In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Summary

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

Abstract

De afgifte van extracellulaire vallen (ETs) door neutrofielen is geïdentificeerd als een factor die bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten die verband houden met chronische ontstekingen. Neutrofiele ETS (netten) bestaan uit een Maas van DNA, Histon-eiwitten en diverse korrel proteïnen (d.w.z. myeloperoxidase, elastase en door G). Andere immuuncellen, waaronder macrofagen, kunnen ook ETs produceren; in hoeverre dit in vivo gebeurt en of macrofaag extracellulaire vallen (METs) een rol spelen bij pathologische mechanismen, is niet in detail onderzocht. Om de rol van METs in inflammatoire pathologieën beter te begrijpen, werd een protocol ontwikkeld voor het visualiseren van de introductie van primaire menselijke macrofagen in vitro, die ook kunnen worden misbruikt bij immunofluorescentie experimenten. Dit maakt verdere karakterisering van deze structuren en hun vergelijking met ETs vrijgegeven uit neutrofielen. Humane monocyte-afgeleide macrofagen (HMDM) produceren METs bij blootstelling aan verschillende ontstekings stimuli na differentiatie aan het M1 pro-inflammatoire fenotype. De vrijgave van de METs kan worden gevisualiseerd door microscopie met behulp van een groen fluorescerende nucleïnezuur vlek die ongevoelig is voor levende cellen (bijv. SYTOX groen). Het gebruik van vers geïsoleerde primaire macrofagen, zoals HMDM, is voordelig bij het modelleren in vivo ontstekings gebeurtenissen die relevant zijn voor potentiële klinische toepassingen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te studeren met vrijlating van humane monocyt cellijnen (bv, thp-1) na differentiatie in macrofagen met forbol myristaat acetaat of andere macrofaag cellijnen (bijv. de Murine macrofaag-achtige J774A. 1 cellen).

Introduction

De afgifte van ETs uit neutrofielen werd voor het eerst geïdentificeerd als een aangeboren immuunrespons veroorzaakt door bacteriële infectie¹. Ze bestaan uit een DNA-ruggengraat waaraan verschillende korrel eiwitten met antibacteriële eigenschappen gebonden zijn, waaronder neutrofiele elastase en myeloperoxidase². De primaire rol van neutrofiele ETs (netten) is het opvangen van pathogenen en het vergemakkelijken van hun eliminatie³. Echter, naast de beschermende rol van ETs in immuun verdediging, een toenemend aantal studies hebben ook een rol in de ziekte-pathogenese ontdekt, vooral tijdens de ontwikkeling van ontsteking-gedreven ziekten (dat wil zeggen, reumatoïde artritis en atherosclerose⁴). De afgifte van ETS kan worden geactiveerd door verschillende pro-inflammatoire cytokines, met inbegrip van Interleukine 8 (Il-8) en tumor necrose factor alpha (tnfα)^5,6, en de gelokaliseerde accumulatie van ETS kan weefselschade te verhogen en roepen een pro-inflammatoire respons⁷. Bijvoorbeeld, ETs zijn betrokken als het spelen van een causale rol in de ontwikkeling van atherosclerose⁸, bevordering van trombose⁹, en het voorspellen van cardiovasculaire risico¹⁰.

Het wordt nu erkend dat naast neutrofielen ook andere immuuncellen (d.w.z. mestcellen, eosinofielen en macrofagen) ETS kunnen vrijgeven voor blootstelling aan de microbiële of pro-inflammatoire stimulatie^11,12. Dit kan bijzonder belangrijk zijn in het geval van macrofagen, gezien hun cruciale rol in de ontwikkeling, regulering en oplossing van chronische ontstekingsziekten. Daarom is het belangrijk om een beter begrip te krijgen van de potentiële relatie tussen ET-vrijlating van macrofagen en ontsteking-gerelateerde ziekte ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van Mets en netten in intact menselijke atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi¹³. Evenzo zijn METs betrokken bij het besturen van nierschade door de regulering van ontstekingsreacties¹⁴. Echter, in tegenstelling tot neutrofielen, er zijn beperkte gegevens over de mechanismen van MET vorming van macrofagen. Recente studies met behulp van humane in vitro modellen van MET formatie vertonen enkele verschillen in de trajecten die betrokken zijn bij elk celtype (d.w.z. met betrekking tot de afwezigheid van Histon-Citrullinatie met macrofagen)⁶. Echter, sommige hebben aangetoond dat netto vrijlating kan ook optreden in de afwezigheid van Histon-Citrullinatie¹⁵.

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe methode te bieden om MET vrijgave te beoordelen in een klinisch relevant macrofaag model. Er zijn een aantal verschillende in vitro macrofaag celmodellen die zijn gebruikt om Mets te bestuderen (d.w.z. de thp-1 humane monocyt cellijn en verschillende muriene macrofaag cellijnen)¹⁶. Er zijn enkele beperkingen in verband met deze modellen. Bijvoorbeeld, de differentiatie van thp-1 monocyten aan macrofagen meestal vereist een priming stap, zoals de toevoeging van forbol myristaat acetaat (PMA), die zelf activeert proteïne kinase C (PKC)-afhankelijke trajecten. Dit proces is bekend om te activeren ET release⁴ en resulteert in een lage basale met release van thp-1 cellen. Andere studies hebben gewezen op enkele verschillen in bioactiviteit en ontstekingsreacties die in vivo door macrofagen zijn aangebracht in vergelijking met PMA-behandelde THP-1-cellen¹⁷.

Evenzo, het gedrag en inflammatoire reacties van verschillende muriene macrophage-achtige cellijnen niet volledig vertegenwoordigen de respons spectrum van primaire menselijke macrofagen¹⁸. Daarom worden met het oog op het onderzoeken van macrofaag et-vorming in de klinische setting, primaire humane monocyte-afgeleide macrofagen (hmdm's) verondersteld een relevanter model te zijn in plaats van monocytische of muriene macrofaag-achtige cellijnen.

ET vrijlating van M1 gepolariseerde HMDMs is aangetoond na blootstelling van deze cellen aan een aantal verschillende ontstekings stimuli, waaronder het myeloperoxidase-afgeleide oxidant hypochloreuze zuur (HOCl), PMA, TNFα en IL-8⁶. Hier beschreven is een protocol voor het polariseren van HMDMs op de M1 fenotype en visualiseer de daaropvolgende ONTMOETTE release bij blootstelling aan deze ontstekings stimuli. PMA wordt gebruikt als een stimulans van de release om vergelijkingen te maken met eerdere onderzoeken die neutrofielen hebben gebruikt. Belangrijker, HOCl, IL-8, en TNFα worden ook gebruikt om te stimuleren MET release, die worden verondersteld te zijn betere modellen van de ontstekings omgeving in vivo. De microscopische methode voor visualisatie van ET-release impliceert het extracellulair DNA in levende celculturen met behulp van SYTOX Green, een ondoorlatende fluorescerende groene nucleïnezuur vlek die met succes is toegepast in eerdere neutrofiele onderzoeken. Deze methode maakt een snelle en kwalitatieve beoordeling van de ET-release mogelijk, maar is niet geschikt als een stand-alone methode voor de kwantificering van ET-vrijgave omvang. Er moet een alternatieve methode worden gebruikt als kwantificering nodig is om de mate van ET-afgifte te vergelijken die voortvloeit uit verschillende behandelings condities of interventies.

Protocol

De HMDM waren geïsoleerd van menselijke Buffy vacht preparaten geleverd door de bloedbank met ethische goedkeuring van de Sydney Local Health district.

1. HMDM-cultuur

1. Isoleer de monocyten van Buffy coat preparaten bereid uit het perifere bloed van gezonde menselijke donoren met behulp van een in de handel verkrijgbare bereiding om lymfocyten te isoleren, gevolgd door tegenstroom centrifugale elutriation^{19, 20}.
2. Bevestig de aanwezigheid van monocyten door cytospinning en kleuring met gemodificeerde Giemsa vlek voor monocyt karakterisatie¹⁹.
3. Pas onder steriele omstandigheden de dichtheid van monocyten aan 1 x 10⁶ cellen/ml met behulp van rpmi-1640 media zonder serum. Voeg 1 mL van deze celsuspensie toe aan elk goed van een 12-goed-weefselkweek plaat. Cultuur in een cel incubator bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ voor 2 uur ter bevordering van de hechting op de weefselkweek plaat.
4. Verwijder onder steriele omstandigheden de celmedia en vervang deze door complete RPMI-1640 kweekmedia met 10% (v/v) gepoolde menselijke serum en 20 mM L-glutamine.
5. Kweek de cellen bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO₂ in een celincubator gedurende 8 dagen, waarbij de media elke 2 dagen worden gewijzigd.

2. polarisatie van HMDM

1. Bereid onder steriele omstandigheden de M1-priming media voor door toevoeging van interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) en lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL) aan de volledige RPMI-1640-kweekmedia. Bereid de m2 priming media door interleukine 4 (IL-4; 20 ng/mL) toe te voegen aan de complete RPMI-1640 kweekmedia.
2. Onder steriele omstandigheden, aspiraat media uit de weefselcultuur plaat putten die de hmdm bevatten, die zijn geseerd en gekweekt zoals beschreven in punt 1.
3. Was zorgvuldig de putten met de cellen 3x met steriele PBS (voorverwarmd tot 37 °C), met 1 mL aliquots van PBS.
4. Voeg 1 mL van de primingmedia M1 of m2 toe aan elk goed dat de HMDM bevat (afhankelijk van wat voor het experiment het geval is).
5. Incuberen de cellen voor 48 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ in een celincubator.

3. stimulatie van HMDM voor het opwekken van MET release

1. Bereid onder steriele omstandigheden de kweekmedia met verschillende stimulatoren van MET afgifte (afhankelijk van wat het experiment geschikt is) uit voor de volledige RPMI-1640-media: PMA (25 nM), humaan recombinant TNFα (25 ng/mL) of humane recombinant IL-8 (50 ng/mL ).
2. Voor experimenten met HOCl-stimulatie, bereid HOCl (200 μM) in HBSS (voorverwarmd tot 37 °C), onmiddellijk voor de toevoeging aan de cellen. Zorg ervoor dat de HOCl niet in volledige celmedia is voorbereid.
   Opmerking: De concentratie van de stamoplossing van HOCl wordt gekwantificeerd door meting van de UV-extinctie van de oplossing bij 292 nm en pH = 11⁶ en met een extinctiecoëfficiënt van 350 M^-1cm^-121.
3. Na de polarisatie behandeling beschreven in rubriek 2, aspireren de celmedia van elk goed en was zorgvuldig de cellen 3x met 1 mL aliquots van ofwel: steriel PBS (voor PMA, TNFα en IL-8) of HBSS (voor HOCl), die vooraf zijn opgewarmd tot 37 °C.
4. Voor experimenten met PMA, TNFα of IL-8: Voeg 1 mL van de volledige media met PMA, TNFα of IL-8 toe na het verwijderen van de PBS in de laatste wasstap.
5. Voor experimenten met TNFα, incuberen de cellen gedurende 6 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ in een celincubator. Voor experimenten met PMA en IL-8, incuberen de cellen 24 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ in een celincubator.
6. Voor experimenten met HOCl, voeg 1 mL HOCl in HBSS toe na het verwijderen van de HBSS in de laatste wasstap. Vervolgens incuberen de cellen 15 min bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ in een cel incubator.
   1. Aspiraat de cel supernatant zorgvuldig en was de cellen 3x met 1 ml aliquots van HBSS zoals beschreven in stap 3,3.
   2. Na het verwijderen van de HBSS van de laatste Wash stap, voeg 1 mL complete RPMI-1640 kweekmedia toe. Vervolgens incuberen de cellen 24 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO₂ in een cel incubator.

4. visualisatie van MET in levende celcultuur

1. Bereid SYTOX groene kleurstof in HBSS met een concentratie van 40 μM.
2. Aan het einde van de behandelingen beschreven in rubriek 3 voor het induceren van MET afgifte, voeg direct 25 μL van 40 μM van de kleurstof toe aan elke put met HMDM.
3. Inincuberen cellen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min in het donker.
4. Plaats de HMDM in weefselkweek putten op de Microscoop fase van een omgekeerde fluorescerende Microscoop voorbeeld vorming.
5. Microscoop procedures
   1. Schakel een breedspectrum fluorescerende lichtbron, brightfield-lichtbron en omgekeerde Microscoop in, geïnstalleerd met een digitale camera met hoge resolutie (Zie tabel met materialen).
   2. Draai het filter wiel naar de "nummer 2"-positie voor groene fluorescentie (excitatie = 504 nm, emissie = 523 nm) voor de beeldvorming van de groen gebeitste monsters die zich in de weefselkweek putten bevinden.
   3. Met behulp van de 5x doelstelling, focus het beeld met de grove focus, dan de fijne focus knoppen op de Microscoop, totdat het beeld lijkt scherp, helder, en gefocust wanneer bekeken door de Microscoop oculair.
   4. Zet de Microscoop in de cameramodus.
   5. Start de bijbehorende software.
   6. Selecteer het tabblad vastleggen op de software.
   7. Klik op de knop afspelen om een voorvertoning van de afbeelding te bekijken en pas de fijne focus knop op de Microscoop aan totdat het beeld scherp, helder en gefocust is in het voorbeeldvenster van de software.
   8. Klik op de knop vastleggen .
      Opmerking: De vastgelegde afbeelding wordt automatisch weergegeven in de bijbehorende software.
   9. Klik in de software op bestand | Opslaan als het vereiste afbeeldingsbestandstype.
   10. Draai op de Microscoop het filter wiel naar de positie "nummer 5" voor brightfield Imaging en herhaal stap 4.5.2 – 4.5.9 om de corresponderende brightfield-afbeelding te verkrijgen.
   11. Herhaal de stappen 4.5.2 – 4.5.10 indien nodig voor latere beeld verwerving.

Results

Brightfield-afbeeldingen met de morfologische veranderingen van HMDM in reactie op stimuli voor celdifferentiatie worden weergegeven in Figuur 1. M1 gepolariseerde macrofagen uit experimenten met HMDM blootgesteld aan IFNγ en LPS vertoonden een langwerpige en spil achtige celvorm, zoals aangegeven door de zwarte pijlen in Figuur 1 (middelste paneel). Ter vergelijking, de morfologie van de m2 gepolariseerde macrofagen na blootstelling van HMDM aan IL-4 voor 48 h ...

Discussion

De generatie en visualisatie van met vorming met M1 gedifferentieerde Hmdm's vertegenwoordigt een nieuw in vitro model dat nuttig kan zijn voor het onderzoeken van de potentiële pathologische rol van deze macrofaag structuren, met name onder chronische inflammatoire Voorwaarden. Het biedt een robuust protocol voor het stimuleren van primaire menselijke macrofagen om METs vrij te geven, die ook kunnen worden gebruikt in gerelateerde studies met humane monocyt of muriene macrofaag cellijnen. De succesvolle implementatie va...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
120Q brede spectrum fluorescerende lichtbron	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada		x-cite-serie
Corning CellBIND Meerdere Well Plate (12 putjes)	Sigma-Aldrich	CLS3336	Voor celcultuur
Differentiële Quik Stain Kit (Gemodificeerd Giemsa)	Polysciences Inc.	24606	Karakterisering van monocyten
Hanks gebalanceerde zout oplossing (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	Voor wasstappen en HOCl behandeling
Hypochloorzuur (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	Voor MET-stimulatie
Interferon gamma	Thermo-Fisher	PMC4031	Voor M1 priming
Interleukine 4	Integrated Sciences	rhil-4	Voor M2 priming
Interleukine 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	Voor MET-stimulatie
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	59202C	Toegevoegd aan cultuurmedia
Lipopolysaccharide	Integrated Sciences	tlrl-eblps	Voor M1 priming
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	Voor isolatie van monocyten
Olympus IX71 inverteer microscoop	Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	Voor MET-stimulatie
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	Voor wasstappen
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R8758	Voor celcultuur
SYTOX groen	Life Technologies	S7020	Voor MET visualisatie
TH4-200 helderveld lichtbron	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite-serie
Tumornecrose factor alfa	Lonza	300-01A-50	Voor MET-stimulatie