Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60250

⸱

25 oktober 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een ijsvrije cryopreservatie-methode voor grote hoeveelheden rat hepatocyten waarbij primaire cellen worden voorgeïnpoleerd met cryoprotective agenten in een lage concentratie en verglaasd in grote druppels.

Samenvatting

Vitrificatie is een veelbelovend ijsvrij alternatief voor klassiek langzaam invriezen (bij ongeveer 1 °C/min) cryopreservering van biologische monsters. Vitrificatie vereist extreem snelle koelsnelheden om de overgang van water in de glas fase te bereiken, terwijl schadelijke ijsvorming wordt vermeden. Hoewel pre-incubatie met cryoprotective agents (CPA) de kritische koelsnelheid van biologische monsters kan verminderen, zijn hoge concentraties in het algemeen nodig om ijsvrije cryopreservering door vitrificatie mogelijk te maken. Hierdoor wordt vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit en beperkt tot kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes verglazing. Met behulp van deze nieuwe methode worden cellen eerst vooraf geïnincubeerd met een lage intracellulaire CPA-concentratie. Door gebruik te maken van snelle osmotische uitdroging, is de intracellulaire CPA direct voor vitrificatie geconcentreerd, zonder de noodzaak om toxische CPA-concentraties volledig te equilibraten. De cellulaire uitdroging wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat en geïntegreerd met continue hoge doorvoer generatie van groot formaat druppels die zijn verglaasd in vloeibare stikstof. Deze Ice-Free cryopreservatie-methode met minimale CPA-toxiciteit is geschikt voor grote celhoeveelheden en resulteert in een verhoogde levensvatbaarheid van hepatocyten en metabole functie in vergelijking met klassieke langzaam invriezing cryopreservatie. Dit manuscript beschrijft de methoden voor een succesvolle verglazing van de bulk druppel in detail.

Inleiding

Verlies van de levensvatbaarheid van de cel en metabole functie na cryopreservatie van hepatocyten is nog steeds een belangrijk probleem dat de klinische toepassingen beperkt1,2,3. De benchmark methode van hepatocyte cryopreservatie is traag invriezen, die wordt uitgevoerd door het pre-incuberen van de hepatocyten met CPA (dimethylsulfoxide [DMSO], glucose en albumine) en daaropvolgende gecontroleerde snelheid bevriezing (bij ongeveer 1 °c/min) tot cryogene temperaturen4,5. Ondanks veel gerapporteerde optimalisaties blijven CPA-toxiciteit samen met schadeveroorzakende osmotische onevenwichtigheden tijdens het invriezen en mechanische stress van ijsvorming fundamentele nadelen van traag bevriezen van6,7.

Vitrificatie biedt een voordeel ten opzichte van langzaam invriezen in dat letsel als gevolg van ijsvorming wordt volledig vermeden door een directe faseovergang van water in de glas staat6. Om de Glasovergangstemperatuur van zuiver water (-137 °C) te bereiken, moet het water echter worden gekoeld tegen snelheden in de volgorde van 1.000.000 graden Celsius per seconde (d.w.z. de kritische koelsnelheid) om ijsvorming boven de glazen overgangstemperatuur te voorkomen8 . Toevoeging van Ocmw's kan de kritische koelsnelheid verlagen en de Glasovergangstemperatuur van waterige oplossingen9verhogen. Echter, zelfs met hoge CPA-concentraties (bijv. 40% v/v DMSO of hoger) zijn de snelle koelsnelheden niettemin vereist voor een succesvolle verglavering van8,9.

De vereiste koelsnelheden en hoge CPA-concentraties resulteren in twee belangrijke nadelen van vitrificatie. Ten eerste, om snelle koeling mogelijk te maken, moeten de monsters een lage thermische massa hebben. Ten tweede, om hoge CPA-concentraties te bereiken terwijl osmotische schade wordt vermeden, moet de Ocmw's langzaam worden ingevoerd en volledig worden geëscaleerd tussen de intra-en extracellulaire compartimenten6. Dit verhoogt de blootstellingstijd van cellen tot toxische Ocmw's. Samen maakt dit de verglavering tot een omslachtig proces dat beperkt is tot enkele kleine samples (micro liters) tegelijkertijd. Droplet-vitrificatie is voorgesteld als een mogelijke oplossing voor deze beperkingen. Door minuscule cel-beladen druppeltjes (nanoliters) aan vloeibare stikstof bloot te stellen, wordt de koelsnelheid aanzienlijk verhoogd, waardoor een aanzienlijke reductie van de CPA-concentratie mogelijk is10,11,12 ,13,14. Hoewel meerdere hoogfrequente druppel genererende nozzles gelijktijdig kunnen worden gebruikt, beperkt de extreem kleine druppelgrootte de doorvoer tot micro liters per minuut10, wat een efficiënte verglazing van grote cellen uitsluit volumes met magnitudes hogere verwerkingssnelheden op de orde van milliliter per minuut.

Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen van vitrificatie kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes vitrificatie15. Deze nieuwe methode maakt gebruik van snelle osmotische dehydratie om een intracellulaire CPA-concentratie van 7,5% v/v ethyleenglycol en DMSO onmiddellijk voorafgaand aan vitrificatie te concentreren, waardoor de noodzaak van volledige evenwichting van toxische CPA-concentraties wordt geëlimineerd. De cellulaire dehydratie wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat door een korte blootstelling van de hepatocyten aan een hoge extracellulaire CPA-concentratie. Hoewel deze blootstelling snelle osmotische uitdroging veroorzaakt, is het te kort om de hoge CPA-concentratie te verspreiden in de cellen. Onmiddellijk na uitdroging worden de cellen geladen in druppels die rechtstreeks in vloeibare stikstof worden verglaasd. Deze methode elimineert de noodzaak van volledige intracellulaire opname van hoge CPA-concentraties, terwijl de hoge extracellulaire CPA-concentratie vitrificatie van groot formaat druppels mogelijk maakt, resulterend in hoge doorvoer volumes met minimale CPA-toxiciteit.

Druppel vitrificatie verbetert de levensvatbaarheid op de directe en lange termijn na conservering, evenals de morfologie en metabole functie van primaire rat hepatocyten in vergelijking met klassieke cryopreservatie door Slow-bevriezing15. Dit manuscript verschaft de methodologische Details voor bulk druppel verglazing van primaire rat hepatocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De primaire hepatocyte isolaties voor dit protocol werden uitgevoerd door de Cell resource core (CRC) bij Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Het Animal Protocol (#2011N000111) werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Massachusetts General Hospital.

1. bulk druppel verglazing

  1. Bereid de vitrificatie-oplossingen.
    1. Voeg 40 mg bovien serumalbumine (BSA) toe aan 17,0 mL van de Universiteit van Wisconsin oplossing (UW) om vitrificatie oplossing 1 (v1) te maken. Steriel filter de V1-oplossing met een 0,22 μm-filter en bewaar bij 4 °C.
      Opmerking: UW is een veelgebruikte orgaan conserverings oplossing. Het bevat 50 g/L hydroxyethyl zetmeel, 35,83 g/L lactobionic acid, 3,4 g/L kalium fosfaat monobasic, 1,23 g/L magnesiumsulfaat heptahydraat, 17,83 g/L raffinose pentahydraat, 1,34 g/L adenosine, 0,136 g/L Allopurinol, 0,992 g/L totaal glutathion, 5,61 g /L kaliumhydroxide en natriumhydroxide om de pH op 7,4 aan te passen.
    2. Combineer 7,0 mL van UW, 6,5 mL DMSO, 6,5 mL ethyleenglycol (bv), 40 mg BSA, en 5,48 g sucrose om vitrificatie oplossing 2 (v2) te maken. Steriel filter de v2-oplossing met een 0,22 μm-filter. Laad 3,5 mL steriele gefilterde v2-oplossing in een doseerspuit van 3 mL en bewaar deze bij 4 °C.
      Opmerking: om het oplossen van de Ocmw's te vergemakkelijken, worden oplossingen in grotere hoeveelheden bereid dan vereist.
  2. Bereid het verglazing apparaat van de bulk druppel.
    1. Om de mengnaald voor te bereiden, moet u eerst langs één zijde van de buitenste grijze huls van de mengnaald snijden en vervolgens de huls open buigen om deze van de mengnaald te verwijderen.
    2. Schuif 2 25 mm silicone buis secties over de inlaten van de mengnaald en bevestig hun positie met lijm (Figuur 1A).
    3. Snijd de naald tot een lengte van 20 mm (d.w.z. de lengte van de binnenste Meng spiraal) zoals afgebeeld in Figuur 1a.
      Opmerking: de mengnaald lengte is evenredig aan het volume in de naald en kan daarom worden gewijzigd om de blootstellingstijd van de hepatocyten te regelen tot de hoge CPA-concentratie oplossing.
    4. Steek de afsluit opening van de mengnaald in een injectienaald van 20 G (Figuur 1B).
      Opmerking: de grootte van de injectienaald beïnvloedt de grootte van de druppel.
    5. Steriliseer de mengnaald assemblage door Autoclaveren.
    6. Vul een steriele Dewar met vloeibare stikstof. Steriliseren de buitenkant van de Dewar met isopropanol voor het plaatsen van de Dewar in een steriele laminaire flow Cell cultuur kap.
      Opmerking: verontreiniging is een belangrijke overweging bij directe blootstelling van de druppels aan vloeibaar stikstof. Hoewel er geen besmetting met niet-gesteriliseerde vloeibare stikstof in het huidige protocol was, kan vloeibare stikstof worden gefilterd of bestraald om de steriliteit te garanderen indien nodig16.
    7. Plaats een trechter met dezelfde buitendiameter als de binnendiameter van de vloeibare stikstof-Dewar in een conische buis van 50 ml om het druppel verzamelapparaat te maken (Figuur 1C−E).
    8. Dompel de druppel verzameling apparaat in de vloeibare stikstof door het langzaam in de uiteindelijke verticale positie te drukken met behulp van grote Tang. Zorg ervoor dat de conische buis in een verticale positie op de bodem van de Dewar rust (Figuur 1D−E).
      Opmerking: de trechter moet in de conische buis worden gestoken en rusten. Het gehalte aan vloeibare stikstof moet 1 cm onder de inlaat hoogte van de trechter liggen, zoals weergegeven in Figuur 1D.
    9. Monteer een spuitpomp in verticale positie op de wand van de celcultuurkap door een snaar van de voeten van de spuitpomp te binden aan schroeven die uitsteken van de celcultuurkap wand.
    10. Plaats de vloeibare stikstof Dewar met de druppel opvanginrichting onder de verticaal gemonteerde spuitpomp (Figuur 1E).
  3. Pre-incuberen met Ocmw's.
    1. Na het verkrijgen van vers geïsoleerde rat hepatocyten, Tel de voorraad concentratie door Trypan blauwe uitsluiting en 40.000.000 levensvatbare Hepatocytes nemen.
      Opmerking: voorzichtige behandeling van hepatocyten in suspensie is essentieel om celdood te voorkomen.
    2. Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 minuten zonder rem.
    3. Aspireren de supernatant en respenderen de hepatocyten in 3,4 mL v1 oplossing.
    4. Incuberen op ijs gedurende 3 minuten.
    5. Voeg 150 μL DMSO en 150 μL EG toe aan de hepatocyten en meng zachtjes.
    6. Incuberen op ijs gedurende 3 minuten.
    7. Nogmaals, Voeg 150 μL DMSO en 150 μL EG toe aan de hepatocyten en meng zachtjes.
    8. Laad 3,5 mL in een 3 mL spuit.
  4. Voer vitrificatie uit.
    1. Plaats de spuit met voorgeïnde hepatocyten en de v2-oplossing spuiten op de spuitpomp adapter.
    2. Bevestig twee vrouwelijke Luer Lock slang Barb adapters aan de spuiten en schuif de Siliconen slang van de mengnaald over de Barb fittingen (Figuur 1F).
    3. Plaats de hele assemblage in de spuitpomp (Figuur 1E).
    4. Drie min na de laatste toevoeging van DMSO en bijvoorbeeld aan de hepatocyten, start de pomp bij 2 mL/min.
    5. Stop de pomp nadat alle hepatocyten zijn toegevoegd aan de vloeibare stikstof.

2. cryogene opslag

  1. Prik 10 kleine gaatjes in de deksel van een conische buis van 50 mL met een 20 G naald en wikkel de buitenkant van het deksel met een flexibele film, zoals afgebeeld in Figuur 1B. Dit creëert een ventiel dat de ontsnapping van verdampende overgebleven vloeibare stikstof mogelijk maakt.
  2. Om de verglaasd hepatocyten druppels te verzamelen, Verwijder eerst de trechter uit de vloeibare stikstof Dewar. Gebruik vervolgens lange tang om de conische buis te nemen die de druppeltjes uit de vloeibare stikstof bevat en giet langzaam de overtollige vloeibare stikstof uit de conische buis.
  3. Sluit de conische buis met het geperforeerde deksel en plaats direct de gesloten conische buis met verglaasd hepatocyten druppels terug in de vloeibare stikstof Dewar.
  4. Overdracht van de conische buis van de vloeibare stikstof in een vloeibare stikstof damp Cryotank.

3. opwarmen van de verglaasd hepatocyten druppels

  1. Bereid de opwarmings oplossing voor.
    1. Los 17,13 g sucrose op in 100 mL DMEM hepatocyte cultuur media om de opwarmings oplossing te maken. Steriel filter de opwarm oplossing met een 0,22 μm filter en warm tot 37 °C.
  2. Opwarmen van de hepatocyten.
    1. Neem de conische buis met verglaasd hepatocyten van de Cryotank en vervoer het in een vloeibare stikstof Dewar naar de cel cultuur kap.
    2. Draai de dop lichtjes los en plaats de conische buis terug in de vloeibare stikstof.
    3. Voeg de verglaasd hepatocyte druppeltjes toe aan een leeg bekerglas, voeg ogenblikkelijk de warme (37 °C) opwarm oplossing toe en roer onmiddellijk 10 sec.
      Opmerking: het is van cruciaal belang om snel te werken om bevriezing tijdens het opwarmen te voorkomen. Afhankelijk van de onderzoekseisen kunnen enkele tot alle verglaasd druppels tegelijk worden opgelicht.
  3. De opwarm oplossing lossen.
    1. Verdeel de herverwarmende oplossing met hepatocyten over 2 50 mL conische buizen.
    2. Centrifugeer de twee conische buisjes gedurende 2 minuten bij 100 x g bij 4 °c zonder rem.
    3. Zuig de supernatant op om een totaal volume van 12,5 mL te gebruiken met het Afstudeer teken van de conische buis als referentie en voeg 12,5 mL ijskoude DMEM per conische buis toe om de opwarmings oplossing te verdunnen tot 50%.
    4. Respendeer de hepatocyten en incuberen op ijs gedurende 3 minuten.
    5. Voeg 25 mL ijskoude DMEM per conische buis toe om de opwarm oplossing te verdunnen tot 25%.
    6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 50 x g bij 4 °c zonder rem.
    7. Aspireren de supernatant en respenderen de hepatocyten in 2 mL van het gewenste kweekmedium voor gebruik.
      Opmerking: dichtheidsgradiënt centrifugeren kan worden gebruikt om dode hepatocyten uit de celsuspensie te verwijderen indien gewenst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vers geïsoleerde primaire hepatocyten van vijf verschillende rat levers werden gebruikt voor een directe vergelijking van bulk druppel verglazing naar klassieke cryopreservatie met behulp van de vooraanstaande Slow-Vries protocollen gerapporteerd in de literatuur4, 5. Kortom, de hepatocyten werden opgeschort in uw aangevuld met BSA (2,2 mg/ml), glucose (333 mm), en DMSO (10% v/v) en bevroren met een gecontroleerde frequentie vriezer. Na opslag bij-196 °C werden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cryopreservation van hepatocyten door Slow-bevriezing resulteert in verminderde levensvatbaarheid en metabole functie. Vitrificatie biedt een veelbelovend alternatief voor klassieke cryopreservering, omdat het bevriezen van letsel volledig wordt vermeden9. Echter, pre-incubatie met Ocmw's is nodig om de kritische koelsnelheid te verlagen8. Bijgevolg wordt de vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit17 en beperkt tot kleine monstervolumes. In inspann...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. Drs. de Vries, Weng, toner, Tessier en Uygun hebben voorlopige octrooiaanvragen die relevant zijn voor deze studie. Dr. Uygun heeft een financieel belang bij Organ Solutions, een bedrijf dat zich richt op het ontwikkelen van orgel conserverings technologie. Alle interesses van de onderzoeker worden beheerd door de MGH en partners HealthCare in overeenstemming met hun beleid van belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 en R01DK114506) en het Amerikaanse ministerie van defensie (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wordt sterk erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok TipsFisher Scientific14-823-435
BekerSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW Koude OpslagoplossingBridge to LifeBUW-001
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer Vrouwelijke Luer naar 1/16" laagprofiel semi-rigide slangenbarbel, PPCole-ParmerEW-45508-12
Cryogene opslagtank / CryotankChart IndustriesMVE 800
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
DMEM, poeder, hoge glucose, pyruvaatLife Technologies12800-082
EthyleenglycolSigma-Aldrich107-21-1
Extra lange pincettenFisher Scientific10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifugebuizen - Platte topafsluitingFisher Scientific06-443-18
VislijnStrenSOFS4-15
Vloeibare stikstofAirgas7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
Mix Tips, voor gebruik met 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene Polypropyleen PoedertrechterThermoFisher4252-0100
Naald 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - Flexibele filmSigma-AldrichP7793-1EA
VleesmesFisher Scientific12-640
SpatelCole-ParmerEW-06369-18 
Steriflip steriele filterFisher ScientificSE1M179M6
Sucrose (Kristal/Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificS5-500
SpuitpompNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Vloeibare Stikstof ContainerThermoFisher2122

Referenties

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cryoprotectieve middelenosmotische dehydratiefluidisch apparaatvloeibare stikstofhepatocytviabiliteitmetabole functieopwarmingsoplossingcryoconservering van cellen
Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.