Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Kelly Pittman; Shelton Earp; Eric Ubil

doi:10.3791/60453

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60453

⸱

28 november 2019

Kelly Pittman¹ , Shelton Earp¹ , Eric Ubil²

¹Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Samenvatting

Door tumor afgeleide paracrine-signalering is een over het hoofd gezien onderdeel van lokale immunosuppressie en kan leiden tot een permissieve omgeving voor aanhoudende kanker groei en metastase. Paracrine signalen kunnen cel-celcontact tussen verschillende celtypen, zoals PD-L1 uitgedrukt op het oppervlak van tumoren rechtstreeks interactie met PD-1 op het oppervlak van T-cellen, of de secretie van liganden door een tumor cel invloed op een immuuncel. Hier beschrijven we een co-cultuur methode voor het ondervragen van de effecten van tumor-uitgescheiden liganden op immune cel (macrophage) activering. Deze eenvoudige procedure maakt gebruik van commercieel verkrijgbare 0,4 μm polycarbonaat membraan permeabele ondersteunt en standaard weefselcultuur platen. In het beschreven proces worden macrofagen gekweekt in de bovenste kamer en tumorcellen in de onderste kamer. De aanwezigheid van de 0,4 μm-barrière zorgt voor de studie van intercellulaire signalering zonder de verstorende variabele van fysiek contact, omdat de twee celtypen hetzelfde medium en de blootstelling aan paracrine liganden delen. Deze aanpak kan worden gecombineerd met anderen, zoals genetische veranderingen van het macrofaag (bijvoorbeeld isolatie van genetische knock-out muizen) of tumor (bijv. CRISPR-gemedieerde veranderingen) om de rol van specifieke afgescheiden factoren en receptoren te bestuderen. De aanpak leent zich ook voor standaard moleculaire biologische analyses zoals kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) of Western Blot-analyse, zonder dat stroom sortering nodig is om de twee celpopulaties te scheiden. Enzym-gebonden immunosorbent assays (elisa's) kan op dezelfde manier worden gebruikt voor het meten van uitgescheiden liganden om beter te begrijpen van de dynamische interactie van cel signalering in de context van het type meerdere cellen. De duur van de co-cultuur kan ook worden gevarieerd voor de studie van tijdelijk gereguleerde gebeurtenissen. Deze co-cultuur methode is een robuuste tool die de studie van tumor-uitgescheiden signalen in de immuuncontext vergemakkelijkt.

Inleiding

Recente studies hebben gericht op het vermogen van kankercellen om detectie door immuuncellen te voorkomen, lokale immuunactivering onderdrukken, of om een tolerogenic tumor-permissieve milieu te produceren in de tumor micro omgeving. Twee brede klassen van tumor en immuuncelinteracties zijn beschreven die deze effecten vergemakkelijken: contact-gemedieerde interacties of tumor-uitgescheiden liganden. Een van de meest goed bestudeerde en klinisch Tractable mechanismen van contact-gemedieerde immuun remming gebruikt door tumoren is de uitdrukking van PD-L1, die samenwerkt met PD-1 op T-cellen voor de remming van hun activering en functie¹^,<....