Methodenartikel

Bepaling van immuuncelidentiteit en zuiverheid Met behulp van epigenetische kwantitatieve PCR

DOI:

10.3791/60465

⸱

19 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology, Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific, 2California Polytechnic State University (Cal Poly), 3Epiontis GmbH, Precision for Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een robuuste methode voor het bepalen van de identiteit en zuiverheid van de immuuncel door middel van epigenetische handtekeningen gedetecteerd met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR). DNA-demethylatie op een specifieke locus dient als een unieke identificatie voor een bepaald celtype en maakt identificatie van CD8+, regulatory, of Th17 T cellen mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immuuncel subtype populatie frequenties kunnen een groot effect hebben op de werkzaamheid van T-cel therapieën. Huidige methoden, zoals flow cytometrie, hebben specifieke steekproefvereisten, hoge monsterinvoer, zijn een lage doorvoer en zijn moeilijk te standaardiseren, die allemaal schadelijk zijn voor de karakterisering van celtherapieproducten tijdens hun ontwikkeling en Productie.

De hierbeschreven tests identificeren en kwantificeren in een heterogeen mengsel van cellen nauwkeurig immuunceltypen met behulp van geïsoleerd genomic DNA (gDNA). DNA-methylatiepatronen worden onthuld door bisulfiteconversie, een proces waarbij niet-gemethyleerde cytosinen worden omgezet in uracils. Niet-gemethyleerde DNA-gebieden worden gedetecteerd door qPCR-versterking met behulp van primers gericht op geconverteerde gebieden. Een unieke locus per test wordt gemeten en dient als een nauwkeurige identificatie voor een specifiek celtype. De tests zijn robuust en identificeren CD8+, regelgeving en Th17 T-cellen op een hoge doorvoer. Deze geoptimaliseerde testen kunnen mogelijk worden gebruikt voor in-process en product release testen voor celtherapie proces.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van T-cellen in cellulaire immunotherapie is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen, vooral met de komst van chimeric antigen receptor (CAR) T-celtechnologie1. Hoewel T-celgebaseerde therapieën met groot klinisch succes zijn ontmoet, zijn ze heterogene en kunnen celkenmerken en identiteiten aanzienlijk verschillen tussen donoren2. De heterogeniteit van T-celpopulaties kan grote gevolgen hebben voor de therapeutische werkzaamheid en de conclusies van klinische studies bemoeilijken. Om deze reden is het cruciaal om t-celheterogeniteit te begrijpen tijdens de productie en formulering van het product om de optimale formuleringen van T-celimmunotherapieën te bepalen.

In brede zin kunnen T-cellen worden onderverdeeld in twee groepen: CD4+ helper T-cellen, die immunomodulatoire cytokinen afscheiden, en CD8+ cytotoxische T-cellen, die direct lysecellen presenteren het cognate antigeen op belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) I moleculen. CD4+ helper T-cellen kunnen zich onderscheiden in een groot aantal specifieke subsets die een unieke set cytokinen produceren. Sommigen suggereren dat een gedefinieerde verhouding van CD4 + tot CD8 + T cellen in de uiteindelijke cel product te maximaliseren in vivo werkzaamheid en persistentie, maar kan de productie van cellen compliceren3. Regulatory T-cellen (Tregs), een subset van CD4+ T-cellen, zijn immunosuppressief en verminderen de activering van immuuncellen. Regulatory T-cellen zijn betrokken bij het bemiddelen van tumortolerantie en, indien aanwezig tijdens car t-celproductie, kan remmen de antitumor immuunrespons van CAR T cellen4,5,6. Andere CD4+ subgroepen zoals T helper 17 (Th17) T-cellen bevorderen de klaring van de tumor en kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van T-celtherapieën te verhogen. Zo is het verhogen van Th17 CD4+ T-cellen van bijzonder belang voor vaste tumorinstellingen waar een verhoogde productie van interleukine 17 (IL-17) de antitumor immuunrespons5,7,8,9bevordert. Inzicht in het belang van Th17 cellen in tumorreacties heeft geleid tot meer onderzoek naar strategieën om deze cellen te genereren in vitro7,9. Daarom zijn methoden voor het detecteren van deze T-celsubsets cruciaal voor het optimaliseren van T-celtherapieën en moeten ze robuust, eenvoudig, schaalbaar en reproduceerbaar zijn.

Flow cytometrie is de meest voorkomende methode om de identiteit van een immuuncel te bepalen. Echter, flow cytometrie vereist levende, intacte cellen die moeten worden geanalyseerd op dezelfde dag dat ze worden geoogst. Voor intracellulaire cytokinevlekken (ICS) is eiwitafscheidingsremming nodig om cytokines in de T-cellen te behouden. Echter, verschillende remmer verbindingen hebben differentiële effecten op de afscheiding van specifieke cytokinen, waardoor gebruikers om gespecialiseerde cocktails te maken voor de detectie van de cytokine van belang10,11. Bovendien, de trouw van flow cytometrie is gebaseerd op antilichaam klonen die specifiek en krachtig binden aan hun doel. Het gebruik van verschillende antilichaamklonen kan wisselende resultaten veroorzaken en leiden tot onnauwkeurige conclusies, waardoor de methode moeilijk te standaardiseren12. Verder kan de analyse van gegevens die via stroomcytometrie worden verzameld, en dus conclusies uit de gegevens, sterk variëren tussen gebruikers op basis van hoe poorten zijn ingesteldop 13,14. Om deze redenen is flow cytometrie niet ideaal voor nauwkeurige kwaliteitscontrole tijdens de ontwikkeling van celtherapie.

De beoordeling van genomische methylatie op specifieke genloci is een alternatieve methode om de celidentiteit te bepalen. De reden voor het gebruik van DNA-methylatie om specifieke celtypen te identificeren is beschreven in meerdere artikelen en is gebaseerd op specifieke methylatiepatronen die aanwezig zijn in een bepaalde celpopulatie15,16,17. In doelcellen bevatten bepaalde sites niet-gemethyleerde nucleotiden, terwijl deze sites in niet-doelcellen worden gemethyleerd. Dit patroon kan worden gedetecteerd door middel van bisulfite conversie, een proces dat uitsluitend omgezet niet-gemethyleerde cytosine nucleotiden (C) uracil (U). Primers en sondes kunnen worden ontworpen tegen de omgebouwde sites, vervolgens versterkt en gedetecteerd door qPCR16.

De test die hierin wordt beschreven meet de frequentie van immuuncelsubtypen binnen heterogene populaties door het aantal specifieke niet-gemethyleerde loci te kwantificeren in vergelijking met een huishoudingsgen. Kopieën van de niet-gemethyleerde regelgevende elementen voor het CD8 B-gen worden gemeten in de CD8-test, FoxP3 in Treg en IL-17 in Th17 in deze test. Deze loci werden geïdentificeerd door het isoleren van de specifieke celpopulatie van belang (bijvoorbeeld CD8+ T-cellen) en het uitvoeren van bisulfite sequencing om loci te identificeren die niet gemethyleerd zijn in alleen dat celtype15. Primers en sondes worden ontwikkeld tegen de uniek niet gemethyleerde loci en monsters worden geanalyseerd via qPCR. Een standaardcurve van bekende kopienummers wordt gemaakt van verdunningen van een standaardplasmid met een hoog kopienummer, waardoor een Ct-waarde kan worden omgezet naar een transcript-kopienummer.

Om de prestaties van de test te evalueren, zijn controlemonsters vereist, waaronder een referentiegDNA en een calibrator plasmid. De referentie genomic materiaal is een gepoold bloedmonster van meerdere donoren met bekende immuuncel frequenties en wordt gebruikt voor een kwaliteitscontrole (QC) test prestatiecontrole. De calibrator monster is een gesynthetiseerde plasmid die de CD8, FoxP3, en GAPDH gen sequenties in een equimolar ratio bevat. Het wordt gebruikt als een maatregel van de bisulfite conversie-efficiëntie, omdat bisulfite conversies binnen verschillende genomische regio's zal variëren in efficiëntie. De verhouding van het doel tot GAPDH binnen de calibrator is 1, maar door verschillen in de bisulfite conversie-efficiëntie, kan de verhouding variëren. Deze kalibratiefactor wordt toegepast op de CD8- en Treg-tests. FoxP3, het gen dat wordt gebruikt in de Treg-test, bevindt zich op het X-chromosoom. Omdat deze test alleen niet-gemethyleerde kopieën van FoxP3 meet, en slechts één exemplaar van FoxP3 in Tregs is ongemethyleerd, is deze test geslachtagnost en kan worden gebruikt met zowel mannelijke als vrouwelijke monsters18. De Th17-test maakt geen gebruik van een calibratormonster of GAPDH als huishoudingsgen. In plaats daarvan is een andere primerset gericht op de gemethyleerde loci die aanwezig is in niet-Th17-cellen en wordt het totale aantal cellen weerspiegeld door de som van de gemethyleerde en niet-gemethyleerde kopieën van IL-17. De gegevens die zijn verkregen uit de qPCR worden ingevoerd in een vooraf ingestelde analysesjabloon die kwaliteitscontroles op de gegevens uitvoert en het percentage van de doelcel binnen de startpopulatie berekent. Dit biedt geautomatiseerde en onpartijdige gegevensanalyse, waardoor de subjectiviteit van de gebruiker wordt weggenomen en de standaardisatiemogelijkheden worden verbeterd.

Deze test maakt gebruik van gDNA, die kan worden geïsoleerd door een leukapheresis procedure met behulp van gekweekte of vaste cellen, of bevroren cel pellets. De lage steekproefvereiste, flexibiliteit in monsteruitgangsmateriaal, hoge nauwkeurigheid en gestandaardiseerde analyse richten zich op de beperkingen die verband houden met stroomcytometrie en zijn ideaal voor kwaliteitscontroledoeleinden tijdens de ontwikkeling van celtherapieprocessen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle menselijke monsters werden verkregen uit een commerciële bron volgens hun richtlijnen voor menselijke onderzoeksethiek.

1. Genomische DNA-isolatie

OPMERKING: Genomische DNA-isolatie wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare kit (zie Materiaaltabel)van elke hematopoietische cellen, zoals perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's), gezuiverde T-cellen of een ander hematopoietisch celtype. In dit experiment werden perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en T-cellen van drie verschillende menselijke donoren gebruikt.

  1. Plaats 1-2 x 106 hematopoietische cellen in een conische buis en centrifuge op 400 x g gedurende 10 min.
  2. Aanzuigen van de supernatant volledig.
  3. Voeg 350 μL lysis/bindingbuffer toe aan het monster en incubeer gedurende 10 min bij 55 °C.
  4. Voeg 50 μL proteinase K (20 mg/mL) toe aan 350 μL celsuspensie en vortex gedurende 30 s.
  5. Voeg 50 μL DNA-bindende paramagnetische kralen en 400 μL van 100% isopropanol toe en incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur (RT).
  6. Plaats de buis op een magnetisch rek voor 2 min en verwijder de supernatant, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de kralen niet worden verstoord. Het DNA is bij deze stap gebonden aan de magnetische kralen.
  7. Voeg 950 μL wasbuffer 1 toe. Vortex voor 30 s en herhaal stap 1.6.
  8. Herhaal stap 1.7.
  9. Voeg 950 μL wasbuffer 2 toe. Vortex voor 30 s en herhaal stap 1.6.
  10. Voeg 100 μL elutiebuffer en vortex toe gedurende 2 min. Plaats de buis gedurende 1 min op een magnetische standaard en breng het supernatant met het gDNA naar een nieuwe buis.
  11. Gebruik 1 μL van het gDNA geïsoleerd van de hematopoietische cellen om de zuiverheid van het gDNA te meten door spectrofotometrie met behulp van een fluorimeter door het verkrijgen van de OD op 260 nm, 280 nm en 230 nm. Zorg ervoor dat de verhouding van de optische dichtheid (OD-verhouding) op 260 en 280 nm tussen 1,7-2,0 ligt en de OD-ratio op 260 en 230 nm tussen 1,5-2,4 ligt.

2. Monsterbereiding

  1. Verwarm een thermomixer voor op 56 °C.
  2. Label 2 mL buizen voor alle monsters, calibrator, en referentiemateriaal.
  3. Verdun de monsters en calibrator met de elutiebuffer (verkrijgbaar met de kit die wordt gebruikt voor stap 1) bij RT.
    1. Voor alle experimentele monsters moet u het gDNA verdunnen tot een totaal volume van 142 μL. Verdun bijvoorbeeld 4 μL gDNA bij 100 ng/μL in 138 μL elutiebuffer.
      LET OP: 400-1.200 ng van gDNA kan worden gebruikt voor de test.
    2. Verdun 75 μL van de calibrator tot een totaal volume van 142 μL.
    3. Controleer de referentiegDNA-concentratie met een spectrofotometer, met TE (pH = 8,0) als een blanco.
    4. Verdun 1.000-1.200 ng van het referentie-gDNA tot een totaal volume van 142 μL. Verdun bijvoorbeeld 10 μL referentiegDNA bij 100 ng/μL in 132 μL elutiebuffer.
  4. Incubeer de buizen bij 56 °C gedurende 5 min bij 900 tpm in een thermomixer. Kort spin down de buizen om de monsters te verzamelen.

3. Bisulfite conversie

OPMERKING: Zorg ervoor dat de incubatietijden tijdens de bisulfite conversie de aanbevolen tijden volgen. Over-incubatie of onder-incubatie zal invloed hebben op de resultaten van de test.

  1. Stel een thermomixer in op 80 °C.
  2. Voeg 270 μL ammoniumbisulfiet en 90 μL tetrahydrofurfurylalcohol (THFA) toe aan alle buizen. Vortex om volledig te mengen en kort draaien van de monsters om de vloeistof te verzamelen aan de onderkant.
  3. Incubeer de buizen in een thermomixer bij 80 °C voor 45 min bij 900 tpm. Bij gebruik van een warmteblok, vortex de buizen voor 1-2 s elke 4,5 min tijdens de incubatie.
  4. Draai kort de monsters en laat afkoelen tot RT voor 3-5 min alvorens verder te gaan met stap 4 of 5. Het uiteindelijke volume moet ~500 μL zijn.

4. CD8 en Treg testen

  1. DNA-zuivering na bisulfiteconversie
    OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare DNA-zuiveringskit (zie Tabel met materialen)op bisulfite-converted DNA. Zorg ervoor dat de reagentia voor gebruik worden opgewarmd tot RT.
    1. Voordat u met de zuivering begint, maakt u een homogeen mengsel van de DNA-isolatie paramagnetische kralen door 30 s te vortexen. Voeg ethanol en isopropanol toe aan de wasbuffers, volgens de op de flessen vermelde volumes, en stel een warmteblok in op 65 °C.
    2. Voeg bij RT 870 μL lysis/bindingbuffer en 105 μL DNA-bindende paramagnetische kralen toe aan elke buis vanaf stap 3.4. Vortex om volledig te mengen en kort spin down de buizen.
    3. Voeg 570 μL 2-propanol en vortex toe om volledig te mengen.
    4. Incubeer de buizen bij RT voor 7 min bij 50 rpm in een thermomixer of een standaard roterende mixer.
    5. Draai kort de buizen naar beneden. Plaats de buizen op het magnetische rek en uitbroed gedurende 5 min.
    6. Met de monsters nog op het magnetische rek, verwijder de supernatant zonder verstoring van de kralen.
      LET OP: Het DNA is gebonden aan de kralen.
    7. Haal de buizen uit het magnetische rek en voeg 900 μL wasbuffer 1 toe. Draai de buizen om de kralen volledig te onderbreken en vervolgens kort de buizen naar beneden te draaien.
    8. Breng de buizen terug naar het magnetische rek en uitbroed gedurende 3 min.
    9. Met de monsters nog op het magnetische rek, verwijder de supernatant zonder verstoring van de kralen.
    10. Herhaal de wasbeurten (4.1.7-4.1.9), eenmaal met wasbuffer 1, daarna twee keer met wasbuffer 2.
    11. Na het verwijderen van de supernatant, kort spin down de buizen en terug te keren naar het magnetische rek voor 3 min.
    12. Verwijder alle resterende wasbuffer 2 en verwijder de buizen uit het magnetische rek.
    13. Droog de kralen met de buisdeksels open op 65 °C gedurende 15 min.
    14. Voeg 60 μL elutiebuffer toe aan elke buis en incubeer bij RT voor 7 min bij 1.400 tpm. Als alternatief, vortex op een matige snelheid met behulp van een schuim adapter.
    15. Draai kort de buizen naar beneden en plaats op het magnetische rek voor 2 min.
    16. Breng 55 μL eluate over op een nieuwe buis zonder de kralen te storen. Het eluaat bevat het bisulfite-omgezetDNA. Het meten van de DNA-concentratie is niet nodig.
  2. QPCR instellen en uitvoeren
    1. Schakel de qPCR-machine en de computer in die de software bedient.
    2. Op de gebruikersinterface van de software maak je een nieuw experiment en selecteer je welk blok wordt gebruikt om het experiment uit te voeren.
    3. Selecteer Standaardcurve als type experiment.
    4. Selecteer indien van toepassing welke detectiechemie u wilt gebruiken. Deze test maakt gebruik van de TaqMan reagentia. Selecteer anders ROX als passieve referentie.
    5. Selecteer indien van toepassing de eigenschappen van het instrument dat als standaardwordt uitgevoerd .
    6. Definieer uw experimentele ontwerp door doelen toe te wijzen (bijvoorbeeld GAPDH of CD8 met FAM als verslaggever) en een niet-fluorescerende quencher.
    7. Voorbeeldnamen toewijzen voor de standaarden, monsters en besturingselementen.
    8. Wijs vervolgens elke putpositie toe op basis van de qPCR-plaat. Elke put vereist een doel, zoals CD8 of GAPDH, en een voorbeeldnaam. Elk monster wordt uitgevoerd in drievoud en moet worden weerspiegeld op de plaat lay-out voor het instrument.
    9. Wijs elke standaard de taakstandaard toe en geef de uiteindelijke kopienummers op volgens tabel 1.
    10. Wijs voorbeelden, calibrator toe en verwijs naar de taak Onbekend.
    11. Wijs putten aan voor geen sjabloonbesturingselement als NTC of N.
    12. Bereid de seriële verdunningen van lambda-DNA (10 ng/μL) voor om als standaard te worden gebruikt (zie tabel 1).
    13. Bereid qPCR master mix cocktails, een voor het doelceltype en een voor GAPDH (zie tabel 2). Voer alle monsters, normen en de NTC controle in drievoud.
      OPMERKING: GAPDH wordt gebruikt om het totale aantal cellen te kwantificeren en wordt parallel uitgevoerd met de doelversterking. Kopieën van niet-gemethyleerde regelgevende elementen voor het CD8 B-gen worden gemeten in de CD8-test, FoxP3 in Treg en IL-17 in Th17.
    14. Gebruik een 96 putplaat voor qPCR. Laad eerst 3 μL template DNA in de putten. Laad vervolgens 7 μL van de mastermix.
    15. Sluit de plaat af met een qPCR-film en draai de plaat kort naar beneden voordat u deze in het qPCR-instrument plaatst.
    16. Voer de qPCR uit zoals weergegeven in tabel 3.
    17. Nadat de run is voltooid, exporteert u de qPCR-gegevens als een .txt- of .xlsx-bestand.
    18. Analyseer de gegevens met behulp van de analysesjablonen voor de CD8-test en de Treg-test (zie tabel met materialen)om het Ct-gemiddelde, ct-standaarddeviatie en kopieernummer te berekenen.
Eerste plasmid kopienummer/3 μLVolumeVerdunningsmiddel DNA [1]Definitief kopieernummer per 3 μLLabel
312501000 μL-31250STD#1
31250200 μL800 μL6250STD#2
6250200 μL800 μL1250STD#3
1250200 μL800 μL250STD#4
250200 μL800 μL50STD#5
125030 μL1200 μL30SOA#6 [2]
[1] 10 ng/μL Lambda DNA in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
[2] Gebruik SOA#3 om SOA#6 voor te bereiden

Tabel 1: Bereiding van standaardverdunningen. Een 4-log verdunning normen verspreid over 31250-30 exemplaren werden bereid volgens de tabel met behulp van TE / lambda DNA als het verdunningsmiddel. Dezelfde standaard verdunningen werden gebruikt voor zowel CD8 als GAPDH. De normen werden opgeslagen bij -20 °C.

ReagentiaBedrag
Lambda DNA (50 ng/μL in TE, pH8.0)1 μL
TaqMan test0,5 μL
Water, Nuclease-vrij0,5 μL
Master Mix5 μL
Totale7 μL

Tabel 2: Bereiding van qPCR cocktail. Bereid de qPCR-mastermix voor in twee afzonderlijke buizen, elk voor CD8 en GAPDH, exclusief het sjabloon-DNA volgens de tabel.

StapTijdTempCycli
Pre-incubatie35 min95°C1x
Versterking15 sec95°C50x
1 min61°C
Cooldown5 sec42°C1x

Tabel 3: qPCR voert parameters uit voor de CD8- en Treg-test. De qPCR is uitgevoerd volgens de parameters die in de tabel zijn opgegeven.

5.

  1. DNA-zuivering na bisulfiteconversie
    1. Voer de zuiveringsstappen uit zoals beschreven in punt 4.1.
    2. Om de monsters uit te pakken, voegt u 25 μL elutiebuffer toe aan elke buis en broedt u bij RT gedurende 7 min bij 1.400 tpm. Als alternatief, vortex op een matige snelheid met behulp van een schuim adapter.
    3. Kort spin down de buizen en plaats op een magnetisch rek voor 2 min.
    4. Breng 20 μL eluate over op een nieuwe buis zonder de kralen te storen. Het eluaat bevat het bisulfite-omgezetDNA.
  2. DNA-voorversterker
    OPMERKING: DNA-voorversterker wordt aanbevolen voor doelstellingen met een lage overvloed voor nauwkeurige kwantificering via qPCR19. De Th17 methylatie test is ontworpen om voorversterking te vereisen om deze reden.
    1. Breng 2 μL bisulfite-omgezet DNA in de PCR stripbuizen. Maak een NTC buis met 2 μL water.
    2. Maak de voorversterkermastermix voor alle monsters (zie tabel 4).
    3. Voeg 23 μL van de mastermix toe aan elke buis. Sluit de buizen, vortex, en kort spin vaststelling van de buizen.
    4. Voer het voorversterkerprotocol uit op een thermocycler met behulp van een verwarmd deksel. (Tabel 5). Nadat de run is voltooid, kort spin down de buizen.
    5. Breng 2 μL van het versterkte DNA over naar nieuwe buizen en voeg 78 μL water toe, waarbij de monsters 1:40 worden verdund.
  3. qPCR instellen en uitvoeren
    1. Volg sectie 4.2 om de qPCR in te stellen en uit te voeren.
  4. Analyseer gegevens met behulp van de analysesjabloon voor de Test th17 (zie tabel met materialen)om het Ct-gemiddelde, de standaarddeviatie ct en kopieernummer te berekenen.
ReagensBedrag
Water, Nuclease-vrij9,5 μL
Hot Start PCR Master Mix12,5 μL
Th17 PCR Primer1 μL
Totale23 μL

Tabel 4: Pre-amplify het DNA voor de Th17 test. De pre-versterking reactie master mix werd bereid volgens de tabel.

StapTijdTempCycli
Pre-incubatie35 min95°C1x
Denaturation1 min95°C12x
Annealing45 sec55°C
Rek30 sec72°C
Definitieve verlenging10 min72°C1x
HoudenOnbepaalde4°C

Tabel 5: Preamplify Th17 DNA. Th17 DNA werd vooraf versterkt voor 12 cycli voor de werkelijke qPCR.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle drie methylatietesten beginnen met een invoer van gDNA en resulteren in een percentage CD8+ T-cellen, Treg- of Th17-cellen binnen de gehele celpopulatie. De gegevens die zijn gegenereerd uit de qPCR na bisulfiteconversie werden geanalyseerd met behulp van de meegeleverde analysesjabloon. Deze sjabloon gebruikte de standaardcurven die zijn verkregen uit de standaardmonsters om het kopieernummer van de doelen en het totale aantal cellen in de testmonsters te schatten. Het procentceltype werd vervolgens berekend met behulp van de formules die zijn geïntegreerd in de analysesjablonen. Figuur 1 toont representatieve gegevens uit de CD8+ test, verkregen uit het analyseren van zowel perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) als T-cellen van drie verschillende donoren met behulp van zowel flow cytometrie als de beschreven methylatietest. De trends tussen de twee methoden tussen alle donoren in beide celtypen waren vergelijkbaar. Figuur 2 toont representatieve gegevens van de Treg-test. Drie gezuiverde Treg donoren werden geanalyseerd met behulp van zowel methylatie-gebaseerde qPCR en flow cytometrie en de resultaten werden uitgezet op de grafiek getoond. De resultaten voor beide methoden waren relatief vergelijkbaar. In alle gevallen leverde flow cytometrie echter hogere waarden op. Figuur 3 toont de vergelijking van Th17 cellen gedetecteerd via stroomcytometrie en methylatie. In deze grafiek zijn er gestimuleerde en ongestimuleerde omstandigheden voor de experimentele methoden. Cellen vereisen stimulatie met PMA en ionomycine en behandeling met een eiwittransportremmer om de hoeveelheid IL-17A die in elke cel aanwezig is te verhogen, zodat deze kan worden gedetecteerd via stroomcytometrie20. Methylatiestatus kan worden gedetecteerd, ongeacht de stimulatiestatus. Flow cytometrie leverde lagere niveaus van Th17 cellen in vergelijking met methylatie. De gevoeligheid en specificiteit van de test werd aangetoond door de limiet van blanco (LOB), detectielimiet (LOD) en de beperking van de kwantificeringswaarden (LOQ) die in tabel 6worden weergegeven .

figure-results-1
Figuur 1: Stroom- en methylatievergelijking van CD8+-percentages voor zowel PBMC's als T-cellen voor drie verschillende donoren. PBMC's en T-cellen van drie verschillende donoren werden geassaid voor het percentage CD8+ T-cellen in de gehele populatie met behulp van stroomcytometrie of methylatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stroom- en methylatievergelijking van Treg-percentages voor gezuiverde Treg voor drie verschillende donoren. Gezuiverde Treg cellen werden geassaid voor het percentage treg cellen in de gehele populatie met behulp van ofwel stroom cytometrie of methylatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Stroom- en methylatievergelijking van Th17-percentages voor gestimuleerde en ongestimuleerde experimentele groepen. Gestimuleerde en ongestimuleerde T-cellen werden geanalyseerd met behulp van zowel flow cytometrie als methylatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

AssayLobLodLoQ LoQ
CD801952
Gapdh (Gapdh)0721
FoxP3 (FoxP3)0312
Th17 TpG03573
Th17 CpG03873

Tabel 6: LoB, LoD, LoQ van kopienummers voor op methylatie gebaseerde tests. Gevoeligheid en specificiteit van de test wordt beschreven door de LoB-, LoD- en LoQ-waarden verkregen door MIQE-richtlijnen21,22. In het algemeen, zo weinig als 40 exemplaren kunnen nauwkeurig worden gedetecteerd door deze tests.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de komst van nieuwe immunotherapeutica is er behoefte aan gestandaardiseerde methoden om de identiteit en zuiverheid van de immuuncellen te detecteren. Evaluatiemethoden voor in-process en release testen die robuust, gevalideerd en schaalbaar zijn, moeten nog worden vastgesteld en vormen een grote uitdaging voor de commercialisering van celgebaseerde therapieën. Terwijl flow cytometrie is momenteel de meest voorkomende methode voor immuuncel fenotypering, hoge monster kwaliteit en kwantiteit eisen maken het moeilijk voor regelmatig gebruik. Verder wordt de implementatie van stroomcytometrie in een goede productiepraktijk (GMP) omgeving beperkt door operator-afhankelijke gatingstrategieën en de eis van referentienormen voor elke gebruikte markering13,14. Hoewel is aangetoond dat geautomatiseerde gating de robuustheid van de test verbetert, is het nog geen gevestigde strategie voor kwaliteitscontrole. Terwijl genexpressieprofilering ook kan worden gebruikt om de identiteit en zuiverheid van het celtherapieproduct te karakteriseren, zijn de gegevens semikwantitatief en arbeidsintensief. Bovendien zijn RNA en microRNA relatief minder stabiel dan DNA en kunnen ze bijdragen aan het gebrek aan robuuste en reproduceerbare resultaten. Zo biedt het gebruik van de epigenetische DNA-methylatiestatus van een specifieke locus een stabiele, gemakkelijk uit te voeren, robuuste en schaalbare methode om een celtype van interesse te identificeren en te kwantificeren.

De detectie van methylatiepatronen op fenotypecellen is gebaseerd op drie kritieke stappen: Ten eerste vereist de test het gebruik van gDNA, dat is geïsoleerd volgens de beschreven methoden. Dna van hoge kwaliteit is vereist en indien niet gebruikt, kan de bisulfietconversie worden beïnvloed23,24. Als DNA van lage kwaliteit wordt verkregen, wordt verdere zuivering aanbevolen om de betrouwbaarheid van de test te garanderen. Ten tweede is een succesvolle bisulfiteconversie van de niet-gemethyleerde cytosine naar uracil vereist. De meest kritieke stap in de bisulfite conversie is DNA-denaturatie23,25. Hoge temperatuurdenaturatie met ammoniumbisulfiet, in tegenstelling tot natriumbisulfiet, verhoogt de conversie-efficiëntie en consistentie en is het aanbevolen proces voor deze tests25,26. Gebruikers moeten ervoor zorgen dat de reactie bij 80 °C plaatsvindt en dat monstervermenging vaak gebeurt. Om deze redenen wordt een digitale thermomixer aanbevolen (zie Tabel met materialen). Ten derde moet een goede pipettertechniek worden gevolgd tijdens de qPCR-bereiding. Tijdens de qPCR-reactie zijn drie technische replicaties vereist om zich te houden aan de minimale informatie voor de publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten (MIQE) richtlijnen27. Het opnemen van meer technische replicaties is aanvaardbaar, maar niet vereist. Onjuiste pipettertechniek en/of niet inclusief technische replicaties zal leiden tot onbetrouwbare qPCR-resultaten.

Als de kritieke stappen worden gevolgd en de gewenste resultaten nog steeds niet worden verkregen, kunnen meerdere besturingselementen binnen de test worden gebruikt om het probleem te lokaliseren. Een goede bisulfite conversie is de meest cruciale stap in deze test. Onjuiste bisulfiteconversie wordt gemarkeerd door een mislukte kalibratiefactor en/of referentiewaarden die door de analysesjabloon worden berekend. Als de bisulfiteconversie onjuist zou zijn uitgevoerd (bijvoorbeeld als de reactie bij RT werd uitgevoerd), zou er geen versterking zijn tijdens qPCR. Ook zou er geen versterking worden gezien als er een fout werd gemaakt tijdens de qPCR-reactievoorbereiding (bijvoorbeeld als de qPCR-mastermix niet werd toegevoegd). Deze twee problemen kunnen worden gescheiden door het onderzoeken van de standaard monsters. Versterking in de standaardmonsters, maar niet de referentie, calibrator en experimentele monsters, zou erop wijzen dat de bisulfiteconversie niet correct is uitgevoerd. Geen versterking in een van de monsters zou erop wijzen dat de qPCR niet correct werd uitgevoerd.

Hoewel deze test ingaat op de strenge steekproefvereiste en analysevariabiliteit die gepaard gaat met andere fenotyperingsmethoden, met name stroomcytometrie, zijn er beperkingen die moeten worden opgemerkt. Deze test richt zich op één locus die wordt gebruikt als een unieke id voor de doelcel, die de multiplexed-analyse verbiedt die vaak wordt uitgevoerd met flowcytometrie. Dit maakt het identificeren van complexe celtypen zoals Th17 moeilijk. Het gebruik van methylatiepatronen op één locus is echter een nauwkeurige fenotypische marker van meerdere cellen en is gebruikt in meerdere klinische studies15,16. Dit geldt vooral in Tregs waar het beoordelen van FOXP3 methylatie handtekeningen is een nauwkeurige en ondubbelzinnige methode voor het opsporen van echte Tregs uit voorbijgaande FOXP3 uitdrukken cellen28. Het verlies van multiplexed analyse wordt gecompenseerd door de nauwkeurigheid van de ondervraagde loci. Toekomstige iteraties van de test kunnen meerdere qPCR kleurstoffen en quenchers omvatten om de detectie van meerdere loci in één qPCR-reactie mogelijk te maken.

Deze test kan worden gebruikt als een alternatieve methode voor flow cytometrie bij het bepalen van celfenotype en identiteit. Opgemerkt moet worden dat deze test niet de exacte waarden oplevert die cytometrie doet (Figuren 1-3). Dit is deels te wijten aan de variabiliteit van de gegevensanalyse in verband met flow cytometrie. Afhankelijk van de gatingstrategie kunnen de resultaten van flow cytometrie aanzienlijk variëren. Dit is vooral het geval bij het gebruik van complexe kleuringprotocollen om te kijken naar intracellulaire doelen, zoals IL-17, waarbij de variatiecoëfficiënt (CV) kan oplopen tot 15%14. Tussen meerdere gebruikers, de test consequent gepresenteerd had een CV van <15%, ter ondersteuning van de robuustheid van de test en verbeterde standaardisatie mogelijkheden. De grootste verschillen tussen epigenetische en flow cytometrie-gebaseerde fenotypering wordt gezien wanneer celstimulatie nodig is(figuur 3). De detectie van Th17 cellen via flow cytometrie werd bereikt met behulp van een gemeenschappelijk protocol voor T-cel stimulatie en intracellulaire cytokine kleuring29,30,31. De verschillen in Th17 fenotypering tussen epigenetische meting en stroomcytometrie kunnen te wijten zijn aan de kinetiek van il-17 productie. Hoewel de methylatiesignalen stabiel zijn, kost de eiwitproductie tijd en moet deze in voldoende hoeveelheden aanwezig zijn om te worden gedetecteerd door fluorescerende antilichamen20,32. De 6 uur incubatie met eiwit transportremmer en celstimulatie cocktail kan nodig zijn om het niveau van Th17 cellen gedetecteerd via epigenetische gebaseerde fenotyperingsmethoden te zien. Meer studies zijn nodig om de precieze reden te bepalen waarom de waarden niet overeenkomen en bepalen de meest nauwkeurige fenotyperingsmethode.

In dit rapport beschrijven we hoe immuunceltypen in een heterogeen mengsel van cellen op een eenvoudige en robuuste manier kunnen worden geïdentificeerd en kwantificeerd. De tests zijn ontworpen en geoptimaliseerd voor potentieel gebruik voor in-process en release testen van cel-gebaseerde therapieën. De beschreven tests voldoen aan de eis dat hooggekwalificeerde grondstoffen moeten worden gebruikt in celtherapietoepassingen. Door de tekortkomingen van stroomcytometrie en andere moleculaire methoden zoals stabiliteit, monstervereisten, voorafgaande stimulatie, cellulaire permeabilisatie voor intracellulaire kleuring en subjectiviteit van gegevensanalyse aan te pakken, zijn de beschreven tests in lijn met de doelstellingen van commercialisering van cel-gebaseerde therapieën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon en Uma Lakshmipathy zijn in dienst van Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans en Ulrich Hoffmueller zijn respectievelijk oprichter en medewerkers van het bedrijf Epiontis. Geen schriftelijk bijstand werd gebruikt bij de productie van dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het project werd gefinancierd door Thermo Fisher Scientific Intramural grant.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf22363344
Analysesjabloon voor CD8-assayKlik hier
Analysesjabloon voor Th17-assayKlik hier
Analysesjabloon voor Treg-assayKlik hier
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blauw/rood/violet6/geelThermo Fisher ScientificA29004
CTS PureQuant CD8+ T-cell assayThermo Fisher ScientificA43674
CTS PureQuant Th17 AssayThermo Fisher ScientificA43676
CTS PureQuant Treg AssayThermo Fisher ScientificA43675
Dynabeads SILANE Genomic DNA KitThermo Fisher Scientific37012DWordt gebruikt voor genomische DNA-isolatie en -zuivering na bisulfietconversie. Bevat elutiebuffer om monsters te verdunnen.
DynaMag-2 MagnetThermo Fisher Scientific12321DWordt gebruikt als magnetische houder tijdens DNA-isolatie en -zuivering
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping KitThermo Fisher ScientificA42923
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping KitThermo Fisher ScientificA42927
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping KitThermo Fisher ScientificA42925
Eppendorf SmartBlock 2 mLEppendorf5362000035
Eppendorf ThermoMixer CEppendorf5382000023
HulaMixer Sample MixerThermo Fisher Scientific15920DAanbevolen monsterschudder
NanoDropThermo Fisher ScientificND 1000
Nonstick, RNase-vrije Microfuge Tubes, 1,5 mLApplied BiosystemsAM12450
QuantStudio 12S FlexApplied Biosystems4470661
TE, pH 8,0, RNase-vrijThermo Fisher ScientificAM9849
Vortex MixerThermo Fisher ScientificH2KT17113

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
  2. Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155(2018).
  3. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
  4. Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25(2009).
  5. Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  6. Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
  7. Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
  8. Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
  9. Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
  10. Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
  11. Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
  12. Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
  13. Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396(2012).
  14. Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126(2017).
  15. Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  16. Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46(2015).
  17. Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
  18. Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
  19. Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
  20. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
  21. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  22. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
  23. Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
  24. Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
  25. Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150(2008).
  26. Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
  27. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
  30. Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
  31. Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
  32. Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Epigenetic Based Quantitative PCRDNA Methylation AnalysisBisulfite ConversionGenomic DNA IsolationImmune Cell PurityCD8 T Cell AssayRegulatory T Cell AssayTh17 T Cell AssayAutomated Data AnalysisCell Therapy Manufacturing

Gerelateerde artikelen