Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60171

⸱

6 oktober 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE), 2University Eye Hospital, Center For Ophthalmology, University Hospital Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea's, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea's toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.

Samenvatting

Experimenteel onderzoek naar corneale endotheliale cellen wordt geassocieerd met verschillende moeilijkheden. Menselijke donor cornea's zijn schaars en zelden beschikbaar voor experimentele onderzoeken, omdat ze normaalgesproken nodig zijn voor transplantatie. Endotheliale celculturen vertalen vaak niet goed naar in vivo situaties. Vanwege de biostructurele kenmerken van niet-menselijke cornea's induceert stromale zwelling tijdens de teelt substantieel verlies van corneale endotheliale cellen, waardoor het moeilijk is om de teelt voor een langere periode uit te voeren. Dezwelling agenten zoals dextran worden gebruikt om deze reactie tegen te gaan. Echter, ze veroorzaken ook aanzienlijke endotheel celverlies. Daarom is een ex vivo-orgel cultuur model vastgesteld dat geen dezwelling middelen nodig heeft. Varkens ogen van een plaatselijk slachthuis werden gebruikt om gesplitste corneale knoppen voor te bereiden. Na gedeeltelijke corneale trephination werden de buitenste lagen van het hoornvlies (epitheel, Bowman-laag, delen van de stroma) verwijderd. Dit vermindert aanzienlijk het corneale endotheelcelverlies geïnduceerd door massale stromale zwelling en het membraan van Descemet in langere teelt periodes en verbetert het algemene behoud van de endotheliale cellaag. Daaropvolgende volledige corneale trephination werd gevolgd door het verwijderen van de gesplitste corneale knop van de resterende oogbol en de teelt. De endotheliale celdichtheid werd beoordeeld bij follow-uptijden van maximaal 15 dagen na de bereiding (d.w.z. dagen 1, 8, 15) met behulp van lichte microscopie. De bereidingstechniek zorgt voor een beter behoud van de endotheliale cellaag die wordt ingeschakeld door minder stromale weefsel zwelling, wat resulteert in langzame en lineaire afname percentages in gesplitste corneale knoppen vergelijkbaar met menselijke donor cornea's. Aangezien dit gestandaardiseerde organo-typisch gecultiveerde onderzoeksmodel voor de eerste keer een stabiele teelt mogelijk maakt gedurende ten minste twee weken, is het een waardevol alternatief voor menselijke donor cornea's voor toekomstig onderzoek naar verschillende externe factoren met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel.

Inleiding

Corneale transplantatie procedures behoren tot de meest frequent uitgevoerde transplantaties wereldwijd1. Aangezien er een ernstig tekort is aan menselijke donor cornea's, is experimenteel onderzoek naar het aanpakken van corneale endotheel cellen in menselijke cornea's moeilijk uit te voeren1. De introductie van irrigatie oplossingen en andere stoffen die in het oog worden gebruikt, oftalmische viscoelastische apparaten, evenals chirurgische instrumenten en technieken (bijv. phacoemulficatie-instrumenten en-technieken, ultrasone energie) vereist geldige en uitgebreide onderzoeken met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel vóór klinisch gebruik.

Er zijn weinig alternatieven voor de menselijke donor cornea's voor onderzoek. Dieronderzoek modellen zijn zeer waardevol, maar tegelijkertijd zeer hulpbronnen consumeren en steeds meer ethisch worden ondervraagd. Een groot nadeel van in vitro celculturen is hun beperkte vertaling naar het menselijk oog. Resultaten verkregen uit celculturen kunnen in vivo voorwaarden zijn, omdat cellen endotheliale mesenchymale overgang (EMT) kunnen ondergaan, resulterend in fibroblast-achtige morfologie veroorzaakt door het verlies van celpolariteit en veranderingen in de celvorm en het gen expressie2.

Terwijl eerdere ex vivo-modellen teelt perioden van maximaal 120 uur meldden, werd onlangs een nieuwe voorbereidings techniek voor het opzetten van een varkens corneale endotheliale orgel cultuur model door het kweken van vers varken cornea's gedurende ten minste 15 dagen geïntroduceerd3 ,4,5,6. Als het corneale epitheel en delen van de stroma worden verwijderd (ongeveer 300 μm in totaal) van het hoornvlies vóór de teelt, zwelling van de stroma wordt verlaagd in gesplitste corneale knoppen resulterend in minder endotheel celverlies en een goed onderhouden endotheliale cellaag na maximaal 15 dagen, terwijl niet-gesplitste corneale knoppen significant endotheel celverlies vertonen als gevolg van ongelijke stromale zwelling en vorming van de plooien van Descemet. Oogbanken gebruiken meestal osmotische dezwelling agenten zoals dextran om zwelling van cornea's te verminderen voorafgaand aan transplantatie. Echter, deze agenten werden aangetoond voor het opwekken van verhoogde endotheel celverlies7,8,9.

Dit artikel is bedoeld om dit gestandaardiseerde ex vivo onderzoeksmodel in een gedetailleerd stap-voor-stap protocol te visualiseren om toekomstige onderzoekers in staat te stellen onderzoek te doen naar het corneale endotheel met behulp van gesplitste corneale knoppen. Dit model is een eenvoudige methode om stoffen en technieken te testen die in het oog worden gebruikt, zoals oftalmische viscoelastische apparaten, irrigatie oplossingen en ultrasone energie, of andere procedures waarbij het corneale endotheel van belang is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol volgt de ethische richtlijnen van onze instelling. In overeenstemming met de statuten van de Commissie voor ethische toetsing van onze instelling, moest voorafgaand aan de experimenten geen ethische goedkeuring worden verkregen, omdat alle varkens cornea's werden verkregen van het lokale slachthuis.

1. orgel cultuur

  1. Bereid varkens ogen.
    1. Van het plaatselijke slachthuis, het verkrijgen van varkens ogen die kort na het slachten zijn verwijderd maar vóór thermische behandeling. Transport van de ogen naar het lab en ze te verwerken binnen een paar uur. Houd tijdens het transport de ogen bij kamertemperatuur (ongeveer 21 °C) voor de verwerking.
    2. Verwijder alle orbitale adnexen (oogspieren, conjunctiva, vetweefsel) voorafgaand aan desinfectie met oogschaar en Colibri-Tang. Scheid en gooi alle ogen weg met een duidelijk trauma, externe schade (bijv. messen snede) of zichtbare corneale opaciteiten.
    3. Bereid een 5% jodium-PBS-oplossing (1:20) in een steriele beker door 3 mL 7,5% Povidon jodium toe te voegen aan 57 mL van een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Maak ook een aparte steriele beker met 60 mL zuivere PBS.
      Opmerking: de totale hoeveelheid gebruikte jodium-PBS-oplossing en de grootte van de beker hangt af van het aantal cornea's dat moet worden ontleed. Vijf tot zes ogen vereisen ongeveer 60 mL van de 5%-jodium-PBS-oplossing om goed te worden gedesinfecteerd.
    4. Breng vijf tot zes ogen in de 5%-jodium-PBS oplossing voor een totaal van 5 min om het oppervlak van de ogen goed te desinfecteren. Roer elke minuut voorzichtig om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de ogen volledig wordt ondergedompeld en volledig in de jodiumoplossing wordt gedesinfecteerd.
    5. Breng na 5 min de gedesinfecteerde ogen over naar de bereide beker gevuld met zuivere PBS. Nogmaals, roer voorzichtig om ervoor te zorgen dat de jodium-PBS-oplossing wordt weggewassen van het oppervlak van de ogen.
      Opmerking: Voer deze stap op een schone Bank uit om verontreiniging van de gedesinfecteerde ogen te voorkomen.
  2. Bereid celcultuurplaten.
    Opmerking: Voer de volgende stappen uit op een schone Bank met constante laminaire luchtstroom.
    1. Ontdooien 2 mL foetaal kalf serum (FCS). Vul een spuit (5 mL) met de FCS met behulp van een stompe canule. Maak de spuit leeg via een spuit filter (0,22 μm) om mogelijke bacteriële verontreiniging van de FCS te voorkomen in 80 mL dextran-vrij kweekmedium I (minimaal essentieel medium [MEM] met zouten van Earle, penicillaire/streptomycine, L-glutamine [200 mM], Amfotericine B [250 μg/mL], Hepes-buffer [1 M] [50x], NaHCO3en gedistilleerd water). Agitate het mengsel om te zorgen voor een gelijkmatige substraat verdeling.
    2. Vul elke put van een 12 well Cell Culture Plate met 3 mL van het substraat mengsel.
  3. Voer een dissectie en incubatie uit.
    Opmerking: Voer deze stap uit op een schone Bank. Raak het corneale endotheel niet aan met enige instrumenten.
    1. Breng een oogbol van de beker met PBS in de oogbollen houder met het hoornvlies naar boven gericht en plaats deze onder een Oogheelkundige chirurgische Microscoop. Gebruik een spuit gevuld met 0,9% NaCl om wat zuigkracht aan te brengen op het oog over de oogbol houder om het oog in positie te fixeren voor dissectie.
    2. Gebruik een trefine (ø 7,5 mm) met een gestandaardiseerde inleg, die ervoor zorgt dat de getreesde diepte niet hoger is dan 300 μm, om oppervlakkig te snijden in het centrale hoornvlies (Figuur 1a).
    3. Gebruik Colibri pincet en een scalpel voor eenmalig gebruik met een driehoekig blad om het gedeeltelijk getreesde deel van het hoornvlies horizontaal door de stroma te knippen en te verwijderen. Gooi het afgescheiden corneale deel dat bestaat uit het hoornvliesepitheel, de Bowman-laag en een deel van de stroma weg.
      Opmerking: Houd de horizontale snij richting strikt in stand om een gelijkmatige dikte van de resterende stroma te verkrijgen.
    4. Plaats in de stroma oppervlakkig een 10-0 hecht (10-0 polyamide 6) om de endotheel van de stromale zijde te kunnen onderscheiden tijdens de experimenten (Figuur 1B). Voorkom penetratie van het corneale endotheel. Gooi de oogbol weg als het endotheel is gepenetreerd.
      Opmerking: penetratie van het corneale endotheel met de naald zal zichtbaar zijn, zoals vloeistof uit de voorste oogkamer zal lekken door het hecht kanaal.
    5. Gebruik de trefine zonder inleg om de doorboorde tot volle diepte te snijden totdat de voorste oogkamer is bereikt (Figuur 1C). Een duidelijke daling van de weerstand en vocht lekken uit de voorste oogkamer kan worden waargenomen na volledige penetratie van het hoornvlies.
      Let op: gebruik een hockey mes als de gesplitste corneale knop aan één kant van de gesplitste corneale knop blijft bevestigd na het trepheren.
    6. Breng de verkregen gesplitste corneale knop, die bestaat uit een deel van de stroma (Figuur 2), het membraan van de Descemet en het corneale endotheel, over in het kweekmedium (kweekmedium I + FCS, zie punt 1,2) in de 12 well Cell Culture Plate met de gelabelde zijde naar beneden gericht, zodat het corneale endotheel naar boven wordt gericht.
      Opmerking: als de endotheliale zijde naar beneden is gericht, kan het endotheel beschadigd raken.
    7. Wijs een individueel nummer toe aan elke gesplitste corneale knop voor identificatie tijdens de follow-ups en label de putjes op de celkweek plaat dienovereenkomstig.
    8. Incuberen de gevulde celculturen in een incubator onder standaardomstandigheden bij een temperatuur van 37 °C, 5% CO2 en een relatieve luchtvochtigheid van 95%. Verander het kweekmedium (cultuurmedium I + FCS) op dag 8 als een incubatieperiode van 7 dagen wordt overschreden.
      Opmerking: de incubatie procedure met behulp van gesplitste corneale knoppen is gevalideerd voor maximaal 15 dagen.

figure-protocol-1
Figuur 1: dissectie van het varkens hoornvlies om gesplitste corneale knoppen te verkrijgen. A) natrephatie van de cornea met behulp van een trefine met een inlay om te snijden in een diepte van 300 μm en verwijdering van het epitheel en delen van het stromale weefsel, (B) een hechtmiddel oppervlakkig in de stroma wordt geplaatst zonder penetratie van de corneale Endotheel voor latere identificatie van de stromale zijde. C) volledige trephatie van het overgebleven hoornvlies wordt gevolgd door (D) het verwijderen van de verkregen gesplitste corneale knop van de oogbol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. microscopie en onderzoek van het endotheel

  1. Voer onbevlekt onderzoek uit.
    Opmerking: onbevlekt onderzoek kan meerdere keren worden uitgevoerd (bijvoorbeeld bij wekelijkse follow-ups op dag 1, 8 en 15). Echter, niet-bevlekt tellen maakt alleen de beoordeling van de endotheliale celdichtheid mogelijk, niet morfologische parameters.
    1. Vul 3 mL hypotone gebalanceerde zoutoplossing (hBSS, zie compositie in de tabel van de materialen) in elke put van een 12 well Cell Culture Plate. Plaats voorzichtig een enkele gesplitste corneale knop in hBSS om zwelling van de corneale endotheliale cellen te induceren en de zichtbaarheid van de cellen voor de celtelling te verbeteren.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de endotheliale zijde naar de richting van de Microscoop wordt gericht. Als een omgekeerde fasecontrastmicroscoop wordt gebruikt, moet de endotheel zijde naar beneden worden gericht. Terwijl op zijn plaats, de cultuur plaat mag niet worden verplaatst om te voorkomen dat endotheel cel schade.
    2. Laat de cellen 1-2 minuten opzwellen alvorens een foto van het endotheel te nemen met de camera die aan de Microscoop is bevestigd. Neem ten minste drie foto's van ten minste drie verschillende gebieden om een representatieve indruk te krijgen van de werkelijke toestand van het corneale endotheel. Voeg een schaalbalk toe met de ware schaal lengte van 100 μm voor een latere analyse van de dichtheid van de corneale endotheliale cel en de morfologische parameters.
    3. Om osmotische schade te voorkomen, verwijder de gesplitste corneale knop van de hBSS na maximaal 5 minuten en breng deze terug in het kweekmedium3.
  2. Voer gekleurd onderzoek uit.
    Opmerking: kleuring beëindigt de experimenten, aangezien de gebruikte kleurings stoffen cytotoxisch zijn. Daarom kan vlekken alleen worden uitgevoerd aan het einde van de observatieperiode voor de beoordeling van morfologische parameters (Reformatie figuren, rozet formaties, Alizarine rood gekleurd cellen).
    1. Bereid een 0,25% trypeen blauwe oplossing en 0,2% Alizarine rode S oplossing voor de kleurings procedure.
      1. Verdun voor de 0,25% trypaanse blauwe oplossing de 0,4% trypaanse blauwe oplossing met een 0,9% NaCl-oplossing.
        Opmerking: om bijvoorbeeld 20 mL van een 0,25% trypeen blauwe oplossing te verkrijgen, Verdun 12,5 mL van de 0,4% trypeen blauwe oplossing met 7,5 mL van de 0,9% NaCl-oplossing. De trypaanse blauwe oplossing kan gedurende enkele weken of maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
      2. Om een 0,2% Alizarine Red S-oplossing te verkrijgen, lost u 100 mg van het Alizarine rode S poeder op in 50 mL van een 0,9% NaCl-oplossing onder constant roeren en verwarmen tot 50 °C op een magneet roer plaat met verwarmingsfunctie. Om mogelijke precipitaten te verwijderen, filtert u de verkregen oplossing. Stel de pH van de Alizarine Red S-oplossing in op pH 4,2 door het toevoegen van natriumhydroxide of zoutzuur dienovereenkomstig.
        Opmerking: voordat elke toepassing van de Alizarine Red S-oplossing ervoor zorgt dat de pH wordt gecorrigeerd naar 4,2 en dat er geen precipitaten in de oplossing zijn. De oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard. Bewaar de oplossing niet langer dan 4 weken.
    2. Plaats de gesplitste corneale knoppen in Petri schaaltjes met de endotheliale zijde naar boven gericht om de endotheelcellen te vlekken. Gebruik een pipet om de 0,25% trypan Blue Solution druppel per druppel te druppelen op het corneale endotheel voor 90 s.
      Opmerking: Trypan Blue maakt het mogelijk beschadigde corneale cellen te identificeren met een permeabel membraan omdat het hun kernen kleurt.
    3. Spoel de gesplitste corneale knop 3 x in 0,9% NaCl voorzichtig af in een klein glazen bekerglas. Nogmaals, gebruik een pipet om langzaam de 0,2% Alizarine Red S-oplossing te druppelen door druppel op het corneale endotheel voor 90 S.
      Opmerking: Alizarin Red S vlekken op het membraan van de Descemet, die helpt bij het markeren van celranden in onbeschadigde corneale endotheliale cellen en om vernietigde cellen te markeren wanneer het onderliggende membraan van de Descemet zichtbaar wordt. Ook maakt het gemakkelijk identificeren van grotere vernietigde gebieden.
    4. Voor onderzoek van het bevlekte corneale endotheel volgt u de stappen uitgelegd voor onbevlekt tellen in paragraaf 2,1.

3. analyse van de corneale endotheliale celdichtheid en morfologische parameters

  1. Project tellings pleinen op de Foto's met behulp van een grafische bewerkingssoftware (tabel met materialen).
    1. Open de software en open een beeld van het corneale endotheel door bestand te selecteren | Open | Selecteren.
    2. Projecteer een vierkant met een True-to-scale zijlengte van 100 μm op de afbeelding.
      Opmerking: de volgende stappen van sectie 3.1.2 kunnen worden genegeerd als de weergavesoftware het projecteren van kwadraten op de foto mogelijk maakt. De zijlengte van het vierkant hangt af van de resolutie van de beelden genomen met de camera van de Microscoop en kan worden berekend met de schaalbalk.
      1. De schaalbalk bijsnijden van de foto genomen met de Microscoop: Selecteer het gereedschap Rechthoekig selectiekader op de werkbalk of druk op M, rand de schaalbalk en selecteer vervolgens bewerken | Bijsnijden of druk op CTRL + X.
      2. Klik op bestand | Nieuw (of druk op CTRL + N). Selecteer in het komende venster Klembord in de vervolgkeuzelijst document type . Het aantal getoonde pixels is de zijlengte van het telplein. Noteer de corresponderende pixels voor de andere afbeeldingen en klik op OK.
      3. Selecteer bestand | Nieuw (of CTRL + N). Voeg de breedte en lengte (in pixels) van het telplein in het aanstaande venster toe op basis van de lengte van de schaalbalk. Selecteer achtergrondkleur witen druk vervolgens op OK.
      4. Klik op selecteren | Selecteer alles (of CTRL + A). Selecteer bewerken | Kopiëren (of CTRL + C).
      5. Selecteer de afbeelding van het corneale endotheel geopend in stap 3.1.1. Selecteer bewerken | Plak (of CTRL + V) om het vierkant op de foto van het corneale endotheel in te voegen.
      6. Selecteer de laag van het kwadraat en pas de transparantie aan. Laag selecteren | Laagstijl | Opties voor overvloeien | Dekking instellen op 30% | OK.
      7. Sla de afbeelding op met het geprojecteerde vierkant met een True-to-scale zijlengte van 100 μm. Herhaal dit met de andere afbeeldingen die nodig zijn voor analyse.
  2. Evalueer de endotheliale celdichtheid en morfologische parameters.
    1. Open de afbeeldingen met de geprojecteerde vierkantjes in ImageJ (versie 1.50 i) en gebruik de plug-in CellCounter om de cellen op het vierkant te tellen. Open ImageJ, selecteer bestand | Openen (of CTRL + O) | Selecteer afbeelding.
      Opmerking: ImageJ en de CellCounter PlugIn zijn freeware beschikbaar om online te downloaden.
    2. Selecteer plugins | Cell_Counter | Cel teller | Initialiseren. Tel de endotheliale cellen en noteer het resultaat. Tel op twee zijden van het vierkant de cellen die door de rand van het plein worden gesneden. Tel geen snij cellen aan de andere twee zijden.
    3. Analyseer ten minste zes vierkantjes per hoornvlies uit verschillende gebieden (bijv. drie Foto's, twee vierkantjes per foto) en bepaal de gemiddelde celdichtheid van de corneale endotheel per vierkant (100 μm2). Extrapoleren de endotheliale celdichtheid per 100 μm2 tot 1 mm2 door vermenigvuldiging met 100.
  3. Voor de beoordeling van morfologische veranderingen, aantal Reformatie cijfers (gezamenlijke vergadering van ≥ 4 cellen/celranden in plaats van drie), rozet formaties (karakteristieke rozet vormige verschijning, vijf of meer radiaal gerangschikte cellen rond een vernietigde cel ), of Alizarine rode gebieden (vernietigde cellen) in de geprojecteerde vierkantjes.
    Opmerking: als alternatief kan het nuttig zijn om grotere kwadraten (bijvoorbeeld 200 x 200 μm2) te gebruiken voor morfologische analyse in goed bewaarde monsters om meer representatieve resultaten te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De gepresenteerde dissectie techniek impliceert gedeeltelijke verwijdering van stromale weefsel, resulterend in een dunner cornea monster en dus minder stromale zwelling (Figuur 1 en Figuur 2). Minder stromale zwelling induceert minder afschuiving en knijp krachten die een negatieve invloed hebben op het corneale endotheel, waardoor lagere endotheliale celverlies percentages6. Splitsen corneale knoppen ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een methode voor de bereiding van de corneale knoop knoppen van varkens, die een gestandaardiseerd en voordelig ex vivo corneale endotheliaal orgel cultuur model voor onderzoeksdoeleinden6vertegenwoordigt. Porcine Split corneale knoppen toonden een afname van de endotheliale celdichtheid vergelijkbaar met endotheliale celverliezen waargenomen bij menselijke donor cornea's gekweekt in oogbanken over een periode van twee weken6,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De oprichting van het gepresenteerde onderzoeksmodel werd gesteund door KMU-Innovativ (FKZ: 13GW0037F) van het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Onderwerp
Varkensogenlokaal abbatoir
Substanties
Alizarin rood SSigma-Aldrich, USA
Kweekmedium 1, #F9016Biochrom GmbH, Duitsland
Dulbecco's PBS (1x)Gibco, USA
Fetaal kalfs serumBiochrom GmbH, Duitsland
Zoutzuur (HCl) oplossingeigen productie
Hypotone gebalanceerde zout oplossingeigen productieper 1 L van H2O: NaCl 4,9 g; KCl 0,75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Natriumacetaat x 3 H2O 3,9 g; Natriumcitraat x 2 H2O 1,7 g
Povidon jodium 7,5%, BraunolB. Braun Melsungen AG, Duitsland
Natriumchloride (NaCl) 0,9%B. Braun Melsungen AG, Duitsland
Natriumhydroxide (NaOH) oplossingeigen productie
Trypanblauw 0,4%Sigma-Aldrich, USA
Materialen & Instrumenten
Accu-jet proBrand GmbH, Duitsland
Bekerglas 50 mLSchott AG, Duitsland
Stompe cannula incl. Filter (5 µm) 18GBecton Dickinson, USA
Celcultuurplaat (12 putjes)Corning Inc., USA
Colibri pincetGeuder AG, Duitsland
HoornmesGeuder AG, Duitsland
Eppendorf pipetEppendorf AG, Duitsland
OogbolhouderL. Klein, Duitsland
OogschaarGeuder AG, Duitsland
Gevouwen Filter ø 185 mmWhatman, USA
HockeymesGeuder AG, Duitsland
Laboratoriumglasfles met dop 100 mLSchott AG, Duitsland
MagneetschuimstaafCarl Roth GmbH & Co. KG, Duitsland
MillexGV Filter (5 µm)Merck Millopore Ltd., USA
NaaldhouderGeuder AG, Duitsland
PetrischalenVWR International, USA
PipetpuntenSarstedt AG & Co., Duitsland
Scalpael (eenmalig gebruik), driehoekige klingAesculap AG & Co. KG, Duitsland
Serologische pipet 10 mLSarstedt AG & Co., Duitsland
Serologische pipet 5 mLSarstedt AG & Co., Duitsland
Steriele cupsGreiner Bio-One, Österreich
Steriele handschoenenPaul Hartmann AG, Duitsland
Steriele chirurgische doekPaul Hartmann AG, Duitsland
NaaischarenGeuder AG, Duitsland
Sutuur Ethilon 10-0 Polyamid 6Ethicon Inc., USA
Spuit (5 mL)Becton Dickinson, USA
trephine ø 7,5 mmeigen productie
Bindende pincetGeuder AG, Duitsland
WeegpapierneoLab Migge GmbH, Duitsland
Apparatuur & Software
Binoculair chirurgisch microscoopCarl Zeiss AG, Duitsland
Camera op microscoop gemonteerdOlympus, Japan
CellSens Entry (software)Olympus, Japan
Koud-lichtbronSchott AG, Duitsland
IncubatorHeraeus GmbH, Duitsland
Omgekeerde fasecontrastmicroscoopOlympus GmbH, Duitsland
Magneetroerder met verwarmingsfunctieIKA-Werke GmbH & Co. KG, Duitsland
pH-meter pHenomenalVWR International, USA
Photoshop CS2Adobe Systems, USA
PrecisieschaalOhaus Europe GmbH, Zwitserland

Referenties

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Hoornvliesendotheelcellenreductie van stroma-zwellingendotheelceldichtheidbeoordeling via lichtmicroscopiehypotone gebalanceerde zoutoplossingTrypanblauw-kleuringAlizarine Rood S-kleuringcelkweekincubatie
Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.