Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de evaluatie van de elektromechanische effecten van GtACR1 activering bij konijnencardiomyocyten. We geven gedetailleerde informatie over celisolatie, kweek- en adenovirale transductie, en over functionele experimenten met de patch-clamp en koolstofvezel technieken.

Samenvatting

In de afgelopen twee decennia zijn optogenetische instrumenten opgericht als krachtige middelen om cel-type specifieke activiteit in prikkelbare weefsels, waaronder het hart, te moduleren. Terwijl Channelrhodopsin-2 (ChR2) is een gemeenschappelijk instrument om het membraan potentieel in cardiomyocyten (CM) depolariseren, potentieel uitlokken actie potentials (AP), een effectief instrument voor betrouwbare uitschakeling van CM activiteit is ontbreekt. Er is voorgesteld om anion channelrhodopsins (ACR) te gebruiken voor optogenetische remming. Hier beschrijven we een protocol om de effecten van het activeren van de natuurlijke ACR GtACR1 van Guillardia theta in gekweekt konijn CM te beoordelen. Het protocol omvat CM isolatie van konijnenhart, zaaien en kweken van de cellen voor maximaal 4 dagen, transductie via adenovirus codering voor de licht-gated chloride kanaal, voorbereiding van patch-klem en koolstofvezel setups, data verzameling en analyse. Met behulp van de patch-clamp techniek in hele cel configuratie kan men licht geactiveerde stromen (in spanning-klem modus, V-klem) en AP (huidige-klem modus, I-klem) op te nemen in real time. Naast patch-clamp experimenten, voeren we contractility metingen voor functionele beoordeling van CM activiteit zonder verstoring van de intracellulaire milieu. Om dit te doen, cellen zijn mechanisch voorgeladen met behulp van koolstofvezels en contracties worden geregistreerd door het bijhouden van veranderingen in sarcomere lengte en koolstofvezel afstand. Data-analyse omvat de beoordeling van de AP-duur van I-klem opnames, piekstromen van V-klem opnames en krachtberekening van koolstofvezelmetingen. Het beschreven protocol kan worden toegepast op het testen van biofysische effecten van verschillende optogenetische actuatoren op CM-activiteit, een voorwaarde voor de ontwikkeling van een mechanistisch begrip van optogenetische experimenten in hartweefsel en hele harten.

Inleiding

ChR-gemedieerde fotostromen werden voor het eerst opgenomen in de oogvlek van eencellige groene algen^1,2. Kort na genetische klonen en heterologe expressie van Chlamydomonas reinhardtii ChR1 en ChR2, chr werden gebruikt als instrumenten om het membraan potentieel in Xenopus eicellen en zoogdiercellen te veranderen door licht^3,4. Kation niet-selectieve ChR depolariseren het membraan van cellen met een rustmembraan potentieel dat negatief is voor de omkering potentieel van ChR. Ze kunnen dus worden gebruikt om AP uit te lokken in prikkelbare cellen, waaronder neuronen en CM, waardoor optische pacing^5,6.

Aanvullend op kation ChR, licht aangedreven proton, chloride en natriumpompen^7,8,9 zijn gebruikt om neuronale activiteit te remmen^10,11,12. Deze laatste hebben echter beperkingen, die hoge lichtintensiteiten en aanhoudende verlichting vereisen, omdat één ion per geabsorbeerd foton wordt vervoerd. In 2014 beschreven twee onafhankelijke studies van Wietek et al. en Berndt et al. de omzetting van kation-geleidende ChR in ACR via mutaties in het kanaal porie^13,14. Een jaar later werd natuurlijke ACR ontdekt in de cryptophyte Guillardia theta (GtACR)¹⁵. Zoals ontworpen ACR toonde resterende kation geleiding, werden ze vervangen door natuurlijke ACR, gekenmerkt door een grote single-channel geleiding en hoge lichtgevoeligheid¹⁵. GtACR werden gebruikt om neuronale activiteit het zwijgen op te leggen door het membraanpotentieel te polariseren naar het omkeringspotentieel van chloride^16,17. Govorunova et al. toegepast GtACR1 op gekweekte rat ventriculaire CM en toonde efficiënte fotoremming bij lage lichtintensiteit niveaus die niet voldoende waren om eerder beschikbare remming tools te activeren, zoals de protonpomp Arch¹⁸. Onze groep meldde onlangs dat GtACR1-gemedieerde fotoinhibitie van CM is gebaseerd op depolarisatie en dat GtACR1 kan ook worden gebruikt, dus voor optische pacing van CM¹⁹.

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de elektrofysiologische en mechanische effecten van GtACR1 fotoactivatie op gekweekte konijn ventriculaire CM. We beschrijven eerst celisolatie, kweek en transductie. Elektrofysiologische effecten worden gemeten met behulp van hele cel patch-klem opnames. Lichtgemedieerde stromen bij een bepaalde membraanspanning worden beoordeeld in V-klemmodus. Membraan potentiële dynamiek worden gemeten tijdens het elektrisch of optisch pacing CM (I-klem modus). Optische remming van elektrisch geactiveerde AP wordt getest met behulp van aanhoudende lichttoepassing. Mechanische effecten worden gemeten met behulp van koolstofvezels in combinatie met beeldvorming-gebaseerde tracking van sarcomere lengte. Om dit te doen, worden optisch paceable cellen mechanisch voorgeladen door twee koolstofvezels aan het plasmamembraan dichtbij tegenovergestelde celeinden te bevestigen. Sarcomere lengte veranderingen worden geregistreerd tijdens optische of elektrische pacing. Ten slotte wordt fotoinhibitie gemeten tijdens elektrische veldstimulatie van de cellen en worden gegenereerde krachten geanalyseerd.

Het protocol bevat de volgende stappen in het stroomdiagram in figuur 1:konijnendiepe anesthesie, thiopentale overdosisinjectie, hartexcisie, Langendorff-perfusie en weefselvertering, mechanische dissociatie van het weefsel om cellen vrij te geven, microscopische analyse van CM-opbrengst, kweek van CM, transductie met adenovirus type 5, gevolgd door incubatie en functionele experimenten.

Figuur 1: Stroomschema van het protocol dat wordt gebruikt om elektrisch en optisch paceable CM te verkrijgen. Harten worden verwijderd van konijnen 9-10 weken oud, en hartweefsel wordt verteerd terwijl ze geperfundeerd met behulp van een Langendorff setup. Cellen worden vrijgegeven door mechanische agitatie. De CM-opbrengst wordt onder een microscoop geteld. CM worden gekweekt, getranstmet adenovirus type 5 en functionele experimenten worden uitgevoerd 48-72 uur na transductie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

Alle konijnenexperimenten werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement betreffende de bescherming van voor wetenschappelijke doeleinden gebruikte dieren en goedgekeurd door de lokale autoriteiten in Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Duitsland).

1. Oplossingen voor celisolatie

1. Bereid de oplossingen voor de celisolatie voor met water van de volgende eisen (tabel 1) en volgens de ionische samenstellingen in tabel 2.
   OPMERKING: CaCl₂ en MgCl₂ worden toegevoegd uit 1 M stock oplossingen.

	Waterbehoefte
Geleidbaarheid [μS/cm] bij 25 °C	0.055
Pyrogen [EU/mL]	< 0,001
Deeltje (grootte > 0,22 μm) [1/mL]	≤ 1
Totaal organische koolstof [ppb]	< 5
Micro-organismen [CFU/mL]	≤ 1
RNase [ng/mL]	< 0,01
DNase [ng/mL]	< 4

Tabel 1: Watervereisten.

	Fysiologische zoutoplossing (1)	Laag calcium, hoge kaliumoplossing (2)	Enzymoplossing (3)	Blokkeringsoplossing
NaCl [mM]	137	137	137	137
KCl [mM]	4	14	14	14
HEPES [mM]	10	10	10	10
Creatine [mM]	10	10	10	10
Taurine [mM]	20	20	20	20
Glucose [mM]	10	10	10	10
MgCl2 [mM]	1	1	1	1
Adenosine [mM]	5	5	5	5
L-Carnitine [mM]	2	2	2	2
CaCl2 [mM]	1	-	0.1	0.1
Na-Heparin [IU/L]	5000	-	-	-
EGTA [mM]	-	0.096
Collageentype 2, 315 U/mg [g/L]	-	-	0.6	-
Protease XIV [g/L]	-	-	0.03	-
Runderserumalbumine [%]	-	-	-	0.5
Osmolarity [mOsmol/L]	325 ± 5	345 ± 5	345 ± 5	345 ± 5

Tabel 2: Oplossingen voor CM-isolatie.

2. Pas alle oplossingen aan op pH 7.4 bij 37 °C en controleer de osmolariteit.
   OPMERKING: Los de enzymen (Collagenase type 2 en Protease XIV) direct voor de hartexcisie op. Zuurstof alle oplossingen voorafgaand aan het gebruik.

2. Voorbereiding van de Langendorff-perfusieopstelling

LET OP: De gebruikte installatie is op maat gemaakt. Zoals afgebeeld in figuur 2,bestaat de opstelling uit drie watergecoate reservoirs (1-3), een spiraalvormige contrastroomwarmtewisselaar (4) en een met water gevest perfusievat (5).

Figuur 2: Langendorff-perfusieopstelling geoptimaliseerd voor konijnencelisolatie. (1-3) Watergecoate reservoirs met (1) fysiologische zoutoplossing, (2) laag calcium, een hoge kaliumoplossing en (3) enzymhoudende cardioplegische oplossing. (4) Spiraal tegenstroom warmtewisselaar en (5) water gecoate collectetank. De instroom van het watergecoate systeem is de spiraalwarmtewisselaar (de temperatuur van de oplossingen die de perfusiecanule aan het einde van de warmtewisselaar verlaat, moet constant zijn bij 37 °C), gevolgd door het perfusievat en de drie reservoirs. Alle oplossingen zijn zuurstofrijk (stippellijn). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1. Schakel de pomp van het waterbad in om water bij 38 °C in het warmtewisselaarsysteem te laten circuleren en verwarm alle oplossingen voor op 37 °C.
   OPMERKING: De temperatuur bij de uitstroom van (4) moet worden gecontroleerd en constant bij 37 °C.
2. Vul de drie reservoirs met de bijbehorende oplossing en was elke lijn (zwart) met de bijbehorende oplossing. Vul de hoofdlijn (blauwe) lijn aan het einde zonder luchtbellen met behulp van oplossing (1).
   LET OP: Oxygener de oplossingen voorafgaand (10 min) en tijdens het gebruik. Vul de lijn van reservoir (3) tot de kraan met een laag calcium, hoge kaliumoplossing.
3. Bereid een hechting voor om het hart rond de aorta te binden bij de canule.

3. Celisolatie

1. Bereid de volgende spuiten voor.
   1. Voor sedatie/anesthesie: Meng 0,5 mL/kg lichaamsgewicht esketamine hydrochloride (25 mg/mL) en 0,2 mL/kg lichaamsgewicht xylazine hydrochloride (2%).
   2. Vul twee spuiten met 12 mL NaCl-oplossing (0,9%).
   3. Bereid 6 mL van 12,5 mg/mL Na-thiopental, opgelost in 0,9% NaCl oplossing.
   4. Vul 0,2 mL esketaminehydrochloride (25 mg/mL) in een spuit.
   5. Verdun 0,2 mL Na-heparine (5.000 IU/mL) in 1 mL van 0,9% NaCl-oplossing (eindconcentratie 1.000 IE/mL).
2. Verdovende/verdovende konijnen (9-10 weken, Nieuw-Zeelands wit konijn, vrouwtje of mannetje, ~2 kg) via intramusculaire injectie van esketaminehydrochloride en xylazinehydrochloride (stap 3.1.1).
   OPMERKING: Konijnen hebben minstens 10 min nodig om volledig te worden verdoofd; exacte duur is afhankelijk van hun lichaamsgewicht. Bevestig anesthesie met het verlies van de rechterreflex.
3. Scheer de borst en de oren waar de aderen zich bevinden.
4. Steek een flexibele canule in de oorader, bevestig deze met tape en spoel deze door met 0,9% NaCl-oplossing.
5. Injecteer 1 mL Na-heparine oplossing intraveneus en spoel met 0,9% NaCl-oplossing.
6. Injecteer 0,2 mL esketaminehydrochloride, spoel opnieuw met 0,9% NaCl-oplossing en injecteer Na-thiopental tot apneu.
   OPMERKING: Konijn mag niet reageren op de pedaalontwenningsreflex.
7. Open de borst aan de linkerkant en verwijder het hartzakje.
8. Start de timer wanneer het hart wordt weggesneden en was het hart twee keer in fysiologische zoutoplossing.
   OPMERKING: Gebruik een schaar met ronde tips om onopzettelijke schade aan hartweefsel te voorkomen.
9. Cannulate de aorta in een bad met fysiologische zoutoplossing en houd al het weefsel in oplossing. Schakel het Langendorff-perfusiesysteem in (fysiologische zoutoplossing (1), snelheid 24 mL/min).
10. Breng het hart naar de Langendorff-perfusieopstelling, sluit de aorta aan op het perfusate mondstuk en bind het hart stevig vast met de hechting rond de aorta aan de canule (< 1 min).
    LET OP: Vul de canule vooraf met fysiologische zoutoplossing, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de canule komen tijdens het transport van de cannulation site naar de Langendorff setup, sluit bubble-free aan.
11. Bezielen het hart tot al het bloed is weggespoeld (2-3 min).
12. Schakel over op een laag calciumgehalte, een hoge kaliumoplossing (2). Perfuse voor 2 min nadat het hart is gestopt met kloppen en overschakelen naar enzymoplossing.
13. Begin de enzymoplossing, na 2 min vanaf het begin van de spijsvertering, terug in het reservoir te recirculatieen. Verlaag de snelheid naar 16 mL/min na 5 min spijsvertering.
14. Wanneer het weefsel zacht lijkt (40-50 min spijsvertering), snijd het hart van de canule en scheid de linker ventrikel.
15. Laat cellen los door mechanische dissociatie (voorzichtig het weefsel uit elkaar trekken met een pipet en een fijne tangen om het weefsel vast te houden) in het blokkeren van de oplossing.
16. Filtreer de celsuspensie door een gaas (poriegrootte van 1 mm²⁾en centrifugeer gedurende 2 min bij 22 x g (gravitatieversnelling).
17. Verwijder het supernatant dat niet-myocyten bevat en schors CM opnieuw op in blokkerende oplossing.

4. Culturing van CM

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden.

1. Verdun Laminin (van Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoomkeldermembraan, 1 mg/mL) 1:10 in steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder Ca²⁺/Mg²⁺⁾tot een eindconcentratie van 100 μg/mL.
2. Bereid kweekmedium in M199-Medium met de supplementen zoals aangegeven in tabel 3.

	Celkweekmedium in M199-Medium
Creatine [mM]	5
L-Carnitine hydrochloride [mM]	2
Taurine [mM]	5
Na-Pyruvat [mM]	1
Insuline (runderalvleesklier) [U/L]	0.25
Cytosine-β-D-arabinofuranoside [mM]	0.01
Gentamycine [mg/mL]	0.05

Tabel 3: Celkweekmedium.

3. Steriele filteroplossing (0,22 μm) en voeg 5% Foetaal Runderserum toe.
4. Voor patch-clamp experimenten autoclave coverslips ø 16 mm, dikte nr. 0, coat ze met 100 μg/mL laminine direct voor het kweken.
5. Voor experimenten met koolstofvezel, coat het petrischaaloppervlak met poly(2-hydroxyethyl methacrylaat) (poly-HEMA, 0,12 g/mL in 95:5 EtOH:H₂0) en laat het stollen.
   OPMERKING: Cellen 'plakken' niet aan poly-HEMA gecoate petrischalen; dit is cruciaal voor hun wrijvingsloze samentrekking in celmechanica studies.
6. Na opnieuw geschorst CM hebben geregeld (~ 10-15 min), verwijder de supernatant, en vervolgens opnieuw schorsen CM in cultuur medium.
7. Tel CM met een Neubauer-kamer en zaad met een doeldichtheid van 17.500 cellen/mL, hetzij op laminingecoate coverslippen of in poly-HEMA gecoate petrischalen.
8. Incubeer cellen bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 3-4 uur. Ruil het medium (37 °C) van de coverslipine cellen.
9. Voeg adenovirus (type 5) codering voor GtACR1-eGFP bij een veelheid van infectie (MOI) van 75 en start functionele experimenten na 48 uur.
   LET OP: Houd na transductie de cellen in het donker. Gebruik rode verlichting bij het werken met blauwe of groene lichtgeactiveerde eiwitten. Een commercieel verkrijgbaar adenoviraal leveringssysteem (zie Tabel met materialen)wordt gebruikt om de genen die GtACR1-eGFP coderen, te klonen in de adenovirale vector. De insert van belang, hier GtACR1-eGFP, is PCR versterkt en vervolgens gecombineerd met een adenovirale vector met inbegrip van een CMV promotor in een IN-Fusion Klonen reactie. De CMV (menselijke cytomegalovirus) promotor wordt vaak gebruikt om overexpressie van transgenen in zoogdiercellen te stimuleren. eGFP is een verbeterd groen fluorescerend eiwit afkomstig van Aequorea victoria met een excitatiemaximum van 488 nm en een emissiemaximum van 507 nm. Adenovirus (type 5) werd extern geproduceerd in Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlijn, Prof. Dr. Michael Schupp.
   LET OP: Adenovirale transductie is gecategoriseerd als BSL-2 veiligheidsniveau werk, en passende veiligheidsmaatregelen zijn wettelijk verplicht.

5. Functionele experimenten

OPMERKING: Opnames worden uitgevoerd met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Filtreer het transmissielicht door een rode band-pass filter (630/20 nm) in de condensor om co-activering van GtACR1 te voorkomen.

1. Patchklemopstelling
   1. Gebruik een versterker in combinatie met een analoog-naar-digitale converter. Gebruik een software voor gegevensverwerving om huidige en spanningsgegevens vast te leggen (zie Tabel met materialen).
      OPMERKING: De opgenomen gegevens worden gedigitaliseerd op 10 kHz en gefilterd op 5 kHz.
2. Koolstofvezel setup
   1. Gebruik een camera om koolstofvezel positie en sarcomere lengte te detecteren door het bijhouden van veranderingen in het optische contrast (koolstofvezels verschijnen als donkere structuren, bedekt op de gestreepte cel patroon). Een schematische weergave van de installatie wordt weergegeven in figuur 3.
      OPMERKING: Sarcomere lengte wordt berekend in real time met behulp van een snelle Fourier transformatie (FFT) van het vermogensspectrum van het strepenpatroon.

Figuur 3: Regeling met experimentele opstelling voor koolstofvezelmetingen. (Tekenen is niet op schaal). Twee koolstofvezels zijn bevestigd op een cel en hun positie wordt gecontroleerd door een piëzo positioner. De pacer wordt gebruikt voor elektrische veldstimulatie. Multi-color LED's zijn gekoppeld aan de epifluorescentiepoort van de omgekeerde microscoop voor verlichting van cellen in het objectvlak. LED-stroom wordt aangestuurd via een speciale control box, die digitale pulsen ontvangt via de digitale uitgang van de digitaal-analoog-converter (DAC). De DAC communiceert via analoge uitgang met de fluorescentiesysteeminterface. Een zwart-wit camera (774 pixels bij 245 lijnen) voor cellulaire beeldvorming is aangesloten op de computer om sarcomere lengte en koolstofvezel buigen volgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Getimede verlichting
   1. Geef licht voor fluorescentiemicroscopie en activering van lichtgatige ionenkanalen via een externe op maat gemaakte LED-regelkast, bestaande uit drie LED's van verschillende kleur (460 nm, 525 nm, 640 nm, zie Materiaaltabel).
   2. Wijzig de gui-code (microcontroller en grafische gebruikersinterface) voor de besturingsbox om de LED te bedienen via externe Time to Live (TTL) pulsen, gegenereerd in softwareprotocollen voor gegevensverwerving (zie Tabel met materialen). Stuur TTL pulsen naar de LED-regelkast via de digitaal-analoog-converter.
   3. Bestuur de LED en kies het aantal pulsen via de GUI. Bij ontvangst van de opdracht van de GUI start de microcontroller een proces op een nieuwe kern. In dit proces worden zowel de TTL-ingang als een control switch set van de GUI continu gecontroleerd.
   4. Wanneer de TTL-ingang positief is, schakelt de microcontroller de LED in en gaat vervolgens verder met het controleren van de TTL-ingang. Zodra het TTL-signaal weer op nul is, schakelt de microcontroller de LED uit en vermindert het aantal pulsen dat met één wordt achtergelaten. Als op enig moment de besturingsschakelaar vals is of het aantal pulsen nul is, stopt de microcontroller dit proces totdat een nieuwe opdracht is ontvangen van de GUI.
   5. Koppel direct de LED's in de backport van de microscoop.
4. Bepaling van de lichtintensiteit in het objectvlak
   1. Meet het verlichte gebied met een traps micrometer (objectieve vergroting 40x, A = 0,8 mm²).
   2. Gebruik een optische vermogensmeter (zie Materiaaltabel).
   3. Definieer de instellingen voor de experimenten: excitatiegolflengte (525 nm), objectieve vergroting (40x), excitatiefilter (530/20 nm) of spiegel, en lees het lichtvermogen [W] uit bij verschillende LED-ingangsspanningen.
   4. Bereken de lichtintensiteit [W/mm^2]door het lichtvermogen [W] te delen door het verlichte gebied [mm^2](hier: 0,8 mm²).
      OPMERKING: Meet het werkelijke lichtvermogen met de respectieve protocollen in stap 5.6 om te controleren of korte lichtpulsduur van 10 ms bereik en lange duur de ingestelde waarde bevatten (Aanvullend figuur 1).
5. Voorbereiding voor patch-clamp experimenten
   1. De volgende externe en interne oplossingen voorbereiden (tabel 4; voor waterbehoeften zie tabel 1).
   2. Pas de osmolariteit met glucose aan op 300 ± 5 mOsmol/L. Aliquot de interne oplossing en bewaar op -20 °C.
      LET OP: Houd de interne oplossing op ijs voor de dag van de opname. Houd de externe oplossing op kamertemperatuur. De hier beschreven patch-clamp oplossingen waren gebaseerd op eerder gebruikte oplossingen en de Cl^- concentratie werd veranderd in lagere, meer fysiologische niveaus⁷. Voor de karakterisering van ionselectiviteit van de respectieve optogenetische actuator raden we aan om de concentraties van grote ionen (bijvoorbeeld Cl^-Na⁺, K⁺, H⁺) te variëren in de extra- en intracellulaire oplossingen¹⁹.
   3. Haal de opname-elektrode uit de pipethouder en verwijder de zilverchloridelaag uit de zilverdraad met zeer fijn schuurpapier.
      OPMERKING: Doe deze stap aan het begin van elke meetdag.
   4. Sluit de draad aan op de positieve paal van een 1.5 V batterij en dompel onder in 3 M KCl-oplossing voor zilverchloridecoating gedurende 10 min.
      LET OP: De negatieve paal is verbonden met een referentie zilverdraad ondergedompeld in de 3 M KCl oplossing.
   5. Bereid de meetkamer voor: leg siliciumvet op het frame van de meetkamer en plaats een afdekslip (diameter: 50 mm, dikte nr. 0) op de bovenkant van het frame dat de kamer is verzegeld.
   6. Zet een referentie zilver / zilverchloride pellet elektrode in het bad en sluit deze aan op het hoofdpodium.
   7. Trek 1,7 - 2,5 MΩ patch pipetten uit soda kalkglas haarvaten (buitenste diameter: 1,55 mm, binnendiameter: 1,15 mm) met een micropipette trekker (zie Tabel met materialen).
   8. Start data-acquisitiesoftware en pas de membraantest aan (puls 10 mV voor 15 ms, baseline 0 mV).

	Externe badoplossing	Interne pipetoplossing
NaCl [mM]	140	-
KCl [mM]	5.4	11
CaCl2 [mM]	1	-
MgCl2 [mM]	2	2
Glucose [mM]	10	-
HEPES [mM]	10	10
K-Aspartaat [mM]	-	119
Mg-ATP [mM]	-	3
EGTA [mM]	-	10
Ph	7.4 (NaOH)	7.2 (KOH)
Osmolarity (aanpassen met Glucose) [mOsmol/L]	300 ± 5	300 ± 5

Tabel 4: Patch-klem oplossingen.

6. Protocollen voor patchklemmen
   1. Neem het fotoactiveringsprotocol op in de V-klemmodus met een houdpotentieel van -74 mV. Gebruik lichtpulsen van 300 ms.
      OPMERKING: We raden u aan V-klemopnames uit te voeren die dicht bij het rustmembraanpotentieel van gekweekte CM liggen (gevestigd in I-klem; in onze handen tussen -79 mV en -77 mV, zowel voor trans-geïnduceerde als niet-getransviale CM¹⁹). Vers geïsoleerde cellen vertonen een gemiddelde rustmembraan potentieel van -79 mV(Aanvullende figuur 2, alle waarden na correctie voor vloeibare kruising potentieel).
   2. Neem AP op in i-klemmodus op 0 pA.
      1. Voor elektrische pacing, injecteer stroompulsen van 10 ms (helling van 0 pA naar de ingestelde waarde binnen 10 ms), 0,25 Hz en vind de drempel om AP uit te lokken. Neem AP door de huidige injecties van 50% meer dan de drempel.
      2. Gebruik voor optische pacing lichtpulsen van 10 ms, 0,25 Hz bij de minimale lichtintensiteit om betrouwbare AP uit te lokken.
   3. Neem fotoinhibitie op in i-klemmodus op 0 pA. Ontlok AP zoals beschreven in stap 5.6.2.1 en breng langdurig licht aan voor 64 s bij 4 mW/mm² na 15 elektrisch geactiveerde AP.
      OPMERKING: Figuur 6F toont een fotoinhibitieprotocol waarbij tijdens langdurig licht hogere stroominjecties worden toegepast. Vanaf 1,5 keer de drempel (hier: 0,7 nA) werd de geïnjecteerde stroom verhoogd in stappen van 0,1 nA (eindniveau: 2,2 nA). Bij alle geteste huidige amplitudes remde aanhoudende lichttoepassing ap-generatie.
      1. Als een controle-experiment, pauze elektrische stimulatie voor 64 s zonder licht toepassing.
7. Patch-klem experimenten
   OPMERKING: Voer de volgende experimenten uit in het donker (rood licht kan worden gebruikt voor blauw/groen lichtgeactiveerd gereedschap).
   1. Plaats decoverslip met cellen in meetkamer met externe oplossing en selecteer fluorescerende CM.
      LET OP: eGFP-positieve cellen kunnen worden gedetecteerd met behulp van een blauwe LED (460 nm) in combinatie met een band-pass excitatiefilter (450 nm - 490 nm), een 510 nm dichroic spiegel en een 515 nm lange-pass emissiefilter. Als andere fluorescerende tags worden gebruikt, gebruikt u overeenkomstige LED- en fluorescentiefiltersets. Als een hoge transductie-efficiëntie wordt bereikt (in onze handen >99% met het GtACR1 adenovirus), is het niet nodig om eGFP fluorescentie te controleren vóór de functionele experimenten; dit voorkomt mogelijke GtACR1 pre-activering.
   2. Vul de patch pipet met interne oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de punt zitten.
   3. Bevestig pipet aan de pipethouder, het invoegen van de opname zilverchloride gecoate zilverdraad in de interne oplossing.
   4. Na het bereiken van de cel-aangesloten configuratie, overschakelen naar hele cel modus in de data-acquisitie software met een holding potentieel van -74 mV. Scheur het membraan door voorzichtig negatieve druk toe te passen om toegang te krijgen tot de hele celconfiguratie. Dit blijkt uit een onmiddellijke toename van de gemeten capaciteit.
   5. Voer de protocollen uit die in punt 5.6 zijn beschreven.
8. Koolstofvezel techniek
   1. Produceer koolstofvezels.
      1. Gebruik glazen haarvaten met de volgende parameters: buitendiameter: 2,0 mm, binnendiameter: 1,16 mm, lengte: 100 mm (zie Materiaaltabel). Trek met behulp van een micropipettetrekker de glazen capillaire in twee pipetten van dezelfde lengte (totale versmallingslengte ~11 mm, figuur 5)tot een laatste binnendiameter van ~30 μm.
         OPMERKING: Instellingen die worden gebruikt voor de eerste en tweede trekkracht zijn respectievelijk 85,2% (verhouding tot de maximale output van de trekker) en 49,0%,.) (afhankelijk van de trekker, het type en de leeftijd van de gloeidraad).
      2. Buig de pipetten tot 45° met een zelfgemaakte microsmederij met instellingen van 12 V, 24 A (zie figuur 4 voor details van de pipet buigopstelling).
         1. Lijn de capillaire (2) uit op de rode lijn in de oriëntatiecirkel (5), houd de positionering van de capillaire constante, zodat de lengte van het buiggedeelte altijd hetzelfde is na het midden van de oriëntatiecirkel (straal van 4,5 mm).
         2. Buig de capillaire tot 45° (groene lijn) door het puntje van de capillaire met de buiger (3) naar beneden te duwen en smeed door de gloeidraad (4) op te warmen totdat de capillaire de hoek van 45° vastlegt, zelfs nadat de buiger is verwijderd.
      3. Plaats de koolstofvezels (geleverd door Prof. Jean-Yves Le Guennec) in de fijne punt van de glazen capillaire onder een stereomicroscoop. Gebruik fijne tangen met zachte buizen aan het einde om de grip te verhogen en het risico op beschadiging van de vezels te verminderen.
         OPMERKING: Deze vezels worden gekenmerkt door microstructuren, die het contactoppervlak tussen vezels en cellen verhogen, waardoor hechting²⁰wordt verbeterd.
      4. Snijd de koolstofvezels op een lengte van 2 mm en gebruik superlijm (cyanoacrylaat) om de vezel aan de voorkant van de capillaire te bevestigen.
         LET OP: Hoe langer de vezels zijn, hoe meer ze buigen bij toepassing van dezelfde kracht.
   2. Kalibreer koolstofvezels.
      1. Kalibreer de koolstofvezels met behulp van een krachttransducer met een gevoeligheid van 0,05 mN/V en een krachtbereik van 0 - 0,5 mN (zie Tabel met materialen).
         OPMERKING: Deze instelling is op maat gemaakt om compressie te meten in plaats van "pull".
      2. Bevestig de capillaire met de koolstofvezel aan een houder die wordt gecontroleerd door een micromanipulator en een piëzo motor.
      3. Plaats de punt van de vezel in contact met de krachtsensor, maar zonder enige kracht te produceren en verplaats de piëzomotor in stappen van 10 μm (totale beweging van 60 μm) naar de sensor en lees de gemeten spanning(E) in Volt uit.
         LET OP: Zorg ervoor dat de krachttransducer wordt gecontacteerd door de punt van het vrije uiteinde van de koolstofvezel.
      4. Herhaal deze metingen drie keer.
      5. Gebruik formule 1 om de kracht voor elke piëzopositie te berekenen(ΔΕ-verschil van gemeten spanning tussen de piëzo-motorstappen):
         
         OPMERKING: De gevoeligheid van de krachttransducer is afhankelijk van het model van de transducer (hier: 0,05 mN/V = 50 μN/V). De gain kan worden ingesteld op de controller.
      6. Zet de kracht [μN] tegen de piëzo-positie in. De helling komt overeen met de vezelstijfheid [μN/μm].
   3. Recordkracht van contracting CM.
      OPMERKING: Voer de volgende experimenten uit in het donker (rood licht kan worden gebruikt voor blauw/ groen licht geactiveerd gereedschap).
      1. Bedek het oppervlak van de meetkamer met poly-HEMA. Vul de meetkamer met externe badoplossing en leg een paar druppels van de gekweekte celvering in de kamer (stap 4.9).
      2. Bevestig haarvaten met koolstofvezels aan de fase micromanipulator. Selecteer GtACR1-uitdrukkende CM door de mogelijkheid te controleren om weeën te veroorzaken door toepassing van korte groene lichtpulsen. Lijn de koolstofvezels vrijwel horizontaal uit op het oppervlak van de meetkamer.
      3. Laat de eerste vezel op het celoppervlak zakken. Bevestig de tweede vezel parallel aan de eerste vezel aan de andere kant van de CM. De ideale uitlijning is bijna loodrecht op de celas.
         LET OP: Bevestig de vezel door de cel zachtjes naar het onderste oppervlak te duwen. Laat de druk los voordat u de tweede vezel bevestigt. Rek de cel niet uit door de tweede vezel te bevestigen.
      4. Nadat beide vezels zijn bevestigd aan de cel, til de vezels, zodat de cel heeft geen contact meer met het kameroppervlak en is in staat om samen te trekken zonder enige wrijving.
      5. Focus de sarcomeres in de software voor gegevensverwerving (zie Tabel met materialen)en stel het sarcomerelengtetrackingvenster(figuur 7A I(3)tussen de vezels in.
         OPMERKING: Resulterende FFT power spectrum(Figuur 7A I (2)) toont idealiter een scherpe piek, die de gemiddelde sarcomere lengte.
      6. Spoor vezelbuigen bij met behulp van de randdetectiemodule. Stel de detectiegebieden in met het rode en groene venster en definieer een drempel (rode en groene horizontale lijn) bij de eerste afgeleide van het spoor van de lichtintensiteit(figuur 7A III).
      7. Begin met het optisch tempo van de cel op 0,25 Hz (indien mogelijk, probeer sneller pacing rates) en track sarcomere lengte en vezel buigen.
         OPMERKING: De positie van de vezelhouder, de LED-trigger en de elektrische stimulatiepulsen worden aangestuurd via de software voor het verkrijgen van gegevens (zie Tabel met materialen).
      8. Na het opnemen van ten minste 15 optisch ontlokte weeën, veld-stimuleren van de cel elektrisch (zie Tabel met materialen). Zoek de drempel om weeën uit te lokken en op te nemen door 1,5 keer van de drempelspanning toe te passen.
      9. Voor het remmingsprotocol, elektrische stimuli toepassen om weeën uit te lokken en vervolgens bloot te stellen aan langdurig licht van 64 s (bij verschillende lichtintensiteiten).

Figuur 4: Pipette buigen setup. (1) De micromanipulator aan de linkerkant wordt gebruikt om de positie van de capillaire controle, en een tweede micromanipulator aan de rechterkant wordt gebruikt om het te buigen. (2) Capillair. (3) Bender. (4) Microforge. (5) Oriëntatiecirkel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Pipetmet koolstofvezel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. Gegevensanalyse

1. Patch-klem opnames
   OPMERKING: Corrigeer alle opgenomen en commandospanningen voor het vloeistofverbindingspotentieel na het experiment. Bepaal het vloeistofverbindingspotentieel in de software voor gegevensverwerving met behulp van de potentiële rekenmachine voor gereedschapsknooppunt (voor de aangegeven patchklemoplossingen in tabel 4: 14,4 mV bij 21 °C). Trek het vloeistofverbindingspotentieel af van de geregistreerde/commandospanning.
   1. Voor I-klem AP opnames, controleer elektrische pacing versus optische pacing. Bereken de AP duur (APD) op 20 en 90% repolarisatie met een op maat geschreven script (Aanvullend Materiaal). Bepaal rustmembraanpotentieel en AP-amplitude.
      OPMERKING: Bepaal de APD zoals beschreven in Wang K. et al.²¹ Het script om .abf-bestanden te laden is over het algemeen toegankelijk via de volgende link: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Gemiddelde APD-waarden voor ten minste 6 AP.
   2. Controleer voor V-klem-fotoactivering of de basislijn op 0 pA staat. Als de basislijn niet wordt aangepast aan nul. Analyseer de geregistreerde stroom veroorzaakt door 300 ms lichtpulsen bij -74 mV. Breng de gegevens over naar data-analysesoftware en bepaal de piek- en gemiddelde stationaire stroom.
2. Koolstofvezel experimenten
   1. Contractie opnames tijdens optische pacing: Laad de opgenomen gegevens in de data-acquisitie software en lees de basislijn en maxima van de koolstofvezel buigen en de sarcomere lengte veranderingen.
      OPMERKING: Gemiddelde waarden voor 10 contracties van een stabiele opname.
   2. Meet de celbreedte en bereken het doorsnedegebied van de cel met uitgaande van een elliptische doorsnede(figuur 7B II).
      OPMERKING: De formule voor het gebied van een ellips is A = π·a·b (Formule 2) waarbij a de afstand is van het midden tot het hoekpunt en b de afstand is van het midden tot het co-hoekpunt. In ons geval betekent dit een = (breedte van de cel)/2 en b = (dikte van de cel)/2. Volgens Nishimura et al.²² kan de dikte van CM worden geschat op een derde van de celbreedte, zodat A = π· (1/2)·breedte· (1/2)·dikte = π· (1/4)·breedte· (1/3)·breedte = π· (1/12)·breedte².
   3. Bereken de end-systolische kracht (F):
      
   4. Bereken de end-systolische celvervorming (ESD):
      
      OPMERKING: Verdere contractiele parameters kunnen worden geanalyseerd: rust sarcomere lengte, tijd tot piek, tijd tot 90% ontspanning, fractionele sarcomere verkorting, maximale snelheid van contractie en ontspanning (zie software acquisitie handleiding).

Resultaten

GtACR1-eGFP werd uitgedrukt in gekweekt konijn CM(figuur 6 insert) en fotostromen werden gemeten met de patch-klem techniek. Fotoactivering van GtACR1 toont grote naar binnen gerichte stromingen op -74 mV. In figuur 6A piekstroom(I_P) op 4 mW/mm² is 245 pA. AP werd elektrisch geactiveerd (figuur 6B) of optisch (figuur 6C) met stroominjecties 1,5 keer de drempel, of korte depolariserende lichtpulsen van respectievelijk 10 ms. APD-waarden analyseren, elektrisch tempo CM tonen een APD 20 van 0,24 ± 0,08 s en een APD 90 van 0,75 ± 0,17 s, terwijl optisch tempo CM een APD 20 van 0,31 ± 0,08 s en een APD 90 van 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, in het hier gepresenteerde voorbeeld APD 20_elektrisch = 0,17 s; APD 20_optisch = 0,27 s en APD 90_elektrisch = 0,61 s; APD 90_optisch = 0,68 s; Figuur 6D). Optisch tempo CM tonen een langzamerAP-begin(figuur 6D). CM-activering werd geremd bij aanhoudende verlichting (voor 64 s, 4 mW/mm²) door het membraanpotentieel te polariseren naar het omkeringspotentieel van chloride, hier -58 mV (figuur 6E). Hogere stroominjecties dan 1,5 keer de drempel ontlokken GEEN AP-generatie (figuur 6F). Gegenereerde piekkrachten werden bepaald door koolstofvezelbuiging (figuur 7B,C,E). De CM genereerde 232 μN/mm² bij elektrische pacing(figuur 7B) en 261 μN/mm² na optische pacing (figuur 7C). Langdurige groene lichtpulsen remmen weeën(figuur 7E). Na optische remming voor 64 s genereren terugkerende samentrekkingen een lagere contractiele kracht en herstellen de krachtwaarden naar baseline na ~10 weeën (pacing bij 0,25 Hz, figuur 7D)in overeenstemming met diastolisch calciumverlies van konijn CM.

Figuur 6: Representatieve patchklemopnames van elektrisch en optisch tempo/geremde CM. (A) Representatieve fotostroom bij -74 mV met een lichtpuls van 300 ms, 4 mW/mm². I_P geeft de piekstroom aan. De invoegsel toont een GtACR1-eGFP positieve cel. (B) Representatieve AP-opname bij 0 pA met behulp van een huidige helling van 10 ms, 0,6 nA om de CM. (C) Representatieve AP-opname bij 0 pA elektrisch te laten verlopen met behulp van lichtpulsen van 10 ms, 0,4 mW/mm². (D) Bovenste grafiek toont de overlay van de^10e AP van elektrisch (blauw) en optisch (groen) geactiveerdCM. AP werden uitgelijnd door de maximale verandering in membraan potentieel (dV / dt max). Onderste grafiek toont het verschil van membraan potentieel tussen optisch en elektrisch geactiveerdAP(E_optische-E_elektrische). (E) Elektrisch geactiveerde AP werden geremd onder aanhoudende licht van 64 s, 4 mW/mm². (F) AP worden geremd door injecties met een hogere stroom dan 1,5 keer de drempel (van 0,7 nA in stappen van 0,1 nA tot 2,2 nA) onder langdurig licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Representatieve gegevens van koolstofvezelopnames van optisch en elektrisch tempo/geremde CM. (A) Weergave in de software voor gegevensverwerving. Afbeelding (I) toont de gemeten CM met het venster voor het berekenen van sarcomerelengte. Celbreedte is in oranje gelabeld. (1) Bereik van de relevante frequenties. (2) FFT-vermogensspectrum toont de frequentie van de sarcomereafstand op de cel. De gemiddelde sarcomerelengte wordt berekend op basis van de piekfrequentie. (3) Sarcomere lengte tracking venster. (4) Intensiteitsspoor. (5) Het intensiteitsspoor vermenigvuldigd met een Hamming-venster is het spoor van de intensiteit in het raam. Schema (II) toont de elliptische doorsnede van de cel. Breedte in oranje en dikte in gestreept blauw. Afbeelding (III) toont de positie van de koolstofvezels met de respectievelijke detectiedozen, links in rood en rechts in het groen. (6) Intensiteitsspoor. (7) Eerste afgeleide van intensiteit ssporen (zie data acquisition software manual). (B) Representatief spoor van elektrisch opgewekte weeën. Paneel (I) toont de sarcomere lengte verkorting, paneel (II) de afstand tussen de twee koolstofvezels. (C) Representatief spoor van optisch opgewekte weeën (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm²). Paneel (I) toont de sarcomere lengte verkorting, paneel (II) de afstand tussen de twee koolstofvezels. (D) Gegenereerde piekkracht van contractie 1 tot 11 na een pauze veroorzaakt door remming van AP generatie. (E) Representatief spoor van optische remming van weeën onder aanhoudende verlichting (525 nm, 64 s, 6 mW/mm²). Paneel (I) toont de sarcomere lengte verkorting, paneel (II) de lengte tussen de twee koolstofvezels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

A	Gebied
Acr	anion kanaalrhodopsine
Ap	actiepotentieel
Apd	mogelijke duur van de actie
Cfu	kolonievormende eenheid
Chr	channelrhodopsine
Cm	cardiomyocyte
eGFP	verbeterde groene fluorescerende eiwitten
Esd	beëindigen van systolische celvervorming
Eu	endotoxine-eenheden
F	Kracht
Fft	snelle Fourier transformatie
GtACR (GtACR)	Guillardia theta anion channelrhodopsin
Gui	grafische gebruikersinterface
I-klem	stroomklem
Iu	internationale eenheden
Moi	veelheid van infectie
poly-HEMA	poly(2-hydroxyethyl methacrylaat)
V-klem	spanningsklem

Tabel 5: Lijst van afkortingen.

Aanvullende figuur 1: Lichtintensiteitsmetingen met optische vermogensmeter. (A) Meting van 10 ms lichtpulsen bij 4 mW/mm². b) Meting van aanhoudende verlichting van 64 s bij 4 mW/mm². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 2: Eigenschappen van vers geïsoleerde CM en hun structurele aanpassing in cultuur. (A) AP-registratie van een vers geïsoleerde CM (APD 20 van 1,11 ± 0,34 s, APD 90 van 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Gemiddelde rustmembraanpotentieel van -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Koolstofvezelregistratie van een elektrisch tempo vers geïsoleerde CM. Gemiddelde piekkracht van 205 ± 78 μN/mm² (n = 7, N = 2). c) Confocale beelden van een vers geïsoleerde CM (I); ongetransteerd (II) en transduced (III) CM na 48 uur in de cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend materiaal: MatLab script om APD en rustmembraan potentieel te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Terwijl optogenetische hulpmiddelen modulatie van prikkelbare celelektrofysiologie op een niet-invasieve manier mogelijk maken, hebben ze een grondige karakterisering in verschillende celtypen (bijvoorbeeld CM) nodig om het beste beschikbare instrument te kunnen kiezen voor een specifiek experimenteel ontwerp. De patch-clamp techniek is een standaard methode voor de beoordeling van cellulaire elektrofysiologie. In de hele cel configuratie, het maakt het mogelijk om foto-geactiveerde stromen op te nemen over het plasmamembraan of tijdelijke veranderingen in membraanspanning na lichtstimulatie / remming. Optogenetische manipulatie van elektrische excitatie beïnvloedt ook CM-contracties. We gebruiken sarcomere tracking en koolstofvezel-ondersteunde kracht metingen om de effecten van optische ondervraging op de mechanische activiteit van myocyten te kwantificeren.

We beschrijven een protocol om de basiseffecten van een lichtgatchloridekanaal, GtACR1, in CM te karakteriseren. Als modelsysteem kozen we voor konijn CM, omdat hun elektrofysiologische kenmerken (bijvoorbeeld AP-vorm en vuurvaste periode) beter lijken op die waargenomen in menselijke CM dan knaagdier CM. Bovendien kan konijn CM meerdere dagen gekweekt worden, lang genoeg voor adenovirale levering en expressie van GtACR1-eGFP. Met name geïsoleerde CM veranderen hun structurele eigenschappen in de cultuur in de tijd, met inbegrip van afronding van cel eindes en geleidelijk verlies van kruis-striatie, T-buisvormige systeem en caveolae^23,24. In overeenstemming hiermee zijn functionele veranderingen gemeld in gekweektcm: depolarisatie van het rustmembraanpotentieel, verlenging van de AP en veranderingen in cellulaire Ca²⁺ handling. Voor herziening van cellulaire aanpassingen in cultuur, zie Louch et al.²⁵. Aanvullende figuur 2 toont voorbeeldige AP en contractie metingen van vers geïsoleerde CM voor vergelijking met die waargenomen in gekweekte CM (Figuur 6, Figuur 7) met behulp van de hier gepresenteerde protocol.

Opnamen van hele celpatchklemmen maken directe metingen van fotostromende eigenschappen (bijvoorbeeld amplitudes en kinetiek) en lichtgeïnduceerde veranderingen in membraanpotentieel of AP-kenmerken bij hoge temporele resolutie mogelijk. Dergelijke opnames hebben echter verschillende beperkingen: Ten eerste wordt de cytosol vervangen door de pipetoplossing in whole-cell opnames, wat voordelig is voor de controle van ionische elektrochemische gradiënten, maar het intrinsieke nadeel heeft van het uitwassen van cellulaire organellen, eiwitten en andere verbindingen, waardoor cellulaire elektrische reacties mogelijk worden beïnvloed. Ten tweede zijn bijwerkingen zoals activering van extra ionenkanalen als gevolg van niet-fysiologisch lange depolarisatie (bijvoorbeeld langzame tijdconstanten van lichtgatige ionenkanalen) moeilijk in te schatten omdat onze methode slechts een methode toestaat om veranderingen in APD te detecteren, maar geen directe metingen van ionische concentraties in elektrofysiologisch relevante celcompartimenten uit te voeren. Dit kan worden gedaan met fluorescerende indicatoren (bijvoorbeeld Ca²⁺ sensoren) of ionenselectieve elektroden. Verdere karakterisering kan bestaan uit lichtintensiteit titraties, bepaling van pH-afhankelijkheid, fotostroom kinetiek op verschillende membraan potentials, en herstel kinetiek tijdens repetitieve lichtstimulatie.

In tegenstelling tot patch-klem opnames, single-cell kracht metingen mogelijk analyse van cellulaire samentrekkingen van intacte myocyten zonder dat hun intracellulaire milieu. Secundaire effecten op ionconcentraties (bijvoorbeeld Ca²⁺) kunnen indirect worden beoordeeld door het bepalen van gegenereerde krachtamplitude en -dynamiek (bijvoorbeeld maximale snelheid van contractie en ontspanning; hier niet geanalyseerd). Krachtmetingen met de koolstofvezeltechniek hebben een voordeel ten opzichte van vrij aanbestedende cellen, omdat ze directe informatie geven over passieve en actieve krachten in vooraf geladen cellen (d.w.z. in omstandigheden die meer lijken op de in situ of in vivo instellingen). Mechanische preloading is vooral belangrijk bij het analyseren van cellulaire contractiliteit, omdat stretch van invloed is op krachtproductie en ontspanning^26,27.

Optogenetische benaderingen zorgen voor spatiotemporally nauwkeurige manipulatie van het cellulaire membraan potentieel, zowel in enkele CM en intact hartweefsel. Klassiek, ChR2, een licht-gated kation niet-selectief kanaal, is gebruikt voor depolarisatie van het membraan potentieel, terwijl licht-aangedreven proton en / of chloride pompen werden gebruikt voor membraan hyperpolarisatie. Beide groepen van optogenetische actuatoren vereisen hoge expressieniveaus, omdat ChR2 wordt gekenmerkt door een intrinsiek lage single-channel geleiding²⁸ en lichtaangedreven pompen maximaal één ion per geabsorbeerd foton vervoeren. Bovendien kan langdurige activering van ChR2 in CM leiden tot Na⁺ en/of Ca²⁺ overbelasting, en lichtaangedreven pompen kunnen trans-sarcolemmale H⁺ of Cl veranderen^- hellingen^29,30. Op zoek naar alternatieve instrumenten voor optogenetische controle van CM-activiteit, hebben we onlangs de natuurlijke anion kanaalrhodopsin GtACR1 getest, gekenmerkt door een superieure single-channel geleiding en een hogere lichtgevoeligheid in vergelijking met kation ChR zoals ChR2. We vonden dat GtACR1 activering cm depolariseert en kan worden gebruikt voor optische pacing en remming, afhankelijk van de lichtpulstiming en duur. Een bijkomend voordeel van het gebruik van ACR in plaats van kation ChR zou de meer negatieve omkering potentieel van Cl^- in vergelijking met Na⁺, het verminderen van kunstmatig geïntroduceerde ionenstromen. Zoals we eerder hebben aangetoond, kan optische pacing met GtACR1 leiden tot AP verlenging als gevolg van de langzame component van GtACR1 kanaal sluiting, die kan worden overwonnen door het gebruik van snellere GtACR1 mutanten¹⁹. De verlenging van de AP is echter veel minder uitgesproken bij het gebruik van een lagere, meer fysiologische intracellulaire Cl^- concentratie (zie figuur 6). Bovendien resulteert gtacr1-gemedieerde remming door langdurige verlichting in een diepgaande membraandepolarisatie, die opnieuw secundaire Na⁺ en Ca²⁺ instroom kan activeren, waardoor de activiteit van voltage-gated kanalen verandert. In onze metingen zien we dat AP- en contractieparameters zich herstellen tot de basislijn binnen 40 s na een lichtgeïnduceerde remming gedurende 1 min (zie Kopton et al. 2018, figuur 6, figuur 7). Lichtgatige K⁺ kanalen bieden een krachtig alternatief voor het uitschakelen van CM zonder dat dit het CM rustmembraanpotentieel³¹aantast.

In de toekomst willen we verschillende optogenetische hulpmiddelen kwantitatief vergelijken voor hun potentieel om hartactiviteit te remmen. Hiertoe testen we een verscheidenheid aan lichtgatige ionenkanalen, waaronder ACR, ChR2 en roodverschoven ChR-varianten³², evenals hyperpolariserende actuatoren zoals halorhodopsine of het licht gated adenylyl cyclase bPAC in combinatie met het kaliumkanaal SthK (PAC-K)³¹.

Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor diepgaande karakterisering van de elektromechanische eigenschappen van CM. Het is hoofdzakelijk ook toepasselijk op CM van andere soorten, en aan CM die van ziek myocardium worden geïsoleerd. Optische stimulatie maakt het mogelijk om CM tempo op verschillende frequenties, en verschillende preloads kunnen worden getest tijdens koolstofvezel contractieexperimenten. Een interessant experiment zou zijn om verlichting met lage intensiteit te gebruiken voor subdrempeldepolarisatie, om geleidelijke toename van het rustmembraanpotentieel na te bootsen, zoals kan worden waargenomen tijdens de ontwikkeling van het remodelleren van hartweefsel tijdens de progressie van de ziekte. Ten slotte kunnen functionele metingen worden gecombineerd met Ca²⁺ beeldvorming voor verder inzicht in excitatie-contractiekoppeling, of met farmacologische interventies om de effecten van verschillende geneesmiddelen op cm-activiteit te evalueren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV	TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
Aortic cannula	Radnoti		4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0151	Borosilicate Glass
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm	Samuel Findings, London, UK	TSGBL3
Incubator	New Brunswick, Eppendorf, Schöänenbuch, Switzerland	Galaxy 170S
Langendorff-perfusion set-up	Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany		Custom-made
Langendorff-pump	Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland	ISM444
Mesh: Nylon Monodur filter cloth	Cadisch Precision Meshes Ltd		800 µm holes, 1 m wide
Neubauer chamber	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	717806
Rabbit, New Zealand White	Charles River	Strain Code: 052
Scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BC774R	Bauchdeckenschere ger. 18cm
Sterile filter, 0.22 µm	Merck, Darmstadt, Germany	SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier	AxonInstruments, Union City, CA, United States	Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0178	Borosilicate Glass
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, San José, CA, United States	1550A
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878	BZ:00
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Headstage	AxonInstruments, Union City, CA, United States	CV203BU
Interface	Scientifica, Uckfield, UK	1U Rack, 352036
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States	PT-120-G
LED control software	Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system	custom-made
Micropipette Puller	Narishige Co., Tokyo, Japan	PP-830
Microscope inverted	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
Motorised Micromanipulator	Scientifica, Uckfield, UK	PatchStar
Optical power meter	Thorlabs, Newton, NJ, United States	PM100D
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Silver wire	A-M Systems, Sequim, WA, United States	787500	Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet
Soda lime glass capillaries	Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark	160213 BRIS, ISO12772	1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, United States	Version 10.5
Software MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Stage micrometer	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Equipment - Carbon fiber
Carbon fibers	provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec		BZ:00
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States	1550B
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Fluorescence System Interface	IonOptix, Milton, MA United States	FSI-800	2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Force Transducer System	Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada	406A
Glass capillaries for force measurements	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States	GC200F-10
Interface National Instruments	National Instruments, Budapest, Hungary	BNC-2110
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States	PT-120-G
LED control box	Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system	custom-made
Microcontroller	Parallax Inc., Rocklin, California, United States	Propeller
Micropipette Puller	Narishige Co., Tokyo, Japan	PC-10
Microscope inverted	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
MyoCam-S camera	IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S camera Power	IonOptix, Milton, MA, United States	MCS-100
MyoPacer Field Stimulator	IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States	MYP100
Piezo Motor	Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	E-501.00
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Software Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, United States	Version 10.5
Software IonWizard	IonOptix, Dublin, Ireland	Version 6.6.10.125
Software MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Stage micrometer	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Chemicals
Adenosine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A9251-100G
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A7030-50G
CaCl2	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA	21114-1