Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Door tumor afgeleide paracrine-signalering is een over het hoofd gezien onderdeel van lokale immunosuppressie en kan leiden tot een permissieve omgeving voor aanhoudende kanker groei en metastase. Paracrine signalen kunnen cel-celcontact tussen verschillende celtypen, zoals PD-L1 uitgedrukt op het oppervlak van tumoren rechtstreeks interactie met PD-1 op het oppervlak van T-cellen, of de secretie van liganden door een tumor cel invloed op een immuuncel. Hier beschrijven we een co-cultuur methode voor het ondervragen van de effecten van tumor-uitgescheiden liganden op immune cel (macrophage) activering. Deze eenvoudige procedure maakt gebruik van commercieel verkrijgbare 0,4 μm polycarbonaat membraan permeabele ondersteunt en standaard weefselcultuur platen. In het beschreven proces worden macrofagen gekweekt in de bovenste kamer en tumorcellen in de onderste kamer. De aanwezigheid van de 0,4 μm-barrière zorgt voor de studie van intercellulaire signalering zonder de verstorende variabele van fysiek contact, omdat de twee celtypen hetzelfde medium en de blootstelling aan paracrine liganden delen. Deze aanpak kan worden gecombineerd met anderen, zoals genetische veranderingen van het macrofaag (bijvoorbeeld isolatie van genetische knock-out muizen) of tumor (bijv. CRISPR-gemedieerde veranderingen) om de rol van specifieke afgescheiden factoren en receptoren te bestuderen. De aanpak leent zich ook voor standaard moleculaire biologische analyses zoals kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) of Western Blot-analyse, zonder dat stroom sortering nodig is om de twee celpopulaties te scheiden. Enzym-gebonden immunosorbent assays (elisa's) kan op dezelfde manier worden gebruikt voor het meten van uitgescheiden liganden om beter te begrijpen van de dynamische interactie van cel signalering in de context van het type meerdere cellen. De duur van de co-cultuur kan ook worden gevarieerd voor de studie van tijdelijk gereguleerde gebeurtenissen. Deze co-cultuur methode is een robuuste tool die de studie van tumor-uitgescheiden signalen in de immuuncontext vergemakkelijkt.
Inleiding
Recente studies hebben gericht op het vermogen van kankercellen om detectie door immuuncellen te voorkomen, lokale immuunactivering onderdrukken, of om een tolerogenic tumor-permissieve milieu te produceren in de tumor micro omgeving. Twee brede klassen van tumor en immuuncelinteracties zijn beschreven die deze effecten vergemakkelijken: contact-gemedieerde interacties of tumor-uitgescheiden liganden. Een van de meest goed bestudeerde en klinisch Tractable mechanismen van contact-gemedieerde immuun remming gebruikt door tumoren is de uitdrukking van PD-L1, die samenwerkt met PD-1 op T-cellen voor de remming van hun activering en functie1,2. Als reactie op interferon-gamma (IFNγ), dat wordt uitgedrukt door een aantal geactiveerde immuuncellen, kunnen tumorcellen de expressie van PD-L1 verhogen om de uitputting van PD-1 te induceren-uitdrukken van geactiveerde T-cellen, waardoor ze de tumorcellen effectief uitroeien3. Het gebruik van antilichamen om de interactie tussen PD-L1 en PD-1 te blokkeren wordt momenteel gebruikt voor de behandeling van meerdere soorten kanker bij mensen4. In het licht van dit klinisch succes en anderen, de identificatie en targeting van tumor-afgeleide immunosuppressieve mechanismen heeft steeds meer aandacht gekregen.
Naast onderdrukking van adaptieve immuniteit, tumoren zijn ook bekend om te scheiden van factoren die de pro-inflammatoire reacties van aangeboren immuuncellen onderdrukken. Tumor-afgeleide of tumor-geïnduceerde afscheidingen, met inbegrip van Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, en kolonie stimulerende factor (CSF-1), is aangetoond dat de remming van antitumorale reacties van Natural Killer (NK) cellen, Granulocyten, en dendritische cellen in de tumor micro omgeving5,6,7. Tumor cellen kunnen ook het afscheiden van factoren die de werving en differentiatie van myeloïde-afgeleide cellen in de tumor micro omgeving scheeftrekken ter bevordering van de onderdrukking van T-cel activering8,9.
Eén type aangeboren immuuncel die een diepgaand effect heeft op de progressie van de tumor is de macrofaag. Gedurende vele jaren is de aanwezigheid van tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) gebruikt als een negatieve prognose van patiënt overleving10. Het concept dat immunosuppressieve TAMs bevochtigen immuun cel-gemedieerde klaring van tumoren werd geïntroduceerd meer dan 40 jaar geleden11. Meer recentelijk, het is aangetoond dat de macrofaag pro-inflammatoire reactie kan worden gedowngereguleerd terwijl een Pro-tumor fenotype kan worden geïnduceerd in de tumor micro omgeving. Deze immunosuppressieve macrofagen kunnen bijdragen aan een tolerogene respons, het stimuleren van tumorprogressie en resistentie tegen chemo-en immunotherapie12. Gezien het feit dat macrofagen vaak een van de meest voorkomende leukocyten met de tumor, herstel van hun tumor-specifieke immuunactiviteit vertegenwoordigt een potentieel doelwit voor antikanker Therapeutics13.
Terwijl contact-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en macrofagen kunnen worden gemodelleerd via directe cocultuur, het gebruik van permeabele membraan ondersteunt kan verhelderen welke tumor-uitgescheiden factoren zijn immunomodulerende zonder de potentieel verstorende invloed van tumor-immune cel-celcontact. Met behulp van enigszins vergelijkbare methoden, anderen hebben aangetoond dat het potentieel van het identificeren van afgescheiden factoren in Microglia/neuronale interacties14 evenals tumorcellen met mesotheliale cellen15. We hebben ook met succes deze co-cultuurtechniek gebruikt om de rol van een tumor-uitgescheiden eiwit, Pros1, te karakteriseren als een suppressor van pro-inflammatoire genexpressie na de stimulatie van peritoneale macrofagen met LPS en interferon-gamma16. Hier beschrijven we een eenvoudige methodologie die kan worden gebruikt om te interromen hoe tumor-uitgescheiden factoren kunnen invloed hebben op macrofaag activering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot de oogst en het gebruik van Murine peritoneale macrofagen werden uitgevoerd aan de Universiteit van North Carolina op Chapel Hill (UNC) en werden goedgekeurd door het UNC-Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC).
1. macrofaag cultuur
Opmerking: deze procedure kan primaire peritoneale macrofagen gebruiken (in detail hieronder beschreven), macrofagen uit het beenmerg of macrofaag cellijnen zoals J774 (ATCC) of RAW264 (ATCC).
- Oogst peritoneale macrofagen zoals eerder beschreven16,17 en plaat rechtstreeks in de bovenste kamer (s) van een 0,4 μm polyester membraan invoegen co-cultuur 6 goed plaat (Figuur 1a).
Opmerking: de geschatte opbrengst van macrofagen van elke isolatie is 1 x 106 cellen totaal, dus het gemiddelde aantal cellen per put is ~ 1.5 – 1.6 x 105 cellen in een 6 goed plaat. - Cultuur de geoogste macrofagen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12, 10% foetaal runderserum (FBS), 1x penicillaire/streptomycine, 20 ng/mL macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
Opmerking: de bovenste kamer bevat 1 ml kweekmedium terwijl de onderste kamer gevuld is met 1,5 ml. Het medium moet aan elke kamer worden toegevoegd.
2. cocultuur van tumorcellen met macrofagen
- Voorafgaand aan het gebruik, cultuur in de handel verkrijgbaar tumorcellen in hun respectieve medium na ATCC aanbevolen weefselcultuur methoden.
- Was aanhandig tumorcellen eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), Voeg 0,05% trypsine + ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en incuberen bij 37 °C totdat de cellen worden losgekoppeld. Respendeer de cellen in FBS met medium, quantitaat het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer of celteller, en centrifugeer vervolgens 5 min bij 220 x g naar pellet.
- Tijdens het centrifugeren, aspireren het medium van de bovenste en onderste kamers van de macrophage-bevattende permeabele membraan steunplaten en vervangen door vers medium.
- Voor lagere kamers waar tumorcellen zullen worden verguld, vullen met 1 mL medium in plaats van 1,5 mL om voldoende volume voor toevoeging van de cel mogelijk te maken.
- Aspirate medium uit gepileerde tumorcellen en respenderen cellen in DMEM/F12 met 10% FBS, 1x penicillaire/streptomycine, en 20 ng/ml M-CSF in een concentratie van 3 x 105 cellen/ml.
- Voeg 0,5 mL van 3 x 105 cellen/ml tumorcellen toe aan de onderste kamer van de gewenste putjes (Figuur 1b).
Opmerking: cellen kunnen onmiddellijk worden behandeld.
3. behandeling van co-gekweekte cellen
- Voor het opwekken van macrofaag pro-inflammatoire genexpressie, behandelen van afzonderlijk of co-gekweekte macrofagen door toevoeging van 100 ng/mL IFNγ en 50 ng/mL LPS.
- Variëren de duur van de behandelingstijden in de cultuur indien nodig. Macrofaag activering treedt op binnen 2 h en sommige tumor gemedieerde onderdrukking optreedt door 8 h. co-cultuur voor 24 h levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking.
Opmerking: als alternatief kunnen macrofagen worden geïnduceerd om een Pro-wond helende fenotype aan te nemen door de toevoeging van factoren zoals interleukine-10 (IL10), en het effect van de tumor-uitgescheiden ligand beoordeeld.
- Variëren de duur van de behandelingstijden in de cultuur indien nodig. Macrofaag activering treedt op binnen 2 h en sommige tumor gemedieerde onderdrukking optreedt door 8 h. co-cultuur voor 24 h levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking.
- Als een negatieve controle, cultuur macrofagen afzonderlijk en laat onbehandeld. Als een positieve controle, behandelen afzonderlijk gekweekte macrofagen met 100 ng/mL IFNγ en 50 ng/mL LPS.
4. downstreamanalyse van co-gekweekte cellen
- Na de gewenste incubatietijd is verstreken, Isoleer het cellysaat of het geconditioneerde kweekmedium naar wens, afhankelijk van de test behoeften.
- Om de cellysaat voor kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse te isoleren, aspireren de media van beide kamers van de put en was één keer met 2 mL PBS. Breng RNA lysisbuffer aan op de bovenste kamer met de macrofagen. Schraag het membraan zachtjes om het cellysaat vrij te maken en breng het over naar een verzamelbuis voor verdere verwerking volgens het Protocol van de fabrikant van de RNA Isolation Kit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het effect van tumor-uitgescheiden liganden op macrofaag polarisatie te bepalen, werd de beschreven procedure gebruikt. Peritoneale macrofagen gekweekt in de afwezigheid van tumorcellen werden gebruikt als negatief (onbehandeld = uiterst links) en positief (IFNγ en LPS gestimuleerd = 2ND van links) controles (Figuur 2a). Als alternatief werden peritoneale macrofagen samen met B16F10 melanoom tumorcellen (ATCC) (Figuur 1a). Onmiddellijk na het bekle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De co-cultuur assay hier gepresenteerd is een modificatie van eerder vastgestelde assays die het mogelijk maakt voor de studie van tumor-uitgescheiden factoren op immuun celactivering. Terwijl cel-cel contact is bekend voor het induceren van veranderingen in de immuunactiviteit, het vermogen van tumor-uitgescheiden liganden te moduleren immuun activering is minder goed begrepen. We beschrijven een methode die, in tegenstelling tot directe co-cultuur, kan worden gebruikt om te ondervragen hoe tumor afkomstige afgescheiden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Eric Ubil werd deels gefinancierd door de American Cancer Society postdoctorale Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Het werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01-CA205398) en een borstkanker Research Foundation Award (BCRF-18-041) aan HSE.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA-synthesekit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12-medium | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetaal runder serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysacchariden van Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant muis IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX-kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell-doorlaatbare steunen | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Referenties
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
