinase (GESTEENTE) remmer (2 μM eindconcentratie) aan hiPSC media.
  7. Maak D0 media klaar door GSK-3-remmer toe te voegen, CHIR 99021 naar RPMI + B27 (-) insuline media (10 μM Final).
  8. Bereid de D3-en D4-media voor door RPMI + B27 (-) insuline dragers te mengen met IWR-1 (5 μM Final).
    Opmerking: D1-en D5-media zijn samengesteld uit RPMI + B27 (-) insuline. D7 media is samengesteld uit RPMI + B27.
  9. Bereid blokkerende buffer (2% boviene serumalbumine [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]): Voeg in een conische buis van 50 mL 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS en 250 μL NP-40 toe. Meng tot volledig opgelost.

2. bereiding van menselijke embryonale stamcel (hESC)-gekwalificeerde matrix gecoate platen en Dekstroken

Opmerking: Voer alle stappen uit onder een gesteriliseerde weefsel cultuurkap.

  1. Ontdooien hESC-gekwalificeerde matrix stockoplossing 's nachts op ijs bij 4 °C. Raadpleeg het productspecificatie blad om de juiste volumes te bepalen, aangezien dit afhankelijk van de voorraad kan variëren. Bewaar deze aliquots bij-20 °C in 1,5 mL micro centrifugebuizen.
  2. Om de matrix voor coating platen of glazen dekstroken te gebruiken, ontdooit u gedurende 30 minuten eerst een aliquot van de met hESC gekwalificeerde matrix bij 4 °C.
  3. Aliquot 24 mL van koude Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM): nutriënten mengsel F-12 (DMEM/F: 12) media in een conische buis van 50 mL.
  4. Meng de Cold DMEM/F: 12 media met een glazen pipet van 2 mL om het oppervlak van de pipet af te koelen.
  5. Gebruik dezelfde Pipet, neem ongeveer 500 − 700 μL koude DMEM/F: 12 en meng met de hESC-gekwalificeerde matrix aliquot binnen de microcentrifuge buis zelf.
  6. Eenmaal goed gemengd, breng de oplossing over naar de 50 mL conische buis met de koude DMEM/F: 12 en meng opnieuw.
  7. Voeg voor een standaard 6-goed plaat 1 mL van dit mengsel toe aan elk goed. Zorg ervoor dat de put volledig gedekt is. Laat de platen ten minste 30 minuten onder de weefselkweek kap staan. Indien gewenst, bewaren bij 4 °C onmiddellijk na het beplating gedurende maximaal 1 week en op RT gedurende 30 minuten voorafgaand aan gebruik.
  8. Om de platen te gebruiken, aspireren de matrix en vervangen door de juiste media. Onmiddellijk gebruiken.
  9. Bewaar de glazen dekstroken in een steriele omgeving (bijv. in een steriele weefselkweek).
  10. Veeg vóór de coating elke afzonderlijke afdek mantel af met 70% ethanol. Als de afdekplaat droog is, plaats deze dan in een goed van een steriele 6-put.
  11. Neem 250 − 300 μL van de hESC-gekwalificeerde matrix oplossing en doseer deze voorzichtig rechtstreeks op het midden van de glazen afdekplaat. Laat gedurende minstens 30 minuten voor gebruik de dekstroken bij RT onder de weefselkweek kap staan.

3. bereiding van kleine moleculen

Opmerking: Reconstitueer alle kleine moleculen en WNT-modulatoren in DMSO tenzij anders vermeld.

  1. Bereid 10 mM aliquots van 25 μL elk van IWR-1 en CHIR 99021 en bewaar bij-20 °C.
  2. Reconstitueer 10 mM aliquots van 50 μL elk van Thiazovivin (ROTSREMMER) en bewaar bij-20 °C.

4. onderhoud en passage van iPSCs

Opmerking: Voer alle volgende stappen uit onder een steriele weefselkweek.

  1. Onderhoud de iPSCs in standaard 6 well Plates en voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden. Handhaaf de cellen met 2 mL hiPSC media per put. Verander de media om de andere dag. Houd de cellen bij 37 °C, 6% O2,5% co2. Doorgang van de cellen tussen 70 − 80% Confluent.
  2. PBS zonder CA2 + en mg2 + tot RT.
  3. Om het afdraaien proces te starten, voeg 1 ml PBS zonder CA2 + en mg2 + toe aan de put die moet worden gepasteerd. Incuberen bij RT gedurende 7 − 10 min. Controleer de cellen onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de PBS-behandeling niet tot volledige dissociatie van de monolaag heeft geleid.
  4. Verwijder PBS en vervang deze door 1 mL doorgangen. Gebruik een mobiele lifter om voorzichtig te schrasen en til de cellen van het oppervlak van de put.
  5. Laat de cellen mechanisch ontkoppelen met een steriele glazen pipet van 2 mL. Herhaal dit totdat de cellen goed zijn gedissocieerd in kleine kolonies wanneer ze onder een microscoop worden waargenomen.
  6. Zodra de cellen voldoende zijn losgekoppeld, voeg 5 ml van de afdraaien media om de cellen te splitsen 1:6. Pas de hoeveelheid door te voegen media aan die moet worden toegevoegd aan de gewenste gesplitste verhouding.
  7. Aspirate de hesc-gekwalificeerde matrix van de hesc-gekwalificeerde matrix-gecoate plaat en vervang met 1 ml van de afdraaien media per put. Voeg per put 1 ml gezien cellen toe.

5. cardiomyocyte differentiatie

  1. Gebruik hiPSC-lijnen die goed zijn opgebouwd (meer dan 20 passages) en vertonen een homogene morfologie voordat u begint met cardiale differentiatie.
  2. Zorg ervoor dat de iPSCs ongeveer 70 − 80% Confluent zijn.
  3. Was de cellen 1x in PBS zonder CA2 + en mg2 +.
  4. Voeg 2 mL D0 media (stap 1,7) per put toe en breng de cellen terug naar de incubator.
  5. Na 24 uur vervangen door 3 mL D1 media per put voor 48 h.
  6. Op dag 3 vervangt u de media door 2 mL D3 media per well. Herhaal met D4-media op dag 4.
  7. Op dag 5 vervangt u de media door 3 mL D5-media per put.
  8. Op dag 7 vervangt u de media door 3 mL D7 media per put en gaat u over naar een incubator met 37 °C, 5% CO2en een normale O2 -concentratie. Vervang de D7 (RPMI + B27) media elke 2 dagen.

6. selectie procedure en dissociatie van iPSC-CM

  1. Tien dagen voor het uitvoeren van de CA2 + Transient metingen of een functionele analyse, vervang de rpmi + B27 media met 3 ml selectie medium per well voor 48 h.
  2. Vervang de media door 3 mL selectie media voor nog eens 48 h.
  3. Vervang de media door 2 mL RPMI + B27 media per well voor 24 uur.
  4. Coat standaard 6 goed platen zoals beschreven in rubriek 2.
  5. Voeg aan elk goed 1 mL steriele 0,25% trypsine toe met EDTA. Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Gebruik een pipet van 1.000 μL om de cellen mechanisch te ontkoppelen, zodat enkelvoudige cellen kunnen worden gezien wanneer ze onder een microscoop worden waargenomen.
  7. Breng de cellen over in een steriele 15 mL conische buis en voeg per put 2 mL RPMI 20 media toe. Centrifugeer 5 min bij 800 x g.
  8. Aspireren de supernatant en respenderen de cellen in RPMI + B27 media. Aspirate de door hESC gekwalificeerde matrix van de platen en vervang met 1 mL RPMI + B27 media.
  9. Gebruik een pipetpunt van 1.000 mL om de celpellet mechanisch te ontkoppelen totdat de oplossing homogeen is.
  10. Breng ongeveer 500.000 cellen over naar elk goed. Transfer naar incubator voor 24 uur.
  11. Vervang de media met 3 mL selectie medium per put voor 48 h.
  12. Vervang de media door 3 mL RPMI + B27 per well. Houd cellen in D7 media (RPMI + B2 veranderende media om de 2 dagen totdat ze klaar zijn voor de functionaalanalyse.

7. voorbereiding van iPSC-CMs voor Flowcytometrie

  1. Zodra de cellen van de gewenste leeftijd zijn en metabole selectie hebben ondergaan (rubriek 6), was de cellen met PBS zonder CA2 + en mg2 +.
  2. Voeg 1 mL per put van trypsine 0,25% toe en inincuberen gedurende 5 − 7 minuten bij 37 °C.
  3. Pipetteer het mengsel 5 − 10x met een P1000 tip om de cellen te singulariseren en breng over in een buis van 15 mL met 2 mL RPMI 20.
  4. Draai de cellen op 600 x g gedurende 5 minuten.
  5. Voeg 100 μL fixatie oplossing (4% PFA) toe aan de celpellet. Voeg de oplossing druppelsgewijs toe met continue, zachte grondig en stel vervolgens 15 minuten op ijs.
  6. Voeg 1,5 mL PBS toe. Verzamel de cellen door centrifugeren en aspireren het supernatant.
  7. Neem voor elk experiment één Onbevlekte controle per fixatie/permeabilization aandoening op.
  8. Respendeer cellen in 500 μL blokkerende oplossing (2% FBS/2% BSA in PBS met 0,1% NP-40) gedurende 30 minuten bij RT.
  9. Voeg, zonder de blokkerende oplossing te verwijderen, het primaire antilichaam MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) toe en inincuberen 45 min bij RT.
  10. Wassen met blokkerende buffer. Cellen verzamelen door centrifugeren en aspiraat-oplossing.
  11. Voeg secundair antilichaam Alexa Fluor 555/488 (1:750) verdund in de blokkerende buffer voor 45 min bij RT of 's nachts bij 4 °C.
  12. Voeg 1,5 mL PBS toe. Cellen verzamelen door centrifugeren en aspiraat-oplossing.
  13. Respendeer cellen in 250 − 300 μL PBS. Gebruik een P1000 pipet om de cellen te scheiden.
  14. Bereid ronde bodem buizen met een 35 μm nylon mesh Cell zeef dop. Pre-Bevochtig de celzeef met 50 μL PBS en zet de buis op ijs.
  15. Breng de oplossing met de uitgesplitste cellen over naar de ronde bodem buizen met de celstrainer doppen. Laat de celoplossing natuurlijk afvoeren of tik op de bodem van de buis tegen een vlak oppervlak, indien nodig, om volledige drainage en verzameling van de cellen in de buis te garanderen. Zorg ervoor dat je de tube zo snel mogelijk weer op ijs zet.
  16. Spoel de celzeef af met 250 μL PBS om eventuele rest cellen te herstellen.
  17. Onderhoud de buizen op ijs en bedek met aluminiumfolie tot flow cytometrie analyse.

8. plating cardiomyocytes op glazen Dekglakjes

Opmerking: Voer alle stappen uit in een steriele omgeving.

  1. Maak de glazen dekstroken zoals beschreven in de stappen 2,10 en 2,11.
  2. Zodra het iPSC-CMs is geselecteerd en van de gewenste leeftijd is, volgt u stap 6.5 − 6.7 om het iPSC-CMs te ontkoppelen.
  3. Zuig de supernatant op en hervat de cellen in een voldoende hoeveelheid RPMI 20-media om ongeveer 300.000 cellen per 250 μL te hebben.
  4. Gebruik een glazen pipet van 2 mL om de celpellet mechanisch te ontkoppelen totdat de oplossing homogeen lijkt.
  5. Aspirate de hESC-gekwalificeerde matrix uit de dekstroken.
  6. Meng en trek 250 μL van de oplossing uit de conische buis van 15 mL met behulp van een pipet van 1000 μL.
  7. Breng de 250 μL van de oplossing langzaam op de glazen Dekbladen aan, waarbij u extra voorzichtig moet zijn om alleen toe te voegen aan het gebied waar de hESC-gekwalificeerde matrix coating aanwezig is.
  8. Breng voorzichtig naar de incubator en laat 's nachts, zorg dat u de cellen op de dekstroken niet schudt of verspreidt. De volgende ochtend, voeg voorzichtig 2 mL D7 (RPMI + B27) media toe aan elk goed met de coverslip. Verander de media na 24 uur en elke 2 dagen daarna.

9. cellen repareren

  1. Zorg ervoor dat een adequate hoeveelheid PBS met CA2 + en mg2 + wordt geëscaleerd tot 4 °c.
  2. Bereid een 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing, verdund in PBS met CA2 + en mg2 + en evenwichtig tot 4 °c.
  3. Zodra de iPSC-CMs van geschikte leeftijd zijn, hebben metabole selectie ondergaan (sectie 6), en zijn verguld op dekstroken (sectie 8), was de cellen 3x met 1 mL koude PBS met CA2 + en mg2 + per put.
  4. Voeg 1 mL koude 4% PFA toe en laat de cellen gedurende 15 minuten bij RT onder de motorkap staan.
  5. Was de cellen met koude PBS om overtollige PFA te verwijderen.
  6. Voeg 2 mL PBS toe met CA2 + en mg2 + en bewaar bij 4 °c.

10. immunofluorescentie kleuring

  1. Verwijder PBS uit de vaste cellen en voeg 1 mL blokkerende buffer toe. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
  2. Verwijder de blokkerende buffer en voeg het primaire antilichaam (5 mg/mL) verdund in de blokkerende buffer toe. Inincuberen op 4 °C.
  3. Was 3x in PBS met CA2 + en mg2 + gedurende 5 minuten per stuk.
  4. Secundair antilichaam toevoegen verdund in blokkerende buffer 1:1000.
  5. Bedek de plaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht en inincuberen voor 45 min bij RT. Houd de aluminiumfolie voor de volgende stappen.
  6. Was 3x in PBS met CA2 + en mg2 +, 5 min elk.
  7. Voeg een voldoende hoeveelheid DAPI-werkoplossing toe om de cellen volledig te bedekken en gedurende 10 minuten bij RT te incuberen.
  8. Was het monster grondig met PBS met CA2 + en mg2 + om overtollige DAPI te verwijderen.
  9. Neem nieuwe glaasjes en voeg in het midden een druppel bevestigings media toe. Gebruik de druppelaar om de bevestigings media gelijkmatig te verdelen. Zet de afdekplaatjes met de cellen naar beneden op de dia's.
    Opmerking: cellen kunnen gedurende 30 dagen worden opgeslagen als ze beschermd zijn tegen licht.

11. beoordeling van intracellulaire CA2 + transiënten

  1. Zodra het iPSC-CMs ten minste 3 maanden oud is, een metabole selectie heeft ondergaan (rubriek 6) en zijn geplateerd op dekstroken, behandel ze dan met 2 μL Fura-2, AM (eindconcentratie: 1 μM) en inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Fura-2 is lichtgevoelig. Voer alle laadprocedures en experimenten uit in het donker.
  2. Bereid het calcium-en contractiliteits overname-en analysesysteem voor.
    1. Schakel het systeem in om ervoor te zorgen dat het Arc-lampje wordt gestart (Figuur 1B).
    2. Plaats de kamer op het systeem en sluit de buizen van de pomp aan op de juiste inlaat en uitlaatopeningen en de elektrische draad van de stimulator naar de kamer, zoals afgebeeld in Figuur 1C.
    3. Vul de perfusie buis die door de fluidic inline Heater loopt met 37 °c voorverwarmde tyrode 's oplossing.
    4. Pas de camera aan en stel de diafragma afmetingen in om het achtergrond gebied te minimaliseren.
  3. Monteer een glazen dekglaasje met iPSC-CMs in de kamer en bevestig het.
  4. Voeg met de oplossing van Tyrode de kamer 500 μL van de oplossing van Tyrode direct op de bovenkant van de gesloten glazen dekglaasje toe en begin met de perfusing (1,5 mL/min).
  5. Pace iPSC-CMs met 1 Hz veld stimulatie met behulp van de elektrische stimulator (10 V, 4 MS).
  6. Incuberen iPSC-CMs in de kamer met stimulatie gedurende ten minste 3 − 5 minuten voor de cellen om de Fura-2-kleurstof te wassen en zich aan te passen aan de omgeving en de fluorescerende kleurstof uit te spoelen.
  7. Pas het kijkvenster aan het linker bovengedeelte van de glazen afdekplaat aan.
  8. Begin met opnemen.
  9. Nadat u een consistente stroom van 5 − 10 pieken hebt verzameld, klikt u op onderbreken om de opname tijdelijk te stoppen.
  10. Om ervoor te zorgen dat noch de focus noch de afmetingen van het kijkvenster worden gewijzigd, verplaatst u de fase van de Microscoop naar het aangrenzende gebied, beweegt u naar het tegenovergestelde uiteinde en hervat u de opname.
  11. Herhaal de stappen 11,9 en 11,10 om over de afdekplaat te scannen, in eerste instantie naar links te gaan, dan naar beneden in een zig-zag mode om het hele afdek oppervlak te bedekken. Dit bestaat uit 80 − 100 metingen per dekslip.
    Opmerking: Beperk de totale meet tijd tot 10 min als secundaire factoren leiden tot een afname van CA2 + Transient.
  12. Nadat de CA2 -transiënten zijn verworven, analyseert u de gegevens met de fluorescentie traces-analyse software volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol beschreven in Figuur 1a gegenereerd zeer zuivere cardiomyocyten die een ventriculaire/volwassen-achtige fenotype met tijd in de cultuur verwerven. Zoals beoordeeld door immunofluorescentie kleuring voor de Atrium-en ventriculaire myosine regulatoire lichte keten 2 isovormen (respectievelijk MLC2A en MLC2V), waren de meeste cellen die door dit protocol werden gegenereerd MLC2A-positief op dag 30 na inductie van cardiale differentiatie, terwijl MLC2V in veel lager...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen voor het gebruik van Human IPSC-CMs als experimentele modellen zijn: 1) het genereren van hoogwaardige hartspier (CMs) die de consistente prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen; 2) de cellen gedurende ten minste 90 dagen in cultuur te laten rijpen om hun fenotype adequaat te kunnen beoordelen; 3) het uitvoeren van elektrofysiologische studies, bijvoorbeeld calcium (CA2 +) voorbijgaande metingen, om een fysiologisch relevante functionele karakterisering van humaan IPSC-CMs t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesteund door AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2-geleerden Award voor klinische en translationele Research loopbaanontwikkeling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 en AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouseInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbitInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI nuclear stainThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 wellCorning353046
Fluidic inline heaterLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualified matrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Live cell imaging chamberLive Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse AntibodySynaptic Systems311011
Myocyte calcium and contractility systemIonoptixISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES MembraneThermoFisher124-0045
PBS with Calcium and MagnesiumCorning21-030-CV
PBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Sodium L-lactateSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's solutionBoston BioproductsBSS-355wAdjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

Referenties

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12(2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17(2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010(2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50(2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ventrikel achtige cardiomyocyteniPSC afgeleide cardiomyocytenzuurstofarme conditieslactaatselectieflowcytometrische kwantificeringFura 2 AM kleuringTyrode oplossing perfusieMLC2 isovormexpressiecardiale differentiatieprotocol

Gerelateerde artikelen