Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Samenvatting

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Samenvatting

Ubiquitin (UB) en ubiquitin-achtige (UBL) afhankelijke post-translationele modificaties van eiwitten spelen fundamentele biologische regelgevende rollen binnen de cel door het beheersen van de stabiliteit van het eiwit, activiteit, interacties en intracellulaire lokalisatie. Ze stellen de cel in staat om te reageren op signalen en zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving. Veranderingen binnen deze mechanismen kunnen leiden tot ernstige pathologische situaties zoals neurodegeneratieve ziekten en kankers. Het doel van de hier beschreven techniek is om UB/ubls afhankelijke PTMs-profielen, snel en nauwkeurig, uit gekweekte cellijnen vast te stellen. De vergelijking van verschillende profielen die uit verschillende omstandigheden zijn verkregen, maakt het mogelijk specifieke veranderingen te identificeren, zoals die welke worden veroorzaakt door bijvoorbeeld een behandeling. Lentivirale gemedieerde celtransductie wordt uitgevoerd om stabiele cellijnen te creëren die een twee-tags (6His en Flag) versie van de modifier uitdrukken (ubiquitin of een UBL zoals SUMO1 of Nedd8). Deze tags staan de zuivering van ubiquitine en dus van alomtegenwoordige eiwitten uit de cellen toe. Dit wordt gedaan door middel van een twee stappen zuiveringsproces: de eerste wordt uitgevoerd in denaturerende omstandigheden met behulp van de 6His tag, en de tweede in inheemse omstandigheden met behulp van de vlag tag. Dit leidt tot een zeer specifieke en zuivere isolatie van gemodificeerde eiwitten die vervolgens worden geïdentificeerd en semi-gekwantificeerd door vloeistofchromatografie, gevolgd door tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) technologie. Eenvoudige informatica analyse van MS-gegevens met behulp van Excel-software maakt het mogelijk PTM-profielen te creëren door achtergrond signalen te elimineren. Deze profielen worden vergeleken tussen elke aandoening om specifieke veranderingen te identificeren die dan specifieker bestudeerd zullen worden, te beginnen met hun validering door standaard biochemie technieken.

Inleiding

De hier voorgestelde methode is gewijd aan het bestuderen van Ptm's gemedieerd door de ubiquitine familieleden uit gekweekte zoogdiercellen om mogelijke veranderingen in verband met een specifieke aandoening te identificeren (behandeling, differentiatie, enz.). Ptm's vertegenwoordigen de laatste stap in de regulering van de functies van eiwitten¹. Inderdaad, eenmaal geproduceerd door de translationele machines, de meeste zo niet alle eiwitten ondergaan verschillende soorten Ptm's die hun activiteit moduleren, moleculaire interacties, en intracellulaire locatie¹. Onder de overvloed aan Ptm's zijn degenen die worden bemiddeld door de ubiquitine familie van eiwitten, ubiquitine zelf en alle ubiquitine-likes, hebben het potentieel om alle intracellulaire of gedeeltelijk cytoplasmische eiwitten reguleren². Omdat ze zelf eiwitten zijn, kunnen ze aan elkaar worden geconjugeerd, en vormen homogene en heterogene ketens van verschillende topologieën, elk geassocieerd met specifieke regelgevende functies². Tools zijn nodig om te proberen om deze complexe machines te ontcijferen en te begrijpen. Veel benaderingen werden wereldwijd ontwikkeld, met hun eigen voor-en nadelen, en hier stellen we een met hoge prestaties geschikt voor gekweekte cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is de nauwkeurigheid. Inderdaad, de zuiverheid van geïsoleerde gemodificeerde eiwitten wordt sterk verbeterd door het combinatorische gebruik van de twee tags (6his en vlag) en de twee stap-procedure en daarom is het veel selectiever dan een enkele tag Fusion UB/UBL^3,4. De aanwezigheid van de 6His-tag maakt een eerste stap van zuivering mogelijk in een volledig denaturerende aandoening, waardoor elke co-zuivering van eiwitten die ubiquitine-bindende domeinen of andere eiwitten bevatten die aan de alomtegenwoordige stoffen binden, wordt vermeden. Dit is een technisch probleem dat wordt ondervonden door verschillende andere benaderingen op basis van affiniteits zuivering van alomtegenwoordige proteomes met behulp van specifieke antilichamen⁵ of tandem ubiquitine bindings elementen (buizen)⁶. Belangrijk is dat deze techniek niet bevooroordeeld is ten gunste van de zuivering van een bepaald type Ubiquitination, omdat het voor sommige andere benaderingen het geval zou kunnen zijn, omdat zowel mono als verschillende soorten polyubiquitinaties werden geïdentificeerd⁷. Als gevolg hiervan zal een wijziging van ubiquitatie in meer details moeten worden bestudeerd door standaard biochemische benaderingen om de exacte soort alomtegenwoordige activiteiten te identificeren.

Tot slot, een ander technisch voordeel van dit protocol is het gebruik van lentivirussen, dat gemakkelijk en snel creëert stabiele uitdrukken cellijnen met redelijke niveau van expressies van Tagged modifier zonder interfereren met de normale cellulaire gedrag.

Overwegende dat een belangrijke rol van ubiquitisatie is om eiwitten te richten op proteasomale afbraak, het is nu bekend dat het vele andere regulatoire eigenschappen heeft voor potentieel meest intracellulaire of gedeeltelijk intracellulaire eiwitten¹. Het aantal van deze functies wordt verder versterkt door het bestaan van veel ubiquitine zoals eiwitten, het vormen van een familie van eiwitten die bijna elke cel mechanismen reguleren¹. Hun wijzigingen kunnen drastische gevolgen hebben voor de celbiologie en kunnen leiden of deelnemen aan pathologische situaties⁸, zoals kanker⁹. Daarom zijn gereedschappen nodig om dit uitgestrekte landschap te verkennen en de veranderingen te identificeren die gepaard gaan met een pathologische aandoening die als nieuwe therapeutische doelen kan dienen.

Dit protocol is gewijd aan cellen in de cultuur, omdat ze moeten worden getransduceerde om exogene Tagged UB/UBL uit te drukken. Eenmaal gemaakt, kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om UBL-profielen te genereren van cultuur in 2D of 3D of xenografts, waardoor de horizon van de verschillende experimentele modellen die kunnen worden toegepast om PTMs-profielen te bestuderen, wordt verlengd.

Protocol

1. generatie van stabiele cellijnen uitdrukken 6His-vlag-UBL

Opmerking: Co-transfectie van HEK-293T cellen met pCCL-6HF-UBL, pVSVG en Delta-helper.

1. Dag 0: zaad 293T cellen in een 6-put plaat te verkrijgen 50-70% samenvloeiing de dag na.
2. Dag 1: Co-transfect 50-70% confluente cellen met een mengsel van 1 μg PCCL-6hf-UBL of PCCL-GFP, 1 μg pvsvg en 1 μg Delta-helper vectoren, met behulp van een transfectie reagens en protocol voor lintvirus productie. Na 6 h van transfectie, verander het medium naar een vers die overeenkomt met cellen te worden transduced. Zaad de cellen worden getransduceerde in een 6 goed plaat om te verkrijgen van een 10-20% samenvloeiing de dag na (de dag van het starten van de transductie).
3. Dag 2:24 h na transfectie, herstel het medium dat lentivirale deeltjes bevat en filtreer met behulp van 0,45 μm filters. Indien nodig, voeg verse medium op dit punt om een tweede partij van lentivirussen te produceren. Vervang het medium van cellen die moeten worden getransduceerde (10-20% samenvloeiing) door degene die lentivirussen bevat.
   Opmerking: Linviraal medium kan gedurende enkele dagen vóór de transductie op + 4 °C worden bewaard of gedurende maanden bij-80 °C worden bewaard.
4. Incuberen de cellen met lentivirussen tussen 24 h tot 72 h in een standaard incubator (37 °C, 5% CO₂) en verander vervolgens het medium voor een nieuwe standaard. Controleer indien mogelijk GFP-expressie met behulp van een omgekeerde fluorescerende Microscoop om de efficiëntie van transductie te evalueren: percentage van het uitdrukken van cellen en het relatieve niveau van expressie per cel. Als er geen fluorescentie wordt gedetecteerd, wacht u nog eens 2-3 dagen, omdat de expressie langer kan duren, afhankelijk van het type cellen dat moet worden transduced.
5. Als GFP-controle positief is, moet u alle cellen laten groeien totdat u genoeg heeft om een expressie controle van 6HF-UBL door immunofluorescentie en Western Blot met Anti-Flag antilichaam uit te voeren.

2. dubbele zuivering van gemodificeerde eiwitten

Opmerking: buffer 1:6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M na₂HPO₄/Nah₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Buffer 2:50 mM NaH₂po₄, 150 mm NaCl, 1% Tween20, 5% glycerol, pH 8,0.
Buffer 3:100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Cellyse: was eenmaal klaar, reinig cultuur gerechten ten minste één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (RT) en ga verder naar cellyse of, als alternatief, vlam in vloeistof N₂ en bewaar bij-80 °c. Voeg voor Lysis 2 mL buffer 1 per 15 cm schaal toe aan RT. gebruik een celscraper om alle lysaten in 50 mL conische centrifugebuizen te recupereren (eindvolume ongeveer 20 mL).
2. Soniceren de lysaten driemaal gedurende 30 sec. gescheiden door een pauze van 1 minuut.
3. Centrifugeer de gesoniceerde lysaten bij 15.000 x g gedurende 15 minuten.
4. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis met behulp van een celzeef (40 μm).
5. Bepaal de concentratie van de monsters en pas zo nodig de hoeveelheid eiwitten en hetzelfde volume aan. Gebruik een totale hoeveelheid eiwit tussen 50 en 100 mg (10 gerechten met een diameter van 15 cm voor MiaPaCa-2 cellen).
6. Voeg ni^{2 +}-NTA kralen toe, met 2 μL kralen per 1 mg eiwit.
7. Roteren bij 30 rpm tijdens 2,5 uur bij RT.
8. Pellet de parels op 500 x g gedurende 5 min.
9. Was de parels met 1 mL buffer 1, breng de monsters over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL en zet de buisjes op het ijs. Voer alle volgende stappen uit op ijs of bij 4 °C.
10. Was tweemaal met 1 mL ijskoude buffer 2 met 10 mM imidazol.
11. Om gebonden eiwitten te elzen, voeg 600 μL buffer 2 met 250 mM imidazol toe en draai voor 2 uur bij 4 °C.
12. Pellet de kralen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 1 min. Breng de supernatanten over naar nieuwe, voorgekoelde, 1,5 ml buizen en voeg 50 μL Anti-Flag m2 antilichaam geconjugeerde kralen toe.
13. Roteer bij 30 rpm voor 2,5 uur bij 4 °C en was 2 keer met 500 μL buffer 2 en 2 keer met 500 μL buffer 3.
14. Voeg voor de uiteindelijke elutie 100 μL buffer 3 met een vlag Peptide van 0,1 μg/μL toe en draai bij 4 °C voor 1,5 uur.
15. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 1 minuut en breng de supernatanten over naar nieuwe voorgekoelde buizen.
16. Neem 10% (10 μL) om te laden op SDS-PAGE en voer een zilver kleuring van de gel uit om de zuiverings kwaliteit te controleren. Als de zuivering er goed uitziet, analyseer dan de 90% achtergelaten door LC-MS/MS.

3. verwerking van massaspectrometrie gegevens om profielen van UB/Ubls Ptm's te genereren en significante verschillen tussen hen te identificeren

Opmerking: resultaten van MS Analysis bevatten veel informatie, waaronder het totale aantal peptiden en de piek gebied waarden (gemiddelde van TOP 3 peptide Area¹⁰) voor elk eiwit geïdentificeerd in elke monsters. Deze gegevens kunnen worden verwerkt met behulp van de peptide Count nummers of de piek gebied waarden, of beide. Voor berekening met piek gebieden, omdat deze waarden meestal in het bereik van 10⁶zijn, is het noodzakelijk om ze te verdelen door deze volgorde voordat ze dezelfde formules als hieronder toepassen. De resultaten die met beide methoden van tellen worden verkregen, moeten een sterke correlatie vertonen, zoals gewoonlijk gebeurt. Gebruik voor elk geïdentificeerd eiwit de volgende formules:
v1 peptiden waarden in niet-behandeld ubiquitine monster (bijv., UB-medicijn)
v2 peptiden waarden in Gemcitabine behandeld ubiquitine monster (bijvoorbeeld UB + drug)
K1 peptiden in niet-behandelde controle GFP-monster (bv., GFP-medicijn)
K2 peptiden waarden in Gemcitabine behandelde controle GFP monster (bijv., GFP + drug).

1. Normalisatie: Normaliseer waarden tussen geneesmiddelen behandelde cellen en onbehandelde cellen voor Ubiquitin en GFP met behulp van de volgende formules. Genormaliseerde v = V en genormaliseerde k = K.
   V1 = V1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ K1); K2 = K2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ K2)
2. Verwijdering van de achtergrond: gebruik de volgende formules om waarden in het controlemonster (GFP) af te trekken van waarden in het ubiquitine-monster om specifieke waarden (V ' 1 en V ' 2) te verkrijgen voor elk geïdentificeerd eiwit in beide omstandigheden.
   V ' 1 = v1-K1 als v1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 als v1-K1 < 0
   V ' 2 = v2-K2 als v2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 als v2-K2 < 0
3. Variatie (var) van Ubiquitination. Om een score te verkrijgen (tussen-100 en + 100) voor positieve en negatieve variaties van PTMs geïnduceerd door een medicijn, gebruikt u de volgende formule waarin het verschil tussen specifieke waarden van behandelde en onbehandelde monsters wordt gedeeld door de som van alle waarden, inclusief die in controle (voor het bestraffen van eiwitten ook geïdentificeerd in Control GFP), en vermenigvuldigen met 100.
   Var = (V'2-V ' 1)/(v1 + K1 + v2 + K2) * 100; -100 < var < 100;
   Variaties onder-50 (onderdrukking van PTM) of boven 50 (inductie van PTM) worden meestal beschouwd als significant.
4. Vertrouwen (conf). Gebruik de volgende formule om een betrouwbaarheids waarde te verkrijgen tussen 0 en 100%,:
   Conf = ((v1 + v2)²/(1 + v1 + v2 + k1 + k2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 als < 0
   Waarden boven 50 worden meestal beschouwd als vertrouwen.
5. Om een mooiere verdeling van Inductie-/onderdrukkings waarden te verkrijgen en om zowel variatie-als betrouwbaarheidsparameters te overwegen, vermenigvuldigt u de var -en conf -waarden met behulp van de volgende formule, waarbij V var en C conf
   = SI (v2 > 0;((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   Opmerking: aangezien piek gebieds waarden meestal nauwkeuriger zijn dan het tellen van peptide, is het mogelijk om specifieke software te gebruiken die is gewijd aan de interpretatie van dit soort gegevens, zoals Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), na aanbevelingen van gebruik.

Resultaten

Transductie van kweek zoogdiercellen om GFP en 6HF-UB te creëren die cellen uitdrukken
Om lentivirussen te produceren die later zullen worden gebruikt om MiaPaCa-2 cellen te leiden, worden 70% Confluent Health HEK-293T cellen samen met een gelijke hoeveelheid van de drie vectoren, pCCL-6HF-Ubiquitin of GFP/Delta-helper/pvSvG. Na 24 h van de productie wordt het medium dat linvirale deeltjes bevat, teruggewonnen en gefilterd. Het is mogelijk op dit punt om de efficiëntie...

Discussie

We hebben een robuuste en betrouwbare methodologie ontwikkeld om profielen van eiwitten te genereren die zijn aangepast door de belangrijkste ubiquitine-familieleden. Inderdaad, we hebben dit protocol met succes toegepast om profielen van Ptm's te genereren door ubiquitin, en ook door SUMO en Nedd8, en om veranderingen in verband met een behandeling te detecteren⁷, in reactie op de over expressie of knockdown van een bepaald gen (gegevens niet weergegeven) en in cellen die een resistent fenotype h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	bindt alle Flag-gelabelde eiwitten
anti-Flag M2 antilichaam	Sigma-Aldrich	F3165	om 6His-Flag-gelabelde expressie van ub/ubl te detecteren
Celzeef 40 µm	Falcon	352350	om zwevende pellet uit guanidine gelysate cellen te verwijderen
Flag-peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elueer Flag-gelabelde eiwitten van anti-Flag-kralen
Guanidinehydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotrope stof gebruikt om alle eiwitten in cellysaat te denatureren
Imidazool	Sigma-Aldrich	I5513	elueert 6His-gebonden eiwitten van Ni-NTA-kralen
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	om HEK-293T-cellen te transfecteren voor het produceren van lentivirussen
Lobind buizen	Sigma-Aldrich	Z666491	vermijdt absorptie van kostbaar materiaal
Membraanfilter, 0,45 µm	Millipore	HAWP04700F1	om de lentivirale supernatant te filteren
Ni-NTA	Qiagen	30210	zuivering van de 6His-tag