Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie

Samenvatting

Nanoschaal beeldvorming van klinische weefselmonsters kan het begrip van ziekte pathogenese verbeteren. Expansie pathologie (ExPath) is een versie van expansie microscopie (ExM), aangepast voor compatibiliteit met standaard klinische weefselmonsters, om de nanoschaal configuratie van biomoleules te verkennen met conventionele diffractie beperkte microscopen.

Samenvatting

In de moderne pathologie speelt optische microscopie een belangrijke rol bij de diagnose van de ziekte door microscopische structuren van klinische specimens te onthullen. De fundamentele fysieke diffractie-limiet voorkomt echter ondervraging van de anatomie van nanoschaal en subtiele pathologische veranderingen bij het gebruik van conventionele optische beeldvormings benaderingen. Hier beschrijven we een eenvoudig en goedkoop protocol, genaamd Expansion pathologie (ExPath), voor optische beeldvorming op nanoschaal van veelvoorkomende soorten van klinisch primaire weefsel specimens, waaronder zowel vaste-bevroren of formalin-vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel Secties. Deze methode omzeilt de optische diffractie grens door de weefselmonsters chemisch te transformeren in weefsel-hydrogel hybride en ze fysiek uit te breiden op meerdere schalen in zuiver water. Als gevolg van expansie worden voorheen niet-omgezette moleculen gescheiden en kunnen ze dus worden geobserveerd met een conventionele optische Microscoop.

Inleiding

Onderzoek naar de moleculaire organisatie van weefsels in een driedimensionale (3D) context kan een nieuw begrip van biologische functies en ziekte ontwikkeling bieden. Echter, deze nanoschaal omgevingen zijn buiten de resolutie capaciteiten van conventionele diffractie beperkt microscopen (200 − 300 nm), waarbij de minimale omgezet afstand, d wordt gedefinieerd door d α λ/na. Hier λ is de golflengte van licht en na is het numerieke diafragma (na) van het beeldvormings systeem. Recentelijk is directe visualisatie van fluorescently gelabelde moleculen mogelijk gemaakt door nieuw ontwikkelde beeldvormingstechnieken met superresolutie^1,2,3, inclusief gestimuleerde emissie depletie (STED), Foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), en gestructureerde verlichtings microscopie (SIM). Hoewel deze beeldvormingstechnieken een revolutie hebben teweeggebracht in de biologische functie op nanoschaal, zijn ze in de praktijk vaak afhankelijk van dure en/of gespecialiseerde apparatuur en beeldverwerkings stappen, kunnen ze een langzamere acquisitie tijd hebben in vergelijking met conventionele optische beeldvorming, vereisen fluoroforen met specifieke kenmerken (zoals fotoswitchingvermogen en/of hoge foto stabiliteit). Daarnaast blijft het een uitdaging om 3D Super-Resolution Imaging op weefsel specimens uit te voeren.

Expansie microscopie (EXM), voor het eerst geïntroduceerd in 2015⁴, biedt een alternatieve manier van Imaging nanoschaal kenmerken (< 70 nm) door fysiek groeiende bewaard gebleven monsters ingebed in een opzwelbaar polyelektrolyt hydrogel. Hier worden belangrijke biomoleules en/of labels in situ verankerd aan een polymeer netwerk dat isotopen kan worden uitgebreid na chemische verwerking. Omdat de fysieke expansie de totale effectieve resolutie verhoogt, kunnen moleculen van belang dan worden opgelost met conventionele diffractie-beperkte beeldvormingssystemen. Sinds de publicatie van het oorspronkelijke protocol, waarbij aangepaste gesynthetiseerde fluorescerende labels werden verankerd aan het polymeer netwerk⁴, zijn nieuwe strategieën gebruikt om direct eiwitten (eiwit retentie EXM of proexm) te verankeren^{5, 6,7,8,9} en RNA^9,10,11,12 aan de hydrogel, en verhoog de fysieke vergroting door iteratief uitbreiding¹³ of aanpassing gel^{chemie 8,14,15}.

Hier presenteren we een aangepaste versie van proExM, genaamd Expansion pathologie (ExPath)¹⁶, die is geoptimaliseerd voor klinische pathologie-formaten. Het protocol converteert klinische monsters, waaronder formalin-Fixed paraffine-ingebed (FFPE), hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd, en vriesverse menselijke weefsel specimens die op glazen platen zijn gemonteerd, in een toestand die verenigbaar is met ExM. Eiwitten worden vervolgens verankerd aan de hydrogel en mechanische homogenisatie wordt uitgevoerd (Figuur 1)¹⁶. Met een 4-voudige lineaire expansie van de monsters, kunnen Multicolor superresolutie (~ 70 nm) beelden worden verkregen met behulp van een conventionele confocale Microscoop met slechts een ~ 300 nm resolutie en kan ook worden gecombineerd met andere Super-Resolution Imaging technieken.

Protocol

1. bereiding van voorraad reagentia en-oplossingen

1. De onderdelen van de geleer-oplossing voorbereiden.
   Opmerking: oplossings concentraties worden gegeven in g/ml (w/v-percentage).
   1. Maak de volgende stockoplossingen: 38% (w/v) natriumacrylaat (SA), 50% (w/v) acrylamide (AA), 2% (w/v) N, N′-methyleenebisacrylamide (bis) en 29,2% (w/v) natriumchloride (NaCl). Los de verbindingen op in dubbel gedeïoniseerd water (ddH₂O). De bedragen in tabel 1 als referentie gebruiken; bereide oplossingen kunnen naar behoefte omhoog of omlaag worden geschaald. Als u bijvoorbeeld 10 mL van een 38% (w/v) SA-oplossing wilt maken, voegt u 1,9 g SA toe aan een gegradueerde cilinder van 10 mL en voegt u ddH₂O toe aan een volume van 5 ml.
   2. Bereid 9,4 mL monomeer oplossing met een concentratie van 1,06 x, zoals weergegeven in tabel 1.
      Opmerking: Dit zal resulteren in een 1x concentratie na toevoeging van de initiator, Accelerator, en inhibitor. De monomeer kolf kan gedurende maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard, of bij-20 °C voor langdurige opslag.
   3. Bereid de volgende voorraadoplossingen afzonderlijk in DDH₂O: 0,5% (w/v) van de remmer 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), die de gelatie remt om diffusie van de geleer oplossing in weefsels mogelijk te maken, 10% (v/v) initiator tetramethylethylenediamine (TEMED), die versnelt radicale generatie door ammonium persulfate (APS), en 10% (w/v) APS die het geleer proces initieert.
      Opmerking: Stock oplossingen van 4HT en TEMED kunnen in 1 mL aliquots worden bereid en gedurende ten minste 6 maanden bij-20 °C worden bewaard. APS is gebleken om de werkzaamheid na lange termijn opslag te verliezen en is het best voorbereid in kleine hoeveelheden (< 0.1 mL) onmiddellijk voor het Gelling.
2. Spijsvertering buffer voorbereiden (50 mM tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] nonionische oppervlakteactieve stof, 0,8 M NaCl) door 25 mL 1 M Tris pH 8 (3,03 g van tris base in 25 mL ddH₂O) te combineren, 25 ml EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g nonionische oppervlakteactieve stof en 23,38 g NaCl. Voeg ddH₂O toe voor een totaal volume van 500 ml.
   Opmerking: De oplossing kan zo nodig omhoog of omlaag worden geschaald en bij 4 °C worden bewaard. Proteinase K (ProK) wordt onmiddellijk vóór de vergistings stap toegevoegd.
3. Bereid 20 mM Natriumcitraat oplossing door 2,941 g Natriumcitraat tribasidihydraat te combineren met 500 mL ddH₂O en de pH aan 8,0 bij kamertemperatuur (RT) aan te passen. Schaal het volume van de voorraad indien nodig.
4. Bereid een stamoplossing van 6-((acryloyl) amino) hexanoïnezuur, succinimidyl Ester (acryloyl-X, SE; AcX), de verankerings verbinding. Los acx op in 500 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) voor een uiteindelijke concentratie van 10 mg/ml.
   Opmerking: De oplossing kan worden opgeslagen in een drooghoudende omgeving bij-20 °C bij 20 μL aliquots.
5. Als u geen commercieel verkrijgbare buffers voor immunokleuring gebruikt, bereidt u de blokkerende buffer voor. Gebruik een blokkerende buffer van 5% (v/v) normaal dierlijk serum en 0,1% (w/v) nonionische oppervlakteactieve stof in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en selecteer het serum op basis van het hostdier van de secundaire antilichamen. Om bijvoorbeeld de blokkerende buffer van 500 mL voor in geit gegroeide antilichamen te bereiden, combineert u 25 mL geit serum, 0,45 g nonionische oppervlakteactieve stof en 1x PBS tot een volume van 500 mL.

2. bereiding van gearchiveerde en vers bereide klinische weefsel glaasjes voor ExPath

1. Zet het weefsel om in een ExPath compatibel formaat. Kies een van de vier volgende stappen (2.1.1 − 2.1.4) op basis van de voorbereiding van het preparaat: FFPE-dia's, gekleurd FFPE-dia's of niet-vaste of vaste bevroren weefsel dia's in de optimale snijtemperatuur (OCT)-oplossing.
   Opmerking: deze zijn gebaseerd op standaard herstel stappen voor pathologie-samples en zijn niet specifiek voor het ExPath-protocol.
   1. FFPE klinische monsters
      1. Bereid 30 mL 95% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol voor. Meet 30 mL xyleen, 100% ethanol en ddH₂O.
      2. Plaats de glijbaan met het monster in een conische 50 mL met een tang en voeg 15 mL xyleen toe. Dop de buis en plaats deze horizontaal op een rondschudapparaat bij ongeveer 60 rpm en inincuberen op RT gedurende 3 minuten voor elke oplossing. Herhaal dit met de resterende 15 mL xyleen.
      3. Herhaal stap 2.1.1.2 met 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol en ddH₂O in plaats van xyleen.
   2. Bevlekt en gemonteerde permanente dia's
      1. Plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje en dek af met xyleen. Verwijder voorzichtig de dekslip met een scheermesje. Als de Afdeklijst niet gemakkelijk wordt verwijderd, keert u de dia terug naar de xyleen totdat de Afdeklijst loskomt.
      2. Proces met behulp van de stappen voor FFPE-voorbeelden (stappen 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
         Opmerking: In het geval van H & E gekleurd glijbanen worden de vlekken geëlimineerd tijdens het uitbreidingsproces.
   3. Niet-vaste bevroren weefsel dia's in de LGO-oplossing
      1. Fixeer het weefsel in aceton bij-20 °C gedurende 10 minuten.
      2. Was de samples met 1x PBS-oplossing 3 keer gedurende 10 minuten per RT.
   4. Eerder vaste, bevroren klinische weefsel glaasjes
      1. Inbroed de glaasjes gedurende 2 minuten bij RT om de LGO-oplossing te smelten.
      2. Was het monster met 1x PBS-oplossing 3 keer gedurende 5 minuten per RT.
2. Voer warmtebehandeling voor antigeen opvraging op alle monsters na formaatconversie.
   1. Voeg 20 mM citraat oplossing (pH 8 op RT) toe in een hittebestendige container, zoals een dia-kleurenpot.
      Opmerking: Er moet voldoende oplossing voor het weefsel gemonteerd op de dia (50 mL voor een standaard dia kleuring jar).
   2. Verwarm de citraat oplossing tot 100 °C in de magnetron en plaats de glijbaan in de oplossing. Breng de container onmiddellijk over naar een incubatie kamer en inbroed gedurende 30 minuten bij 60 °C.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Dia's kunnen worden geplaatst in Petri schalen en bedekt met 1x PBS en bewaard bij 4 °C.
3. Beits het monster met behulp van standaard immunofluorescentie (IF)/Immunohistochemistry (IHC) kleurings protocollen.
   Opmerking: specifieke primaire en secundaire antilichaamconcentraties en kleurings duur zijn afhankelijk van de door de fabrikant voorgestelde concentraties of door optimalisatie voor het specifieke experiment.
   1. Gebruik een hydrofobe pen om een grens rond de weefsel sectie (en) op de dia te tekenen om het volume van de oplossing die nodig is om het weefsel te bedekken te minimaliseren. Plaats de dia in een schaaltje dat groot genoeg is om in de glijbaan te passen. Voor een standaard 3-inch glijbaan, gebruik een 100 mm Petri schaal.
      Opmerking: De hydrofobe pen interfereert niet met de polymerisatie van het monster of het verteringsproces.
   2. Inbroed het weefsel met blokkerende buffer voor 1 uur bij 37 °C, 2 uur bij RT, of 4 °C 's nachts om niet-specifieke binding te verminderen.
   3. Verdun primaire antilichamen tegen de gewenste concentratie in de juiste hoeveelheid voorbereide blokkerende buffer (of een andere voorkeurs kleurings buffer). Inbroed de weefsels met de primaire antilichaam oplossing gedurende ten minste 3 uur bij RT of 37 °C, of 's nachts bij 4 °C.
      Opmerking: Monsters moeten in een bevochtigde container worden geplaatst (zoals een Petri schaaltje met een vochtig doekje) om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Meestal zijn antilichamen verdund tot 1:100 − 1:500 in 200 − 500 μL buffer, afhankelijk van de weefsel grootte en het gebruikte antilichaam.
   4. Was het weefsel met de voorbereide blokkeerbuffer (of een andere voorkeurs wasbuffer) 3 keer gedurende 10 minuten bij RT.
   5. Verdunde secundaire antilichamen (en 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI] indien gewenst), in bereide blokkerende buffer (of andere voorkeurs kleurings buffer) tot een concentratie van ongeveer 10 μg/mL. Inbroed het weefsel in de secundaire antilichaam oplossing gedurende ten minste 1 uur bij RT of 37 °C.
      Opmerking: De timing kan worden aangepast afhankelijk van de gebruikte antilichamen en de dikte van het weefsel. Secundaire antilichamen met cyanine kleurstoffen (Cy3, Cy5, Alexa 647) zijn niet compatibel met het ExM-protocol bij toepassing van pre-polymerisatie. Voorgestelde kleurstoffen zijn Alexa 488 (groen), Alexa 546 (oranje/rood) en ATTO 647N of CF633 (far-Red). DAPI moet na uitbreiding opnieuw worden toegepast, omdat deze tijdens het uitbreidingsproces wordt weggewassen.
   6. Was het weefsel met de bereide blokkeerbuffer (of een andere voorkeurs wasbuffer) 3 maal gedurende 10 minuten per RT.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Dia's kunnen worden geplaatst in Petri schalen en bedekt met 1x PBS en bewaard bij 4 °C.
   7. Voer fluorescerende beeldvorming uit met behulp van een conventionele breedveld Microscoop, confocale Microscoop of ander beeldvormings systeem naar keuze.
      Opmerking: Deze stap is nodig om de biologische lengte te bepalen aan de hand van de uitbreidings factor door afbeeldingen vóór en na de uitbreiding te vergelijken. Om de beeldvorming na de uitbreiding te vergemakkelijken, moeten gemakkelijk identificeerbare gebieden worden geselecteerd en moeten afbeeldingen bij zowel lage als hoge vergrotingsfactor worden verzameld.

3. polymerisatie van specimens in situ

1. Inincuberen van het preparaat in verankerings oplossing.
   1. Bereid de verankerings oplossing (meestal is 250 μL voldoende om de weefsel sectie te bedekken) door de AcX-stamoplossing in 1x PBS te verdunten tot een concentratie van 0,03 mg/mL voor monsters die zijn bevestigd met niet-aldehyde fixeermiddelen of 0,1 mg/mL voor monsters met aldehyde fixativa , die minder gratis amines beschikbaar hebben om met AcX te reageren.
   2. Plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje en Pipetteer de verankerings oplossing over het weefsel. Inincuberen gedurende ten minste 3 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
2. Inincuberen van de monsters in geleer oplossing.
   1. Bereid ten minste 100-voudige overtollige hoeveelheid geleer oplossing. Per 200 μL, het volgende combineren, in volgorde: 188 μL monomeer oplossing, 4 μL van 0,5% 4HT stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie: 0,01%), 4 μL van 10% TEMED stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%), en 4 μL 10% APS stockoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%).
      Opmerking: Gelling-oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden gemaakt. De oplossing moet op 4 °C worden gehouden en de APS-oplossing moet als laatste worden toegevoegd om te voorkomen dat er voortijdige Gelling wordt.
   2. Verwijder de overtollige oplossing uit de weefsel sectie en plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg verse, koude geleer oplossing toe aan het monster en inbroed het mengsel op het weefsel gedurende 30 minuten bij 4 °c, om de diffusie van de oplossing in het weefsel mogelijk te maken.
3. Bouw een kamer op de glijbaan rond het monster (Figuur 2a) zonder de geleer-oplossing te verstoren.
   1. Maak spacers voor de geleer kamer door dun gesneden stukjes afdekglas met behulp van een diamant mes.
      Opmerking: Om de uitbreiding van de Imaging post te vergemakkelijken, moeten de spacers dicht in de dikte van het weefsel specimen zijn om de hoeveelheid lege gel boven het weefsel te verminderen. Nummer 1,5 glas kan worden gebruikt voor standaard klinische monsters (5 − 10 μm). Afdekglas stukken kunnen worden gestapeld voor dikkere samples.
   2. Bevestig de spacers aan beide zijden van het weefsel met behulp van druppeltjes water (~ 10 μL).
   3. Plaats een afdekglas voorzichtig over de glijbaan en voorkom dat er luchtbelletjes over het weefsel worden overgevuld (Figuur 2B).
4. Inincuberen van het monster bij 37 °C in een bevochtigde omgeving (zoals een gesloten Petri schaaltje met een vochtig doekje) gedurende 2 uur.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. De schuif kamer kan worden opgeborgen in een verzegelde Petri schaal bij 4 °C.

4. monster spijsvertering

1. Verwijder de deksel van de geleer kamer door voorzichtig een scheermesje onder de afdekplaat te schuiven en langzaam de afdekplaat van het geloppervlak te tillen. Trim de lege gel rond het weefsel om het volume te minimaliseren. Snijd de gel asymmetrisch om de oriëntatie van de gel na homogenisatie te volgen, omdat het monster transparant zal worden.
   1. Verdun ProK door 1:200 in de verterings buffer (eindconcentratie 4 U/mL) voor gebruik. Bereid genoeg oplossing om de gel volledig te onderdompelen; een enkele put van een vier-goed kunststof celkweek plaat vereist ten minste 3 mL per put.
   2. Inbroed het monster in een gesloten recipiënt met de digestie buffer voor 3 uur bij 60 °C. Als het monster tijdens de spijsvertering niet van de glijbaan loskoppelt, gebruik dan een scheermesje om het monster voorzichtig te verwijderen.
      Opmerking: Het preparaat moet volledig worden ondergedompeld in de verterings buffer om te voorkomen dat het monster uitdroogt en in een overdekte container wordt geplaatst (kleine Slide box, plastic put, Petri schaaltje, enz.) die met film kan worden verzegeld.

5. voorbeeld uitbreiding en beeldvorming

1. Gebruik een zachte verfborstel om het preparaat over te brengen naar 1x PBS in een container die compatibel is met het gewenste beeld systeem en groot genoeg voor de volledig uitgebreide gel. Zorg ervoor dat het weefsel wordt geplaatst met de monster zijde naar beneden als Imaging op een omgekeerde systeem of omhoog als Imaging op een Upright-systeem om de afstand van de Imaging doelstelling naar het monster te minimaliseren. Draai de gel indien nodig met een zachte verfkwast.
   Opmerking: Zijverlichting van een LED kan worden gebruikt om ze zichtbaar te maken in vloeistof. Een standaard 6-well plaat kan geschikt zijn voor monsters met een voorgeëxpandeerde diameter van minder dan 0,6 cm. Een glazen bodemplaat moet worden gebruikt voorbeeld vorming op een omgekeerd systeem.
2. Was de monsters in 1x PBS bij RT gedurende 10 minuten. Indien gewenst, herbeits het monster met 300 nM DAPI als het verteringsproces de DAPI vlek wegspokt. Verwijder PBS en vlek met 300 nM DAPI verdund in 1x PBS gedurende 20 minuten bij RT, gevolgd door een Wash van 10 min met 1x PBS bij RT.
   Opmerking: De monsters kunnen worden bedekt met 1x PBS en worden opgeslagen bij 4 °C voordat u verdergaat met de volgende stap.
3. Om de samples uit te breiden, vervang je de PBS en was je met een teveel aan ddH₂O (ten minste 10x het uiteindelijke gelvolume) 3 − 5 keer gedurende 10 minuten, bij RT.
   Opmerking: Na de 3^RD of 4^th Wash, de uitbreiding van het preparaat moet beginnen te plateau. Voor opslag, om bacteriële groei te voorkomen, kan de ddH₂O worden aangevuld met 0.002% − 0,01% natrium natriumazide (Nan₃). In dit geval wordt de uiteindelijke expansie factor omkeerbaar verlaagd met 10%.
4. Fluorescentie Imaging uitvoeren met behulp van een conventionele breedveld Microscoop, confocale Microscoop of ander beeldvormings systeem naar keuze.
   Opmerking: Om te voorkomen dat gels drijven, kan overtollige vloeistof uit de put worden verwijderd. Gels kunnen ook worden geïmmobiliseerd met 1.5 − 2% laag smelt agarose. Bereid 1,5 − 2% (w/v) laag smelt agarose in water in een container 2 − 4 maal het volume van de oplossing. Verwarm de oplossing in een waterbad van 40 °C of in een magnetron voor 10 − 20 s om de oplossing te smelten. Pipetteer de gesmolten agarose rond de randen van de gel. Na het toelaten van de agarose te harden op RT of 4 ° c, voeg water aan het monster om uitdroging te voorkomen.

Resultaten

Als het protocol met succes is uitgevoerd (Figuur 1), worden de monsters na de mechanische homogenisatie (Figuur 3a) als een platte en doorzichtige gel weergegeven en kunnen deze met een factor 3 − 4,5 x in water worden uitgebreid (Figuur 3B). het bieden van een effectieve resolutie van ~ 70 nm afhankelijk van de uiteindelijke expansie factor en imaging systeem gebruikt^5...

Discussie

Hier presenteren we de ExPath protocol¹⁶, een variant van proExM⁵ die kan worden toegepast op de meest voorkomende soorten klinische biopsie monsters gebruikt in pathologie, met inbegrip van ffpe, H & E gekleurd, en vers-bevroren specimens op glazen glijbanen. Format conversie, antigeen retrieval en immunokleuring van de specimens volgen veelgebruikte protocollen die niet specifiek zijn voor ExPath. In tegenstelling tot het oorspronkelijke proExM protocol^9...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Remmer
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Aceton	Fischer Scientifc	A18-500
Acryamide	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Ammoniumpersulfaat (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiator
Anti-ACTN4-antilichaam geproduceerd in konijn	Sigma Aldrich	HPA001873
Anti-Collageen IV-antilichaam geproduceerd in muis	Santa Cruz Biotech	sc-59814
Anti-Vimentin-antilichaam geproduceerd in kip	Abcam	ab24525
Aqua Hold II hydrofobe pen	Scientific Device	980402
Breast Common Disease Tissue Array	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	Kernkleurstof
Diamantmesje nr. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE-niermonster	USBiomax	HuFPT072
Pincet
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A	Biotium	20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633	Biotium	20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	Kan worden vervangen door een niet-commerciële kleurstofbuffer naar keuze.
MAXblock Blocking Medium	Active Motif	15252	Kan worden vervangen door een niet-commerciële blokkeringsbuffer naar keuze.
MAXwash Washing Medium	Active Motif	15254	Kan worden vervangen door een niet-commerciële wasbuffer naar keuze.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethyleendiamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Versneller
N,N′-Methyleenbisacrylamide	Sigma Aldrich	M7279
Normaal geitenserum	Jackson Immunoresearch	005-000-121	Voor het bereiden van blokkeringsbuffer. Afhankelijk van de dierlijke gastheer van secundaire antilichamen.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063	Meervoudige plastic kweekschaal
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbitale schudder
Verfkwast
pH Meter
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 10x-oplossing	Fischer Scientifc	BP399-1
Kunststof Petri-schaal (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Veiligheidsmes	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1,5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2,0 mL	Thermo Fisher	3459
Natriumacrylaat	Sigma Aldrich	408220
Natriumchloride	Sigma Aldrich	S6191
Natriumcitraat tribasisch dihydraat	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tarwekiemenagglutinine gelabeld met CF640R	Biotium	29026
Xyleen	Sigma Aldrich	214736