Methodenartikel

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 februari 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen hebben intense eisen aan hoge energie om hun functies te ondersteunen. Verminderde mitochondriale vervoer langs axonen is waargenomen in menselijke neuronen, die kunnen bijdragen aan neurodegeneratie in verschillende ziektestaten. Hoewel het een uitdaging is om mitochondriale dynamiek in levende menselijke zenuwen te onderzoeken, zijn dergelijke paradigma's van cruciaal belang voor het bestuderen van de rol van mitochondriën in neurodegeneratie. Hier beschreven is een protocol voor het analyseren van mitochondrial eologie en mitochondriale morfologie in voorhersenen neuron axonen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De iPSCs worden gedifferentieerd in telencephalische glutamateren met behulp van gevestigde methoden. Mitochondriën van de neuronen zijn bevlekt met MitoTracker CMXRos, en mitochondriale beweging binnen de axonen worden vastgelegd met behulp van een live-cell imaging microscoop uitgerust met een incubator voor celcultuur. Time-lapse beelden worden geanalyseerd met behulp van software met "MultiKymograph", "Bioformat importeur", en "Macros" plugins. Kymografen van mitochondriaal transport worden gegenereerd, en de gemiddelde mitochondriale snelheid in de anterograde en retrograde richtingen wordt gelezen uit de kymograaf. Met betrekking tot mitochondriale morfologie analyse, mitochondriale lengte, gebied, en aspect ratio worden verkregen met behulp van de ImageJ. Samengevat, dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk om studies van neurodegeneratieve ziekten te vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale beweeglijkheid en distributie spelen een cruciale rol bij het vervullen van variabele en gespecialiseerde energetische eisen in gepolariseerde neuronen. Neuronen kunnen extreem lange axonen uitbreiden om verbinding te maken met doelen door de vorming van synapsen, die hoge niveaus van energie vragen voor Ca2 + buffering en ionenstromen. Transport van mitochondriën van soma naar axon is van cruciaal belang voor de ondersteuning van axonale en synaptische functie van neuronen. Ruimtelijk en tijdelijk dynamische mitochondriale beweging wordt uitgevoerd door snel axonal transport met snelheden van enkele micrometers per seconde1....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van telencephalische glutamateren van iPSC's

OPMERKING: Het gedetailleerde protocol voor het handhaven van iPSCs en hun differentiatie in telencephalische glutamatergic neuronen zijn vergelijkbaar met die eerder beschreven18. Hier wordt het kritieke proces tijdens de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen geïntroduceerd en benadrukt.

  1. KweekiPSCs op muis embryonale fibroblast (MEF) feeders in menselijke embryonale stamcel (hESC) medium aangevuld met fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Na incubatie met dispase (1 mg/mL) gedurende 3 min, scheiden de iPSCs in kleine klon....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden menselijke iPSC's gedifferentieerd in telencephalische glutamaterende neuronen, die werden gekenmerkt door immunostaining met Tbr1 en βIII tubulin markers(figuur 1A). Om het axonal transport van mitochondriën te onderzoeken, werden deze cellen bevlekt met rode fluorescerende kleurstof, en time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd. Aangezien ImageJ is direct beschikbaar en gemakkelijker te verkrijgen, mitochondriaal vervoer werd verder geanalyseerd met de "MultiKymo.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode om mitochondrial eerherstel en morfologie in neuronale axonen te analyseren met behulp van rode fluorescerende kleurstof en ImageJ-software, die beide een uniek platform bieden om axonale degeneratie en mitochondriale morfologie bij neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder vlekken van mitochondriën, live celbeeldvorming en het analyseren van de beelden. In deze methode werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om mitoch.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Spastic Paraplegia Foundation, de Blazer Foundation en de NIH (R21NS109837).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell TechnologiesAT104
Biosafety hoodThermo Scientific1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R/ 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9'' glass pipetesVWR14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
Insulin growth factor 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free SupplementGemini400-163
Olympus microscope IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Phase contrast microscopeOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 well platesCorning353046
24 well platesCorning353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along micro....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le morfologiehumane iPSC neuronenlive cell imagingkymograafanalyseMitoTracker kleuringanterograde en retrograde bewegingImageJ analysemodellen voor neurodegeneratieve ziektenaxonaal transport

Gerelateerde artikelen