Methodenartikel

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 februari 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen hebben intense eisen aan hoge energie om hun functies te ondersteunen. Verminderde mitochondriale vervoer langs axonen is waargenomen in menselijke neuronen, die kunnen bijdragen aan neurodegeneratie in verschillende ziektestaten. Hoewel het een uitdaging is om mitochondriale dynamiek in levende menselijke zenuwen te onderzoeken, zijn dergelijke paradigma's van cruciaal belang voor het bestuderen van de rol van mitochondriën in neurodegeneratie. Hier beschreven is een protocol voor het analyseren van mitochondrial eologie en mitochondriale morfologie in voorhersenen neuron axonen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De iPSCs worden gedifferentieerd in telencephalische glutamateren met behulp van gevestigde methoden. Mitochondriën van de neuronen zijn bevlekt met MitoTracker CMXRos, en mitochondriale beweging binnen de axonen worden vastgelegd met behulp van een live-cell imaging microscoop uitgerust met een incubator voor celcultuur. Time-lapse beelden worden geanalyseerd met behulp van software met "MultiKymograph", "Bioformat importeur", en "Macros" plugins. Kymografen van mitochondriaal transport worden gegenereerd, en de gemiddelde mitochondriale snelheid in de anterograde en retrograde richtingen wordt gelezen uit de kymograaf. Met betrekking tot mitochondriale morfologie analyse, mitochondriale lengte, gebied, en aspect ratio worden verkregen met behulp van de ImageJ. Samengevat, dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk om studies van neurodegeneratieve ziekten te vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale beweeglijkheid en distributie spelen een cruciale rol bij het vervullen van variabele en gespecialiseerde energetische eisen in gepolariseerde neuronen. Neuronen kunnen extreem lange axonen uitbreiden om verbinding te maken met doelen door de vorming van synapsen, die hoge niveaus van energie vragen voor Ca2 + buffering en ionenstromen. Transport van mitochondriën van soma naar axon is van cruciaal belang voor de ondersteuning van axonale en synaptische functie van neuronen. Ruimtelijk en tijdelijk dynamische mitochondriale beweging wordt uitgevoerd door snel axonal transport met snelheden van enkele micrometers per seconde1.

Met name motor- of adaptoreiwitten, zoals kinesin ede en dynein, nemen deel aan het snelle organelletransport langs microtubuli om de beweging van mitochondriën2,3te controleren. Normale neuronale activiteit vereist een goed transport van nieuw geassembleerde mitochondriën van neuronaal soma tot distale axon (anterograde axonal transport) en omgekeerd transport van mitochondriën van de distale axon terug naar het cellichaam (retrograde transport). Recente studies hebben aangetoond dat onjuiste mitochondriale toewijzing sterk geassocieerd is met neuronale defecten en motorneuron degeneratieve ziekten4,5. Daarom, om de rol van mitochondriën in neurodegeneratie te ontleden, is het belangrijk om methoden vast te stellen voor het onderzoeken van mitochondriale beweging langs axonen in levende culturen.

Er zijn twee belangrijke uitdagingen bij het onderzoeken en analyseren van het volgen van mitochondriën: (1) het identificeren van mitochondriën vanaf de achtergrond in elk frame, en (2) het analyseren en genereren van de verbindingen tussen elk frame. Bij het oplossen van de eerste uitdaging wordt een fluorescentieetiketteringsbenadering op grote schaal gebruikt om mitochondriën van de achtergrond te onderscheiden, zoals MitoTracker-kleurstof of transfection van met fluorescentie gefuseerd mitochondriaal doeleiwit (bijvoorbeeld mito-GFP)6,7,8. Om de associatie tussen frames te analyseren, zijn verschillende algoritmen en softwaretools beschreven in eerdere studies9. In een recent artikel vergeleken onderzoekers vier verschillende geautomatiseerde tools (bijvoorbeeld Volocity, Imaris, wrMTrck en Difference Tracker) om mitochondriaal transport te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat ondanks verschillen in spoorlengte, mitochondriale verplaatsing, bewegingsduur en snelheid, deze geautomatiseerde instrumenten geschikt zijn voor het evalueren van het verschil in transport na behandeling10. Naast deze tools, een geïntegreerde plugin "Macro's" voor ImageJ (geschreven door Rietdorf en Seitz) is op grote schaal gebruikt voor het analyseren van mitochondriaal vervoer11. Deze methode genereert kymografen die kunnen worden gebruikt om mitochondriale beweging te analyseren, inclusief snelheid in zowel anterograde en retrograde richtingen.

Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die voortdurend veranderen in aantal en morfologie in reactie op zowel fysiologische als pathologische aandoeningen. Mitochondriale splitsing en fusie regelen de mitochondriale morfologie en homeostase strak. De onbalans tussen mitochondriale splitsing en fusie kan leiden tot extreem korte of lange mitochondriale netwerken, die de mitochondriale functie kunnen schaden en kunnen resulteren in abnormale neuronale activiteiten en neurodegeneratie. Verminderde mitochondriale transport en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, en erfelijke spastische dwarslaesie (HSP)12,13,14,15. HSP is een heterogene groep van erfelijke neurologische aandoeningen gekenmerkt door de degeneratie van het corticospinale kanaal en het daaropvolgende falen om de onderste ledematen spieren te controleren16,17. In deze studie worden iPSC-afgeleide voorhersenenneuronen gebruikt om mitochondriaal transport en morfologie in HSP te beoordelen. Deze methode biedt een uniek paradigma voor het onderzoeken van mitochondriale dynamiek van neuronale axonen in levende culturen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van telencephalische glutamateren van iPSC's

OPMERKING: Het gedetailleerde protocol voor het handhaven van iPSCs en hun differentiatie in telencephalische glutamatergic neuronen zijn vergelijkbaar met die eerder beschreven18. Hier wordt het kritieke proces tijdens de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen geïntroduceerd en benadrukt.

  1. KweekiPSCs op muis embryonale fibroblast (MEF) feeders in menselijke embryonale stamcel (hESC) medium aangevuld met fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Na incubatie met dispase (1 mg/mL) gedurende 3 min, scheiden de iPSCs in kleine klonten. Dan, cultuur van de iPSC aggregaten in schorsing in het hESC medium voor 4 dagen. Raadpleeg dit tijdsbestek, wanneer de iPSCs beginnen als de schorsingscultuur, als dag 1 (D1). Verander het medium dagelijks gedurende 4 dagen.
  3. Verzamel bij D5 de iPSC aggregaten na centrifugeren op 200 x g voor 2 min en cultuur in neurale inductiemedia (NIM) gedurende 3 dagen. Cultuur de cel aggregaten in schorsing voor 3 dagen door het veranderen van de helft van de media om de 2 dagen. Voeg DMH-1 (2 μM) en SB431542 (2 μM) toe aan HET NIM-medium om de neurale inductie-efficiëntie te verhogen.
  4. Bij D8, verzamel de iPSC aggregaten na centrifugeren op 200 x g voor 2 min en laat ze zich hechten aan 6 putplaten (ongeveer 20-30 aggregaten per put van de plaat) door 's nachts in NIM te kweken met 10% FBS (of met laminingecoate platen). Op de volgende dag, verwijder het oude medium en veranderen naar NIM om de 2 dagen tot D17.
    OPMERKING: De generatie van neuroepitheelcellen, die wordt aangegeven door de vorming van zuilcellen met rozetstructuren, wordt in deze periode waargenomen.
  5. Bij D17, mechanisch isoleren van de neuroepitheelcellen in het centrum van kolonies (het opheffen van direct door het toepassen van een kleine druk op het centrum van de kolonies) of enzymatisch (behandeld met dispase). Breng de geïsoleerde neuroepitheelcellen over naar niet-behandelde weefselkweek T25-kolf met 8 mL NIM met toevoeging van B27 (1x), cAMP (1 μM) en IGF (10 ng/mL).
    OPMERKING: De suspensiecultuur laat cellen toe om neurosferen te vormen die met corticale projectie neurale voorlopers worden verrijkt.
  6. Na D35, plaat de neurosferen op de poly-ornithine en LDEV-vrije verminderde groeifactor kelder membraan matrix(Table of Materials)-gecoate 35 mm glazen bodem schotels om telencephalic glutamatergic neuronen (corticale projectie neuronen) te genereren. Voor het platen, scheiden van de neurosferen naar kleine clusters door te broeden met 1 mg/mL cel loslating oplossing voor 2 min bij 37 °C.
  7. Verwijder de celloslatingsoplossing door centrifugeren en opnieuw opschorten in 1 mL van neuraal differentiatiemedium (NDM). Plaatcellen op de glazen bodemschaal (ongeveer vijf clusters in 100 μL medium per schotel) om ze te laten hechten. Voeg vervolgens NDM (1 mL per schotel) toe en kweek de cellen in NDM met B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) en GDNF (10 ng/mL).
    OPMERKING: Kleine clusters zijn verguld omdat ze goed overleven en aanleiding geven tot lange projectieneuronen. Als alternatief kunnen cellen worden gescheiden en verguld met een dichtheid rond de 20.000 cellen per schotel voor een betere scheiding.
  8. Karaktereer de telencephalische glutamateren door immunostaining de Tbr1 en βIII-tubulin markers.

2. Onderzoek van mitochondriaal transport langs axonen van telencephalische glutamaterende neuronen

  1. Warm de NDM op en zet de couveuse aan voor de fluorescentiemicroscoop op 37 °C en 5% CO2.
  2. Om mitochondriën langs de axonen van voorhersenenneuronen te visualiseren, incubeer de neuronen met 50 nM rode fluorescerende kleurstof om mitochondriën in levende cellen (b.v., MitoTracker CMXRos) in NDM voor 3 min bij 37 °C te bevlekken. Was vervolgens cellen 2x met opgewarmdndm. De neuronen zijn geïncubeerd in NDM.
  3. Om het mitochondriale transport langs de axonen vast te leggen, neem time-lapse beelden van mitochondriale beweging met behulp van de 40x doelstelling met een fluorescentiemicroscoop.
    OPMERKING: Om de cultuur te stabiliseren, voert u de live celbeeldvorming uit wanneer de cellen gedurende 20 min na mitochondriale vlekken in de couveuse worden geïncubeerd.
  4. Identificeer onder faseveld de axonen op basis van morfologische kenmerken (kom direct voort uit neuronale cellichaam, constante dunne lange neurites zonder vertakking). Mitochondriën bewegen in anterograde (van cellichaam naar distale axon) en retrograde richtingen (van axonalterminal naar cellichaam). Om de richting van mitochondriale beweging langs axonen te onderscheiden, duidelijk identificeren van de cellichamen van neuronen. In deze stap, focus axonen in fase veld om fotobleken te verminderen.
  5. Na het onderscheiden van het cellichaam en de axon, pas u de belichtingstijd en focus van mitochondriën in axonen aan. Leg vervolgens het transport van mitochondriën in axonen om de 5 s vast gedurende een totale duur van 5 minuten, wat 60 frames oplevert. Plaats willekeurig ten minste vijf locaties voor elk gerecht vast en herhaal 3x voor elke groep.

3. Data-analyse van mitochondriaal transport en morfologie in corticale neuronen

OPMERKING: Analyseer de verzamelde gegevens over mitochondriaal transport met behulp van een beeldanalysesoftware (bijvoorbeeld ImageJ of MetaMorph19). Aangezien ImageJ direct beschikbaar is, voert u de analyse uit van mitochondriaal transport en morfologie met ImageJ met de MultiKymograph, Macro'sen analyseerdeeltjesplug-ins.

  1. Mitochondrial transport analyseren met ImageJ
    1. Na het vastleggen van de time-lapse beelden van mitochondriale beweeglijkheid, analyseer de snelheid en beweging van mitochondriën met behulp van de MultiKymograph plugin. De afbeeldingen worden opgeslagen als .tiff-indelingsbestanden, die worden geanalyseerd door Fiji-software volgens een eerder gerapporteerde methode20.
    2. Download de Fiji-software. Download plugins die nodig zijn voor het analyseren van mitochondriale bewegende snelheid van kymografen. Download de Bio-formats Package en Kymograph Plugin samen met deze vier .class plugins, waaronder: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class en WalkingAverage.class (Tabel met materialen). Verplaats deze bestanden naar de map Fiji-plug-ins. Download "tsp050706.txt" plugins naar de plugins map. Start de Fiji-software opnieuw wanneer de bestanden naar de map plug-ins worden verplaatst.
    3. Open Fiji software. Kies plug-ins,importeer vervolgens afbeeldingen van de .tiff-serie via Bio-Formats Importer onder Bio-Formats. Zorg ervoor dat u Standard ImageJ kiest in Stack-weergave,kies Alle reeksen openen,schakel Autoschaal inen klik op OK. Let op het framenummer en de grootte van afbeeldingen in pixels, die boven aan de afbeelding worden weergegeven.
      OPMERKING: Neem 60 frames per afbeelding.
    4. Overweeg om de afbeeldingen duidelijker te maken door de helderheid/contrast onder het menu Afbeelding aan te passen voor alle 60 frames.
    5. Klik met de rechtermuisknop op het lijngereedschap om gesegmenteerde lijn te kiezen en een gesegmenteerde lijn te tekenen vanaf de celbehuizing en eindigend bij de terminalaxon. Genereer de kymograaf door multiplekymograph te kiezen onder plugins. De selectie van de lijnbreedte wordt gevraagd na het kiezen van de MultipleKymograph. Zorg ervoor dat dit een oneven getal is. Kies 1 voor de lijnbreedte. Na deze stap wordt een kymograaf gegenereerd.
      OPMERKING: Verschillende belangrijke stukjes informatie kunnen worden gelezen uit de kymograph. De y-as van kymograaf is de duur (5 min) voor de 60 frames. De x-as vertegenwoordigt de positie van de geselecteerde axonen.
    6. Gebruik een diagonale lijn in de kymograaf om de bewegingsrichting van mitochondriën te bepalen (anterograde, retrograde of stabiel). Een lijn die naar rechts gaat langs de y-as geeft bijvoorbeeld anterogradebeweging aan en een lijn die naar links langs de y-as gaat, duidt op retrograde beweging. Een verticale lijn geeft aan dat er geen beweging was in de mitochondrion.
    7. Meet de afstand, tijdwaarden en snelheid voor de bewegende mitochondriën met behulp van de Macros plugin in Fiji-software. Ga naar Plugins | Macro's | Installatie | tsp050607.txt. Teken een gesegmenteerde lijn over het spoor van mitochondriale beweging op de kymograaf, en trek altijd de lijn van de superieure naar inferieure regio (y-as).
    8. Na het tekenen van de lijn, ga naar Plugins | Macro's | lees snelheden van tsp. Aangezien een gesegmenteerde lijn langs het spoor wordt getrokken, leest de plugin gesegmenteerde snelheden die overeenkomen met de lijn.
      OPMERKING: Het apparaat voor alle gegevens is pixels. dy som is de tijd die vanaf het beginpunt wordt verbruikt, en dx som geeft de afstand aan van de mitochondrion die zich in de x-as beweegt. dy now en dx toont nu de periode tijd en beweging afstand voor elk segment, respectievelijk. werkelijke snelheid toont de snelheid voor elk segment (dx nu / dy nu). gemiddelde snelheid geeft de gemiddelde snelheid voor de mitochondriale bewegende (dx som / dy som).
    9. Verander de eenheid van dx nu van pixel naar μm als de verhouding van pixel in μm door de schaalbalk te meten. Converteer het apparaat voor afstand van pixel naar μm door schaalbalken in afbeeldingen te meten. Gebruik het lijngereedschap om een lijn langs de schaalbalk te tekenen en de lengte van de lijn te meten door Meten te kiezen onder 'Analyseren. Wijzig de tijd van pixel in seconden, als 1 pixel = 5 seconden in dit experiment.
    10. Bereken in het spreadsheetbestand de gemiddelde snelheid en label dienovereenkomstig retrograde of anterogradebeweging. Gemiddelde van de anterograde of retrograde beweging snelheid.
    11. Bepaal het percentage stationaire en motile mitochondriën uit de kymograaf. De anterograde of retrograde bewegende mitochondriën worden gedefinieerd als het bewegen van 5 μm vooruit of achteruit van de oorsprong gedurende de gehele periode21. Mitochondriën worden als stationair beschouwd als ze niet meer dan 5 μm hebben verplaatst tijdens de 5 min.
  2. Analyse van mitochondriale morfologie met ImageJ
    OPMERKING: Bepaal mitochondriale morfologie door mitochondriale lengte, gebied en beeldverhouding te meten met ImageJ. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
    1. Om de mitochondriale lengte en het gebied binnen axonen te analyseren, download t.v. de Straighten_.jar plugin van imagej website (zie Tabel met materialen)en verplaats deze naar de map met plug-ins. Start ImageJ-software opnieuw.
    2. Open de afbeelding via de open functie onder Bestand en converteer de afbeelding met 32 bits naar 8-bits met Tekst onder Afbeelding.
    3. Teken een gesegmenteerde lijn langs de axonen. Kies Straighten onder Plug-ins en stel 50 pixels in voor Breedte van Filament/Wide Line. Dit zal een rechtgetrokken axon genereren.
    4. De drempelwaarde onder Afbeelding aanpassen en de meting instellen onder Analyseren door "Gebied | Omtrek | Fit ellips | Vormbeschrijvingen.
    5. Meet de schaalbalk met behulp van de lijnfunctie en stel de schaal in onder Analyseren door de afstand in pixel, de lengte van de lengtete vullen . Kies vervolgens Globaal om deze schaalinstelling in te stellen.
    6. Gebruik Deeltjes analyseren onder Analyseren om het gebied te bepalen. De promptparameters zijn grootte (pixel^2) = 0,20-oneindigheid, circulariteit = 0,00–1,00 en tonen = ellipsen. Kies Weergaveresultaten.
      OPMERKING: De meting levert de resultaten op van meerdere mitochondriale morfologieparameters, waaronder gebied, omtrek, lengte (groot), breedte (minor) en beeldverhouding (AR). Het overeenkomstige mitochondriale getal wordt ook vermeld.
    7. Bereken het mitochondriale getal per axon (μm) met behulp van het mitochondriale getal gedeeld door axonale lengte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden menselijke iPSC's gedifferentieerd in telencephalische glutamaterende neuronen, die werden gekenmerkt door immunostaining met Tbr1 en βIII tubulin markers(figuur 1A). Om het axonal transport van mitochondriën te onderzoeken, werden deze cellen bevlekt met rode fluorescerende kleurstof, en time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd. Aangezien ImageJ is direct beschikbaar en gemakkelijker te verkrijgen, mitochondriaal vervoer werd verder geanalyseerd met de "MultiKymo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode om mitochondrial eerherstel en morfologie in neuronale axonen te analyseren met behulp van rode fluorescerende kleurstof en ImageJ-software, die beide een uniek platform bieden om axonale degeneratie en mitochondriale morfologie bij neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder vlekken van mitochondriën, live celbeeldvorming en het analyseren van de beelden. In deze methode werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om mitoch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Spastic Paraplegia Foundation, de Blazer Foundation en de NIH (R21NS109837).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell TechnologiesAT104
Biosafety hoodThermo Scientific1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R/ 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9'' glass pipetesVWR14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
Insulin growth factor 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free SupplementGemini400-163
Olympus microscope IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Phase contrast microscopeOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 well platesCorning353046
24 well platesCorning353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
  12. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  13. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  14. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  15. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  16. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  17. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  18. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).
  19. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  20. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  21. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  22. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  23. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  24. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  25. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  26. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  27. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  28. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  29. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  30. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  31. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  32. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  33. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  34. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  35. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1(2016).
  36. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  37. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
  38. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  39. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le morfologiehumane iPSC neuronenlive cell imagingkymograafanalyseMitoTracker kleuringanterograde en retrograde bewegingImageJ analysemodellen voor neurodegeneratieve ziektenaxonaal transport

Gerelateerde artikelen