Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen. Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling, systemen en circuits neurowetenschappen, cellulaire fysiologie, ecologie, evolutionaire biologie, en gedrag. Meer recentelijk is er een wildgroei van genomische middelen voor elektrische vissen. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten vergemakkelijkt met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-instrumenten. We rapporteren hier een volledig protocol voor het uitvoeren van CRISPR/Cas9-mutagenese die gebruik maakt van endogene DNA-herstelmechanismen in zwak elektrische vissen. We tonen aan dat dit protocol even effectief is in zowel de mormyrid-soort Brienomyrus Brachyistius als de gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO door crispr/Cas9 te gebruiken om indels en puntmutaties te richten in de eerste Exon van de natrium kanaal gen scn4aa. Met dit protocol werden embryo's van beide soorten verkregen en gegenotypeerd om te bevestigen dat de voorspelde mutaties in de eerste Exon van het natrium kanaal scn4aa aanwezig waren. Het knock-out succes fenotype werd bevestigd met opnames met verminderde elektrische orgel ontlading amplituden in vergelijking met ongeinjecteerde grootte-gematchte controles.
Inleiding
Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Twee lijnen van schip vis, Osteoglossiformes en Siluriformes, evolueerde electroreception parallel, en vijf lijnen van teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, en de geslachten astroscopus, Malapterurus en Synodontis) evolueerde elektro genese parallel. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen1,2,3.
Dit wordt misschien het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Michigan State University.
1. sgRNA-doelen selecteren
Opmerking: Een protocol is beschikbaar voorhand matig ontwerp van sgRNAs in stap 1,1. Dit werd gebruikt voor scn4aa doelselectie. Er is een aanvullend protocol ter vergemakkelijking van dit proces (stap 1,2) met behulp van de EFISHGENOMICS webportaal. Het is aangeraden dat gebruikers Protocol 1,2 selecteren, dat verschillende geautomatiseerde ' checks ' bevat om te zorgen voor succes bij het ontwerpen van sgRNAs voor aange....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De doellocaties van sgRNA werden geïdentificeerd binnen Exon 1 van scn4aa in zowel b. gauderio als b. Brachyistius , zoals beschreven in punt 1. De Sgrna's werden gegenereerd zoals beschreven in paragraaf 2. Na succesvolle sgRNA selectie en synthese (Figuur 1) werd in vitro decolleté getest (Figuur 2). De sgRNAs die in vitro snijden demonstreerden werd vervolgens geselecteerd voor micro injecties met één cel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De fenotypische rijkdom van zwak elektrische vissen, samen met een recente proliferatie van genomics bronnen, motiveert een sterke behoefte aan functionele genomische gereedschappen in het zwak elektrische vismodel. Dit systeem is bijzonder aantrekkelijk vanwege de convergente evolutie van talrijke fenotypische eigenschappen in parallelle lijn afstanden van vissen, die gemakkelijk in het laboratorium worden bewaard.
Het hier beschreven protocol demonstreert de werkzaamheid van de CRISPR/Cas9 t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de heroïsche inspanningen van Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, en Hope Healey voor hulp bij het verzamelen van vis, gegevensverzameling en vroege Protocol ontwikkeling. We willen ook de drie reviewers bedanken voor hun suggesties voor het manuscript. Wij geloven dat het eindproduct van betere kwaliteit is na het aanpakken van hun opmerkingen. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Science Foundation #1644965 en #1455405 aan JRG, en de natuurwetenschappen en Engineering Research Council DG subsidie aan VLS.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| Borosilicate glas capillaire met filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm lengte) |
| Cas9 proteïne met NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton spuit | Fisher Scientific | 14-824-654 | aangeduid als "precision glass syringe" in het protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | aangeduid als "delicate task wipe" in het protocol |
| MEGAscript T7 Transcriptie Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | gebruikt voor in vitro splitsingsassay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | aangeduid als "spawning agent" in het protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | aangeduid als "thermoplastic" in het protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter merk |
| QIAquick PCR Zuiveringskit | Qiagen | 28106 | |
| Herbruikbare naald- vereist aanpassing | Fisher Scientific | 7803-02 | Pas aan op 0,7 inch lang; puntstijl 4 en hoek 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Gebruik met de 10x NEB buffer die is inbegrepen |
| Teflon gecoate gereedschappen | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | aangeduid als "polytetrafluoretheen" in het protocol |
Referenties
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
