Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Summary

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Abstract

De dynamiek van de ontwikkeling kan gevolgd worden door een confocale time-lapse microscopie van levende transgene zebravis embryo's die fluorescentie uitdrukken in specifieke weefsels of cellen. Een probleem bij het opstellen van een hele embryo ontwikkeling is dat zebravis embryo's aanzienlijk groeien. Bij montage zoals regelmatig gedaan bij 0,3-1% laag smelt agarose, legt de agarose groei beperking op, wat leidt tot verstoringen in het zachte embryo lichaam. Maar om confocale timelapse-microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis-embryo's die de beweeglijkheid van de embryo's beperken en tegelijkertijd de onbeperkte groei mogelijk maken. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties. Om te demonstreren de bruikbaarheid van deze methode, hele embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling werd afgebeeld in transgene vis voor 55 opeenvolgende uren. Deze montagemethode kan worden gebruikt voor eenvoudige, laaggeprijsde beeldvorming van hele zebravis embryo's met omgekeerde microscopen zonder eisen van mallen of speciale apparatuur.

Introduction

De zebravis is al lang een modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie, en microscopie is de belangrijkste methode om embryonale ontwikkeling te visualiseren. De voordelen van het gebruik van zebravis embryo's voor ontwikkelingsstudies omvatten kleine afmetingen, optische helderheid, snelle ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid van de volwassen vis. De generatie van transgene zebravis lijnen die fluorescentie in bepaalde weefsels of cellen uitdrukken, heeft een directe visualisatie van weefsel ontwikkeling mogelijk op een manier die niet met grotere gewervelde dieren kan worden veroorzaakt. In combinatie met timelapse-microscopie kunnen Details en dynamiek van de weefsel ontwikkeling gemakkelijk worden bestudeerd.

Een probleem met de ontwikkeling van de zebravis is dat de embryo's in de lengte aanzienlijk toenemen; het embryo breidt zijn lengte vier maal uit binnen de eerste 3 dagen van leven¹. Ook is het lichaam van het vroege embryo zacht en wordt het gemakkelijk vervormd als de groei beperkt is. Maar om confocale microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Om embryo's in een vaste positie te houden voor confocale timelapse-beeldvorming, worden ze regelmatig verdoiliseerd en gemonteerd in 0,3-1% laag smelt agarose. Dit heeft het voordeel dat er gedurende een bepaalde periode enige groei mogelijk is tijdens de beeldvorming, terwijl de bewegingen van het embryo worden beperkt. Delen van het embryo kunnen zo efficiënt als deze worden afgebeeld. Bij het gebruik van deze methode voor de beeldvorming van het hele embryo gedurende langere perioden worden echter verstoringen waargenomen vanwege de beperkte groei die door de agarose wordt veroorzaakt. Er zijn dus andere montage methodes nodig. Kaufmann en collega's hebben een alternatieve montage van zebravis-embryo's voor lichte blad microscopie beschreven, zoals selectieve vlak verlichtings microscopie (spim), door de embryo's te monteren in buisjes met gefluoreerde ethyleen propyleen (FEP) die lage concentraties agarose of Hydroxypropyl methylcellulose²bevatten. Deze techniek produceert in de loop van de tijd een uitmuntende visualisatie van embryogenese. Schmid et al. Beschrijf de montage van maximaal zes embryo's in agarose in VBO-buisjes voor lichte microscopie³ die verschillende embryo's visualiseren in één beeldvormings sessie. Mallen zijn gebruikt om embryo arrays te maken voor een efficiënte montage van grotere aantallen embryo's⁴. Masselkink et al. hebben 3D-gedrukte kunststof mallen gebouwd die kunnen worden gebruikt om silicium te maken dat zebravis-embryo's in verschillende stadia kunnen worden geplaatst, waardoor montage in een constante positie voorbeeld vorming mogelijk wordt, inclusief confocale Imaging⁵. 3D-printen is ook gebruikt om mallen te maken voor een consistente positionering van zebravis embryo's in 96-well format⁶. Sommige mallen zijn aangepast voor bepaalde stadia en kunnen geen onbeperkte groei voor lange perioden toestaan, terwijl andere mallen flexibeler zijn. Onlangs publiceerde Weijts et al. het ontwerp en de fabricage van een vier-waterput voor Live beeldvorming van zebravis embryo's⁷. In dit gerecht worden de staart en romp van verdoven vissen embryo's handmatig geplaatst onder een duidelijk silicone dak bevestigd net boven een afdekglas om een zak te vormen. Het embryo wordt vervolgens in deze positie vastgesteld door toevoeging van 0,4% agarose. Deze montage zorgt voor de beeldvorming van het ongeveer 2 mm lange posterieure deel (romp en staart) van het embryo, en aangezien tot 12 embryo's per put kunnen worden gemonteerd, maakt de methode het mogelijk om meerdere monsters te maken. Op dezelfde manier presenteerden Hirsinger en Steventon onlangs een methode waarbij het hoofd van de vis wordt gemonteerd in agarose, terwijl de staart vrij kan groeien, en deze methode vergemakkelijkt ook de beeldvorming van het stam-en staart gebied van het embryo⁸.

Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis embryo's die de bewegingen van de embryo's beperken en tegelijkertijd onbeperkte groei mogelijk maken. De voordelen van deze montagemethode zijn dat het een goedkope, snelle en eenvoudige methode is om embryo's van verschillende stadia te monteren voorbeeld vorming met behulp van een omgekeerde Microscoop. De montage maakt lange-termijn beeldvorming van het hele lichaam (hoofd, romp en staart) tijdens de ontwikkeling van de embryo. Om de bruikbaarheid van deze methode te demonstreren, werd whole embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling afgebeeld in transgene vis. Twee embryo's per sessie, met twee golflengten in 3D, werden door time-lapse microscopie voor 55 opeenvolgende uren afgebeeld om films van weefsel ontwikkeling te renderen.

Protocol

Het hier gepresenteerde dier werk werd goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités (IACUCs) van de Universiteit van Houston en de Universiteit van Indiana.

1. vishouderij

Opmerking: voor werken met gewervelde modellen is een door IACUC goedgekeurd protocol vereist. Het moet worden uitgevoerd volgens de relevante nationale en internationale richtlijnen.

1. Volwassen zebravis onderhouden zoals beschreven in eerder gepubliceerde literatuur⁹.
2. In de namiddag, plaats volwassen zebravis in kweek tanks. Fok mannetjes tot vrouwtjes met een ratio van 1:2.

2. voorbereiding van de oplossingen

1. Maak een stamoplossing van 1% smelt agarose in embryonale media (E3:5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mm MgSO₄, aangepast aan pH 7,0). Aliquot de stockoplossing in buizen van 1,5 mL en bewaar ze op 4 °C.
2. Maak een stamoplossing van 4% (w/v) tricaïne (MS-222) in gedistilleerd water. Bewaren bij 4 °C in een donkere fles.
   Let op: tricaïne is giftig en moet worden gewogen en opgelost in een rook afzuigkap.
3. Maak een stamoplossing van 20 mM N-fenylthioureum (PTU) in gedistilleerd water. Bewaren bij-20 °C.

3. bereiding van de embryo's

1. Oogst na de paring embryo's in de E3 in een Petri schaaltje en inbroed ze gedurende ongeveer 28 uur vóór de montage op 26,5 °C.
   NB: dit vertraagt de ontwikkeling van de embryo's, zodat de embryo's aan het begin van de beeldvorming ongeveer 30 Somiet worden.
2. Anesthetiseer embryo's in 0.016-0.020% tricaïne in E3. Om pigmentatie te remmen, voeg PTU toe aan een concentratie van 200 μM.
3. Dechorionate de embryo's met behulp van een tang onder een ontleed Microscoop. Gebruik twee Tang, grip en trek het chorion voorzichtig uit elkaar om het embryo vrij te geven.

4. montage in agarose

Opmerking: de ontwikkelde montagemethode vereist twee verschillende concentraties van laag smelt agarose in E3 met 0,02% tricaïne en PTU indien nodig. De eerste agarose oplossing bevat een optimale concentratie van agarose waarbij de vervorming en beweeglijkheid minimaal zijn. De optimalisatie wordt beschreven in stap 5 hieronder.

1. Verwarm de agarose-oplossingen voor de twee lagen (concentratie gedefinieerd in stap 5 hieronder en 1%) tot 65 °C. Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 30 °C vlak voor de montage, zodat het embryo niet door de hitte wordt aangetast. Voor montage, gebruik 35 mm glasbodem gerechten met een No. 0 cover glasbodem. Het afdekglas dat op de bodem van de schotel is bevestigd, creëert een oppervlak van 10 mm (ca. 1,2 mm diep), waarin het embryo moet worden geplaatst.
   Opmerking: in dit geval was de concentratie met de minste beweeglijkheid en vervormingen tussen 0,025 en 0,040% agarose.
2. Plaats met een glazen pipet of micro pipet voorzichtig een gedechorioneerd embryo met een van de laterale zijden naar de bodem van de schaal. Als u een micropipet gebruikt, snijd dan het buitenste deel van de punt om de opening naar het embryo te verhogen (Figuur 1a). Verwijder de resterende E3 voorzichtig met een micro pipet.
3. Voeg de eerste agarose-oplossing toe aan de kleine put die is gemaakt door het afdekglas dat aan de onderkant van de schaal is bevestigd om het embryo te bedekken (laag 1) (Figuur 1B). Zorg ervoor dat de agarose de kleine put bedekt, maar niet overloopt.
4. Bedek de kleine put met een afdekglas (22 mm x 22 mm) (Figuur 1C) om een smalle, met het embryo tussen de twee afdek glazen gevulde ruimte te creëren.
5. Plaats een laag van 1% agarose-oplossing bovenop het afdekglas over de bodem van de schaal (laag 2) (Figuur 1D). Omdat deze laag stolt, houdt het afdekglas op zijn plaats.
6. Vul het resterende gedeelte van de schaal met E3 met 0,02% tricaïne om het systeem gehydrateerd te houden (Layer 3) (Figuur 1E).
   Opmerking: in deze opstelling beschermen de afdekglas en 1% agarose de onderlaag tegen verwaterd raken.

5. optimalisatie van de agarose-oplossing voor Layer 1

1. Voor het identificeren van de optimale concentratie van agarose voor Layer 1, gebruikt u een Multiscale grid zoeken benadering. Mount embryo's in toenemende concentraties van agarose variërend van 0,01% tot 1% gevolgd door timelapse-beeldvorming van embryonale groei beperking en beweeglijkheid in het gezichtsveld. Identificeer de concentraties waar zowel de vervorming als de beweeglijkheid minimaal zijn.
2. Om de concentratie van agarose verder te optimaliseren, Monteer de embryo's met behulp van een fijnere reeks concentraties van agarose (bv. tussen 0,025 en 0,040% agarose) afhankelijk van de concentratie die het beste is gevonden in stap 5,1 (bijv. 0,025%, 0,028%, 0,031%, enz.).
   NB: in ons laboratorium was de optimale agarose concentratie rond de 0,03%.

6. timelapse-beeldvorming

Opmerking: deze montagemethode werkt voor elke omgekeerde Microscoop met timelapse-functionaliteit voor fluorescentie en heldere veld beeldvorming.

1. Voer timelapse-beeldvorming uit voor het hele embryo of delen daarvan tot 55 uur. Voorbeeld vorming van verschillende embryo's, gebruik een stage adaptor die verschillende gerechten bevat met één embryo gemonteerd per gerecht. Draai de gerechten één voor één zodat de embryo's ongeveer horizontaal gepositioneerd zijn, zoals bepaald door het oog. Voor optimale embryonale groei en ontwikkeling gebruikt u een Microscoop fase met een incubator die is ingesteld op 28,5 °C.
2. Selecteer een lage vergrotings doelstelling in de Microscoop-software. Onder het oog stuk, lokaliseren en fijn uitlijnen van de embryo's horizontaal door het roteren van de gerechten met behulp van heldere veldverlichting en noteer hun locaties in de software. Maak een bestandsnaam voor het automatisch opslaan van de gegevens.
   Opmerking: in dit experiment werden een plan APO λ 4x 0,2 NA Objective en de XY tab in het ND acquisitie venster gebruikt om de locaties van de embryo's te registreren. Gegevens zijn opgeslagen in. ND2-indeling. Het doel werd geselecteerd door op de pictogrammen op het tabblad Ti pad te klikken.
3. Stel de grootte van het pinhole, de scansnelheid, de afbeeldingsgrootte en de zoom in. Selecteer vervolgens een hogere vergrotings doelstelling voor het vastleggen van de afbeeldingen.
   Opmerking: in dit experiment werd een plan-APO 10x 0,45 NA doelstelling gebruikt voor de beeldvorming van hele embryo's, en een super-fluor 20x 0,75 NA doelstelling werd gebruikt voor de grotere vergroting beeldvorming van delen van het embryo. De pinhole werd ingesteld op 1,2 AU (19,2 μm voor de 10x-lens), de scansnelheid werd ingesteld voor een pixel dwelltijd van 2,4 μs en de beeldgrootte was ingesteld op 1024 x 1024 pixels met een scan zoom van één, waardoor een pixelgrootte van 1,24 μm voor de 10x-lens en 0,62 μm voor de 20x lens.
4. Selecteer de kanalen waarop de fluorescentie moet worden afgebeeld. Pas de instellingen voorbeeld opname één kanaal tegelijk aan. Stel voor elk fluorescentie kanaal de laser stroom en de detector hoogspanning in, zorg ervoor dat u het beste dynamische bereik verzamelt terwijl u de verzadiging vermijdt en de fotobleaching beperkt.
   Opmerking: in dit experiment werd GFP afgebeeld met het 488 groene kanaal, (488 nm laser en emissie tussen 500 en 550 nm), en RFP met het 561 rode kanaal (561 nm laser en emissie tussen 570 en 600 nm), en het transmissie beeld werd verzameld met behulp van de 561 nm laser en de uitgezonden licht detector (TD kanaal).
5. Om het hele embryo met de 10x-doelstelling te kunnen afbeelen, moet u verschillende kijk velden met elkaar overlappen en ze samen met de Microscoop-software in elkaar steken.
   Opmerking: als de embryo's tijdens de beeldvorming substantieel zullen toenemen, zorg er dan voor dat er ruimte is in het gezichtsveld voorste en posterieure van het embryo. Gebruik het tabblad Scan grote afbeelding van het ND-verwervings venster en selecteer een patroon van 4 x 1 met 10% overlapping om vier aangrenzende weergavevelden vast te leggen.
6. Configureer de instellingen voor het vastleggen van de Z-stacks met behulp van de Microscoop software.
   Opmerking: omdat het embryo dicht bij de bodem van de glazen schaal is gemonteerd, zal het midden van de bodem verdwijnen naarmate het groeit. Gebruik het tabblad Z van het venster van de ND-acquisitie en selecteer het asymmetrische relatieve bereik. Met deze methode wordt het huidige scherpstel vlak gebruikt als het referentievlak en de rest van de vlakken zijn asymmetrisch verdeeld boven en onder om het hele embryo binnen het Z-stack volume op te nemen, met voldoende ruimte om de groei van het preparaat te beoordelen. In alle experimenten werd het interval ingesteld op 11 μm en het totale bereik tot ongeveer 45-vlakken.
7. Gebruik een automatische focus om de focus van meerdere embryo's tijdens langdurige timelapse-beeldvorming te behouden. Als er verschillende embryo's worden gebeeld, past u de afzonderlijke offset niveaus voor elk embryo aan om zich op het referentievlakte concentreren.
   Opmerking: in dit experiment werd een op laser gebaseerd focus stabilisatiesysteem gebruikt.
8. Stel de time-lapse-parameters in de Microscoop-software en de afbeelding in voor een duur van 55 uur met intervallen van ongeveer 1 uur. Leg bij elke cyclus twee embryo gegevenssets opeenvolgend vast en sla gegevens automatisch op na elke cyclus.
9. Verwerk afbeeldingen met behulp van een on-line of off-line versie van de Microscoop-software. Als er meer dan één embryo is afgebeeld, maakt u voor elk embryo onafhankelijke bestanden door de gegevensset te splitsen op basis van de locatie van Imaging. Gebruik projecties met maximale intensiteit of een soortgelijk hulpmiddel om 3D-tijdgegevens sets om te zetten in 2D-tijdgegevens sets. Maak filmbestanden met de menuoptie Opslaan als en selecteer. AVI als bestandsindeling. Selecteer de optie geen compressie met 200 MS-intervallen voor een afspeelsnelheid van 5 frames/s.
   Opmerking: de oorspronkelijke gegevensset van twee embryo's in dit experiment is gesplitst met behulp van de functie locaties splitsen in de software (bestand | Import/export | Meerdere punten splitsen). 3D-tijd sets zijn geconverteerd naar 2D-tijdgegevens sets met behulp van de projectie functie maximale intensiteit (afbeelding | ND-verwerking | Creëer een projectie afbeelding met maximale intensiteit in Z).

Results

Ontwikkeling van de montagemethode
Het belangrijkste doel van dit werk was het ontwikkelen van een goedkope montagetechniek voor de timelapse-beeldvorming van zebravis ontwikkeling voor langere tijd. De gelaagde montagemethode is ontwikkeld om het fragiele zebravis-embryo lichaam volledig te laten groeien en tegelijkertijd zijn bewegingen te beperken. Als de agarose-concentratie van laag 1 te hoog is, worden de embryo's vervormd en gebogen (Figuur 2). Embryo's geteeld op ...

Discussion

Hier wordt een montagemethode beschreven voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's. De meest kritieke stap voor de montagemethode is het bepalen van de optimale concentratie van agarose die de embryo groei met onbeperkte zebravis mogelijk maakt en tegelijkertijd de embryo's in een volledig vaste positie voor confocale beeldvorming houdt. Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is deze waarde zeer gevoelig voor de fouten in de meting van het gewicht van de agarose en ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Bewaar opgeloste oplossing bij 4 °C
35 mm glazen bodemschalen met nr. 0 dekglas en 10 mm diameter van de glazen bodem	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Bewaar opgeloste oplossing bij 4 °C
N-fenylthioureum (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Bewaar opgeloste oplossing bij -20 °C
Micro dekglazen 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescentiemicroscoop	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscoopsoftware
DMC4500 digitale microscoopcamera	Leica	NA
Nikon A1S confocale microscoop	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR versie 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscoopsoftware