Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60572

⸱

23 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een robuust, overdraagbaar en voorspellend in vitro blootstellingssysteem voor de screening en monitoring van deeltjes in de lucht met betrekking tot hun acute longcytotoxiciteit door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de lucht-vloeibare interface (ALI).

Samenvatting

Hier presenteren we een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de homogene blootstelling van gecultiveerde menselijke longcellen in de ALI aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (bijv. sigarettenrook) mogelijk maakt, waardoor realistische fysiologische blootstelling van het apicale oppervlak van het menselijk alveolargebied aan lucht. In tegenstelling tot sequentiële blootstellingsmodellen met lineaire aerosolgeleiding voldoet het modulaire ontwerp van het radiale stroomsysteem aan alle eisen voor de continue opwekking en het transport van de testatmosfeer naar de cellen, een homogene verdeling en afzetting van de deeltjes en de continue verwijdering van de atmosfeer. Deze blootstellingsmethode is voornamelijk ontworpen voor de blootstelling van cellen aan deeltjes in de lucht, maar kan worden aangepast aan de blootstelling van vloeibare aerosolen en zeer giftige en agressieve gassen, afhankelijk van de methode voor het genereren van aerosolen en het materiaal van de blootstellingsmodules .

In het kader van een recent afgerond validatieonderzoek werd dit blootstellingssysteem bewezen als een overdraagbare, reproduceerbare en voorspellende screeningsmethode voor de kwalitatieve beoordeling van de acute longcytotoxiciteit van deeltjes in de lucht, mogelijk dierproeven verminderen of vervangen die normaal gesproken deze toxicologische beoordeling zouden opleveren.

Inleiding

Het inademen van giftige deeltjes in de lucht is een zorg voor de volksgezondheid, wat leidt tot een veelheid aan gezondheidsrisico's wereldwijd en vele miljoenen sterfgevallen per jaar1,2. De klimaatverandering, de aanhoudende industriële ontwikkeling en de stijgende vraag naar energie-, landbouw- en consumentenproducten hebben de afgelopen jaren bijgedragen tot de toename van longziekten3,4,5,6. Kennis en evaluatie van inhaleerbare stoffen met betrekking tot hun acute inhalatietoxiciteit vormen de basis voor risicobeoordeling en risicobeheer, maar deze informatie ontbreekt nog steeds voor een breed scala van deze stoffen7,8. Sinds 2006 vereist de EU-chemische wetgeving REACH (Registratie, Evaluatie, Autorisatie en Beperking van chemische stoffen) dat reeds bestaande en nieuw geïntroduceerde producten een toxicologische karakterisering ondergaan, inclusief de inademingsroute voordat ze in de handel worden gebracht. Daarom richt REACH zich op alternatieve en diervrije methoden, de toepassing van het "3R"-principe (vervanging, verfijning en vermindering van dierproeven) en het gebruik van geschikte in vitro modellen9. In de afgelopen jaren zijn veel verschillende en adequate niet-dierlijke inhalatietoxiciteitstestmodellen ontwikkeld (bijvoorbeeld in vitro celculturen, long-op-a-chipmodellen, precisiegesneden longschijfjes(PCLS)) om de acute inhalatietoxiciteit van deeltjes in de lucht 5,7,10,11te beoordelen. In termen van in vitro celkweekmodellen kunnen gekweekte cellen onder ondergedompelde omstandigheden of aan de ALI (figuur 1) worden blootgesteld. De validiteit van onderzoeken naar blootstelling onder water is echter beperkt met betrekking tot de beoordeling van de toxiciteit van verbindingen in de lucht, met name deeltjes. Blootstellingstechnieken onder water komen niet overeen met de situatie van mens in vivo; het celkweekmedium dat de cellen bedekt, kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de toxische eigenschappen van een teststof12,13beïnvloeden. ALI in vitro inademingsmodellen maken de directe blootstelling van cellen aan de teststoffen zonder interferentie van het celkweekmedium met testdeeltjes mogelijk, waardoor menselijke blootstelling met een hogere fysiologische en biologische gelijkenis wordt nagebootst dan ondergedompelde blootstellingen12,14.

Voor regelgevingsprocessen zoals REACH zijn echter alleen diermodellen beschikbaar op het gebied van acute inhalatietoxicologie, aangezien geen enkele alternatieve in vitro methoden voldoende zijn gevalideerd en tot nu toe officieel zijn aanvaard14. Daartoe moeten testmodellen worden gevalideerd volgens de eisen van het referentielaboratorium van de Europese Unie voor alternatieven voor dierproeven (EURL-ECVAM) beginselen inzake testvalide15.

Een voormalige pre-validatie studie en een onlangs afgeronde validatie studie met succes aangetoond dat de toepassing gebied van de CULTEX RFS blootstelling systeem en de overdraagbaarheid, stabiliteit, en reproduceerbaarheid13. Dit blootstellingssysteem is een in vitro celgebaseerd blootstellingssysteem dat homogene blootstelling van cellen aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (b.v., sigaretrook) bij ALI toe te schrijven aan zijn radiaal aërosoldistributieconcept en de geleiding van de testaerosol in een ononderbroken stroom over de cellen16mogelijk maakt. De basismodule van dit radiale stroomsysteem bestaat uit de inlaatadapter, de spuitbusgeleidingsmodule met een radiale aerosolverdeling, de bemonsterings- en socketmodule en een vergrendelingsmodule met een handwiel (figuur 2). De gegenereerde deeltjes bereiken de cellen via de inlaatadapter en de aerosolgeleidingsmodule en worden afgezet op de wisselplaten van de celkweek, die zich bevinden in de drie radiaal gerangschikte blootstellingskamers van de bemonsteringsmodule. De spuitbusgeleidingsmodule en de bemonsteringsmodule kunnen worden verwarmd door verbinding te maken met een extern waterbad17.

In het kader van beide studies werden A549-cellen gebruikt voor alle blootstellingsexperimenten. De cellijn A549 is een menselijke vereeuwigde epitheliale cellijn die zeer goed wordt gekenmerkt en is gebruikt als een in vitro model voor type II alveolar epitheelcellen in tal van toxicologische studies. De cellen worden gekenmerkt door lamellenlichamen, de productie van oppervlakteactieve stof en een aantal ontstekingsrelevante factoren18. Ze tonen ook eigenschappen van bronchiale epitheelcellen als gevolg van hun slijmproductie19. Bovendien kunnen ze worden gekweekt op de ALI. Hoewel deze cellijn tekort is aan het bouwen van celcelcontacten, is de teelt van deze cellen veel handiger, goedkoper en zijn de daaruit verkregen resultaten donoronafhankelijk in vergelijking met primaire cellen20.

A549 cellen werden gezaaid in 6-put cel kweek inserts (PET membraan, 4,67 cm2, porie grootte 0,4 mm) met een dichtheid van 3,0 x 105 cellen per insert en gekweekt voor 24 uur onder ondergedompelde omstandigheden. Cellen werden vervolgens blootgesteld in drie onafhankelijke laboratoria aan schone lucht en drie verschillende blootstellingsdoses (25, 50 en 100 μg/cm2)van 20 teststoffen in de ALI. De blootstellingsdosis is gecorreleerd aan de afzettingstijd die resulteert in een constante deeltjessnelheid van 25 μg/cm2, 50 μg/cm2 en 100 μg/cm2 op de cellen na respectievelijk 15, 30 of 60 min. De gedeponeerde deeltjes werden echter niet afgewassen na afzetting, maar bleven 24 uur op de cellen. De depositietijden van de deeltjes waren daarom 15, 30 en 60 min, maar de blootstelling van de cellen duurde in totaal 24 uur. De depositiesnelheid van de teststoffen werd bepaald in voorlopige experimenten volgens eerdere methoden17.

De levensvatbaarheid van cellen als indicator van toxiciteit werd 24 uur na deeltjesdepositie beoordeeld met behulp van een cellevensvatbaarheidstest. Bijzondere aandacht werd besteed aan de kwaliteit van schone luchtcontroles, de optimalisatie en verfijning van het blootstellingsprotocol, de reproduceerbaarheid binnen- en interlaboratorium en de invoering van een voorspellingsmodel (PM). Stoffen die hebben geleid tot een afname van de levensvatbaarheid van cellen onder de 50% (PM 50%) of 75% (PM 75%) bij een van de drie blootstellingsdoses werden beschouwd als een acuut inademingsgevaar. De resultaten werden vervolgens vergeleken met bestaande in vivo gegevens (op basis van ten minste één betrouwbare studie volgens de OESO-testrichtlijn (TG) 403 of TG 43621,22), wat leidde tot een algemene overeenstemming van 85%, met een specificiteit van 83% en een gevoeligheid van 88%23.

Naast de meting van de levensvatbaarheid van de cel kunnen andere eindpunten zoals cytokinerelease, onderzoek van het cellysaat of membraanintegriteit via LDH-test worden beoordeeld, maar waren niet vereist voor het validatieonderzoek. Zo werd het blootstellingssysteem (bijvoorbeeld CULTEX RFS) bewezen als een voorspellend screeningsysteem voor de kwalitatieve beoordeling van de acute inhalatietoxiciteit van de geteste deeltjes in de lucht, wat een veelbelovende alternatieve methode voor dierproeven vertegenwoordigt. Het volgende protocol wordt aanbevolen voor blootstellingsexperimenten aan deeltjes in de lucht die dit blootstellingssysteem gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het protocol van één blootstellingsexperiment bestrijkt een periode van drie dagen.

Dag 1

1. Algemene preparaten en teelt van cellen

OPMERKING: De menselijke long adenocarcinome epitheliale cellijn A549 werd gebruikt voor blootstelling experimenten. Cellen moeten onder steriele omstandigheden worden behandeld. Andere cellijnen die geschikt zijn voor teelt bij de ALI kunnen worden gebruikt.

  1. Bereid het groeimedium (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 5 μg/mL gentamycine) en het blootstellingsmedium (DMEM, aangevuld met 5 μg/mL gentamycine en een uiteindelijke HEPES-concentratie van 100 mM).
  2. Cultuur A549 cellen in groeimedium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
  3. Kweek cellen in celkweekkolf van 75 cm2 (T-75) in 14 mL groeimedium tot een samenvloeiing van 80-90% voor splitsing (elke 2-3 dagen) en een passage van 35.
  4. Bereken het veervolume en het vereiste aantal celkweekinserts (drie celkweekinserts als incubatorbesturing en celkweekinserts voor blootstelling aan schone lucht en deeltjes) en celkweekplaten.
  5. Voordat trypsinisatie en zaaien van cellen, voeg 2,5 mL getemperdgroei medium aan elke put van een 6-goed plaat. Plaats de celcultuur inserts zonder cellen zorgvuldig in de putten en voeg 1 mL groeimedium toe aan elke celkweek insert. Bebroed de 6-putten gedurende ten minste 30 min in de couveuse (37 °C, 5% CO2).

2. Trypsinisatie van cellen

  1. Temper fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en groeimedium bij 37 °C en de trypsine/EDTA (0,05%/ 0.02%) oplossing bij kamertemperatuur.
  2. Zuig het celkweekmedium uit de celkweekkolf en was de cellen voorzichtig met 8 mL voorverwarmde PBS.
  3. Verwijder de PBS, voeg 2 mL van de trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) oplossing voor de cellen en incuberen voor maximaal 6 min. in de couveuse bij 37 °C. Controleer het loslatingsproces onder de microscoop.
  4. Neutraliseer de trypsineactiviteit door 8 mL voorverwarmde groeimedium toe te voegen, de cellen los te koppelen door zachtjes op de kolf te tikken en de cellen opnieuw op te schorten door herhaaldelijk op en neer te stampen.
  5. Breng de celvering over op een buis van 50 mL. Bepaal het celnummer voor verdere procedure (bijvoorbeeld het zaaien van cellen, passage van cellen).

3. Bepaling van het celnummer

OPMERKING: Celconcentratie werd bepaald met behulp van een celteller of telkamers.

  1. Verdun 100 μL van de celkweekvering in een beker gevuld met 10 mL isotone oplossing. Kantel de beker langzaam zonder te schudden.
  2. Bepaal het aantal levensvatbare cellen/mL en cellevensvatbaarheid op basis van de celspecifieke meetparameters van A549-cellen.

4. Zaaien van cellen op microporeuze membranen in celkweekinserts

OPMERKING: Het belichtingssysteem is uitgerust met speciale adapters om het gebruik van commerciële wisselplaten van verschillende leveranciers en van verschillende grootte mogelijk te maken. Voor deze blootstellingsexperimenten werden 6-goedplaten en de overeenkomstige celcultuurtussenvoegsels gebruikt. Alle werkstappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.

  1. Zorg voor een voorverwarmde groeimedium onder steriele celkweekomstandigheden (laminaire stroom).
  2. Bereid een voldoende hoog volume van de celsuspensie voor met een celconcentratie van 3,0 x 105 cellen/mL.
  3. Na het temperen van de platen gedurende 30 min, aanzuigen van het medium in de celcultuur inserts en zaad 1 mL van A549 cellen met een dichtheid van 3,0 x 105 cellen /mL in elke celcultuur insert. Verdeel de celvering door zacht te schommelen.
  4. Incubeer de celkweek inserts met de celvering voor 24 uur (37 °C en 5% CO2).

5. Persen van teststoffen

OPMERKING: Teststoffen werden geperst in poedercakes met behulp van een volledig controleerbare hydraulische pers. Het perspakket kan een maximale kracht van 18 kN toepassen, die wordt weergegeven als de huidige oliedruk (in bar) van het perspakket. Persomstandigheden (drukdruk, perstijd) van onbekende teststoffen moeten worden vastgesteld en gekarakteriseerd in voorbereidende tests. Afhankelijk van de perseigenschappen van een stof kunnen verschillende persparameters en soorten perszuigerworden gebruikt.

LET OP: Draag beschermende apparatuur bij het drukken van giftige of gevaarlijke stoffen.

  1. Stel de perstijd in via de tijdsregeling aan de voorzijde van de pers.
  2. Open de persluchttoevoer bij de persluchtklep. Stel de persluchtdruk in op ongeveer 2 bar (aangegeven door een drukmeter aan de voorzijde) met behulp van de drukregelaar aan de voorzijde van de pers of op de persluchtklep van de persluchttoevoer. Trek de lade eruit, druk op de drukknop en lees de druk op de digitale drukschakelaar.
    1. Lees alleen de druk bij de drukregelaar als de druk te hoog of te laag is.
  3. Stel de stofcontainer samen en zorg ervoor dat de glazen cilinder correct gecentreerd is (Aanvullende figuur 1). Vul de stofcontainer met een kleine hoeveelheid van de teststof. Steek de zuiger in de stofcontainer en draai deze iets heen en weer om het poeder gelijkmatig in de container te verdelen.
  4. Plaats de stofcontainer met de zuiger in de lade en druk op de drukknop. De hydraulische zuiger van de pers beweegt zich op de zuiger en oefent een druk uit op de teststof voor de ingestelde perstijd. Open de lade en verwijder de zuiger.
  5. Herhaal stap 5.3 en 5.4 totdat de stofcontainer ten minste halfvol is.
  6. Verwijder na voltooiing van het perswerk de stofcontainer uit de lade en zet deze ondersteboven om losse en afgezette deeltjes te verwijderen.
  7. Als de stofhouder niet op dezelfde dag nodig is, sluit u de stofcontainer met parafilm om te voorkomen dat de teststof uitdroogt of vocht absorbeert.

Dag 2

6. Montage van het blootstellingssysteem en aansluiting van de perifere apparatuur

OPMERKING: In figuur 3, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3wordt een meer gedetailleerde weergave gegeven . Monteer beide modules en de spuitbusgenerator volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Plaats het belichtingssysteem op een solide en gelijkmatig oppervlak, waarbij de watertoevoer naar voren gericht is. Sluit de massastroomcontrollers aan met de aerosolgenerator en een fles met drie hals die is aangesloten op de module voor blootstelling aan schone lucht.
  2. Sluit de flow controller en de vacuümpomp aan. Sluit de buizen van de flowcontrollers aan met de buisconnector op de bevestigingen van de aerosolgeleidingsmodule. Sluit de buizen aan de andere kant van de stroomcontrollers aan met de vacuümpomp. Zorg ervoor dat de stroom gaat van de module via de flow controllers naar de vacuümpomp.
  3. Sluit het waterbad aan met de verwarmingswatervoorziening. De watervoorziening gaat van het waterbad naar de waterinlaat op de spuitbus. Sluit de waterafvoer van de spuitbusgeleidingsmodule aan op de waterinlaat van de bemonsteringsmodule. Sluit de cirkel met een verbinding van de waterafvoer van de bemonsteringsmodule naar het waterbad.
  4. Plaats de aërosolgenerator, met inbegrip van de elutriator dicht bij de blootstellingsmodule, en sluit de overtollige lijnen van de elutriator en de blootstellings- en schoneluchtmodule aan met grote microfilters, en de zuiging van de blootstellingskamers met kleine microfilters (bijv. wegwerpfilters). De elutriator dient als reservoir voor de gegenereerde deeltjesatmosfeer en behoudt deeltjes groter dan ongeveer 7 μm, terwijl kleinere deeltjes naar de blootstellingsmodule worden getransporteerd.
  5. Sluit de computer aan die wordt gebruikt om de aerosolgeneratie via een USB-kabel en de voeding op de voedingspoort te bedienen. Sluit de ac-stekker van de voeding aan op een stopcontact (220-240 V).
  6. Sluit de leidingen voor de middelgrote levering en verwijdering aan met twee pompen. In plaats van een pomp te gebruiken voor de medium voeding, kan het medium ook handmatig worden gevuld.

7. Voorbereiding op blootstelling aan schone lucht en deeltjes

  1. Zet de vacuümpomp, de stroomregelaars en het waterbad (37 °C) in voor een opwarmperiode van ten minste 30 min.
  2. Open de persluchttoevoer. Stel de massastroomregelaars in op 8 L/min voor de toevoerlijn op de spuitbusgenerator en op 3 L/min voor de toevoerlijn op de fles met drie hals. Sluit de tabbladen van de massastroomcontrollers.
    OPMERKING: Deze waarden kunnen variëren afhankelijk van de kenmerken van de teststof.
  3. Pas de stroomregelaars via de computer aan om de modulestroom (1,5 L/min) en de kamerzuiging (30 mL/min) te regelen.

8. Lekkagetest van het radiale stroomsysteem

OPMERKING: De lekcontrole moet onder vacuüm en voor beide modules (belichting en schone luchtmodule) worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de module goed is gemonteerd.

  1. Verwijder de inlaatadapter en de condensaatreflector uit de spuitbusgeleidingsmodule. Sluit de drie spuitbussen in de spuitbusgeleidingsmodule met stekkers en de medium toevoeraansluitingen bij de bemonsteringsmodule met dummy-kleppen.
  2. Sluit de vacuümlijnen zonder het filter aan met de buisconnector van de aerosolgeleidingsmodule. Sluit de module met het handwiel en meet de waarde van de stroomcontrollers. De waarden moeten enkele minuten na het sluiten van minder dan 5 mL/min dalen.
  3. Verwijder na de ondoordringbaarheidscontrole alle stekkers en dummy-flappen, steek de inlaatadapter en de condensaatreflector in de spuitbus en sluit de leidingen aan voor middelgrote levering en verwijdering.

9. Aerosol generatie

  1. Start de computer en de software (Aanvullende figuur 4). Start de aerosol generator software door dubbel te klikken op de aerosol generator startknop op het bureaublad van de computer. Er verschijnt een berichtvenster en vraagt of de instellingen opnieuw moeten worden ingesteld of niet. Klik op Ja als de software voor het eerst die dag wordt gestart. Stel de waarden voor Diapositie en Schraperpositie in op de standaardwaarden. Klik op Nee om de waarden voor diapositie en schraperpositie te behouden of de dia bevindt zich niet in de startpositie.
  2. Schroef een stof schraper in de pijp, die zich bevindt in de centrale opening van de aerosol generator top.
    OPMERKING: Afhankelijk van de perskenmerken kunnen verschillende soorten stofschraper worden gebruikt.
  3. Gebruik de knop Homing Mode als de stof schraper is niet in de laagste positie.
  4. Plaats de stofcontainer met het geperste testmateriaal ondersteboven over de stofschraper. Zorg ervoor dat het glas van de stofcontainer naar de voorkant kijkt. Zorg ervoor dat de twee gaten in de stof container passen op de twee pinnen van de aerosol generator top. Plaats de vergrendelingplaat in de sleuf over de stofcontainer en draai de zwarte schroef aan.
  5. Wijzig de waarden voor Feed (0,24 tot 20 mm/h) en Rotatie (1 tot 800 toeren/h) in de gewenste instellingen. De deeltjesconcentratie kan worden gewijzigd door de voederwaarde of de gasstroomsnelheid van de drager te verhogen of te verlagen.
  6. Gebruik de neerwaartse pijlen om de dia met de stofcontainer naar beneden te duwen totdat de stofschraper zich in de buurt van de geperste stof bevindt.
  7. Open de persluchttoevoer naar de aerosolgenerator met een tik van de massastroomregelaar en start de aerosolgeneratie door op de startknop te klikken. Stel de voersnelheid in op 15-20 mm/h om lange wachttijden te voorkomen.
  8. Bedien de juiste deeltjesgeneratie door de fijne stofwolk te observeren met een kleine zaklamp (van onderen achter de glazen buis van de Elutriator). Wijzig de waarde voor Feed terug naar de gewenste instellingen wanneer de eerste aerosoldamp continu de Elutriator bereikt en klik op de stopknop.

10. Blootstellingsexperimenten

  1. Start het medium met voorverwarmde belichtingsmedium en vul de bemonsteringsmodules totdat de downpipes zijn afgedekt terwijl de module open is. Gebruik de middelgrote pomp of vul het medium handmatig (25 mL per individuele belichtingskamer).
  2. Voeg in de blootstellingsmodule in de voegstukken van de blinde celkweek (inserts zonder cellen). Pomp het belichtingsmedium naar beneden totdat de downpipes zijn bedekt met medium en de onderkant van de wisselplaten in contact zijn met medium.
  3. Start de aerosolgenerator, sluit de belichtingsmodule en sluit de belichtingsmodule aan op de uitlaat van de belichtingsmodule van de aerosolgenerator. Geef de aerosolgenerator een doorlooptijd van ten minste 20-30 minuten voordat de blootstelling wordt gestart om een stabiele generatie deeltjes mogelijk te maken.
  4. Bereid de post-incubatieplaten voor op de couveusebesturingselementen en de blootgestelde celkweekwisselplaten tijdens de doorlooptijd. Voeg 1,5 mL groeimedium per put toe en bebroed de platen in de couveuse (37 °C, 5% CO2).
  5. Sluit na de doorlooptijd de uitlaat van de belichtingsmodule van de Elutriator af met een rubberen stekker en verwijder de blinde inzetstukken. Vul het belichtingsmedium (met behulp van de pomp of handmatig) tot de downpipes zijn bedekt met medium. Open nu ook de persluchttoevoer naar de clean air module met de kraan van de massastroomcontroller (3 L/min)
  6. Verwijder de celkweekinserts van de 6-putplaten met behulp van een pincet. Giet het groeimedium voorzichtig uit de celcultuur inserts af door omver te werpen de inserts en aanzuigen en gooi de resterende vloeistof met behulp van een pipet. Plaats de wisselplaten in de belichtingskamers van beide modules, de belichtings- en schone luchtmodule.
  7. Sluit de modules en start de blootstellingsexperimenten door de blootstellingsmodule tegelijkertijd aan te sluiten op de uitlaat van de blootstellingsmodule van de aerosolgenerator en de schone luchtmodule op de gastoevoer van de drager.
    OPMERKING: De deeltjesconcentratie kan worden gewijzigd door de feedwaarde, de gasstroomsnelheid van de drager of het tijdstip van blootstelling te verhogen/verlagen.
  8. Koppel de belichtings- en schone luchtmodules na voltooiing van het experiment los en sluit de uitlaat van de belichtingsmodule af.
  9. Stop de persluchttoevoer en de spuitbusgenerator door op de stopknop te klikken.
  10. Open de belichtings- en schone luchtmodule en breng de celkweekinserts met behulp van een pincet naar de voorbereide post-incubatieplaten. Incubeer de 6-well platen voor 24 uur (37 °C, 5% CO2)bij de ALI.
    OPMERKING: Herhaal stappen 10.5 -10.10 als verdere blootstellingsexperimenten zijn gepland.
  11. Til de celkweekinserts op, die worden gebruikt als couveusebesturingselementen voor de ALI onder dezelfde omstandigheden als de blootgestelde celkweek inserts en uitbroedze voor 24 uur (37 °C, 5% CO2)in de ALI.
  12. Gebruik de knop Homing Mode om de stofcontainer te verwijderen. Sluit de spuitbusgeneratorsoftware door op de X in de rechterbovenhoek te klikken en de computer uit te schakelen.
  13. Na voltooiing van alle blootstellingsexperimenten, reinig de aerosolgenerator en beide blootstellingsmodules. Sluit de stofcontainer met parafilm als de teststof binnen de komende dagen verder wordt gebruikt.

Dag 3

11. Levensvatbaarheid van de cel

OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel werd 24 uur na deeltjesdepositie bepaald door de mitochondriale activiteit te meten met behulp van de WST-1-test. De test werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. De levensvatbaarheid van cellen kan ook worden bepaald aan de hand van andere cellevensvatbaarheidstests (bijvoorbeeld XTT).

  1. Temper het groeimedium bij 37 °C en ontdooi de WST-1 oplossing beschermd tegen licht. Bereid een passend aantal nieuwe 6-well platen met 2,5 mL groeimedium per put en incubeer de platen in de couveuse.
  2. Bereid de WST-1 verdunning voor door een voldoende hoeveelheid WST-1 1:7 in groeimedium te verdunnen
  3. Steek de celkweek 24 uur na blootstelling in de nieuwe voorbereide 6-put platen. Voeg 1 mL van de vers bereide WST-1 oplossing toe aan elke celkweekinsert. Rock de platen voorzichtig om de oplossing homogeen op de cellen te verdelen. Incubeer de 6-putten met de celkweek inserts voor 1 h (37 °C, 5% CO2).
  4. Breng 100 μL van de supernatant in drievouden van elke 6-well naar een 96-put plaat. Meet de absorptie op 450 nm met een referentiegolflengte van 650 nm met behulp van een microplatelezer.

12. Statistieken

  1. Normaliseer de levensvatbaarheid van de cel van de individuele incubatorcontroles tot 100%.
  2. Druk de levensvatbaarheid van de blootgestelde cellen uit in relatie tot de individuele incubatorcontroles. Cytotoxiciteit van teststoffen werd vergeleken met de respectieve couveusecontroles en gebruikt als indicator van toxiciteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De CULTEX RFS is een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de directe en homogene blootstelling van cellen in de ALI mogelijk maakt. In een eerdere prevalidatiestudie werden met succes de algemene toepasbaarheid van dit blootstellingssysteem en de overdraagbaarheid, stabiliteit en reproduceerbaarheid ervan aangetoond. In een recent onderzoeksproject gefinancierd door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek, werd het blootstellingssysteem met succ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De afgelopen jaren zijn veel niet-dierinhalatietestmodellen ontwikkeld om informatie te verkrijgen over het acute inademingsgevaar van inhaleerbare deeltjes en om dierproeven te verminderen en te vervangen volgens het 3R-principe25.

In termen van celkweekmodellen kan blootstelling van cellen worden gedaan onder ondergedompelde omstandigheden of bij de ALI. Het blootstellen van cellen onder ondergedompelde omstandigheden kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT en DS hebben niets te onthullen. Het bedrijf Cultex Technology GmbH (voorheen Cultex Laboratories GmbH) produceert instrumenten (bijvoorbeeld CULTEX RFS, CULTEX DG) die in dit artikel worden gebruikt. NM was tijdens dit onderzoek een medewerker van Cultex Laboratories GmbH. OK is een werknemer van Cultex Technology GmbH (voorheen Cultex Laboratories GmbH). Het octrooi PCT/EP2009/007054 voor het apparaat wordt vasthouden door de oprichter van de Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (voorheen Cultex Laboratories GmbH).

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Duitsland (Grant 031A581, subproject A-D)) en door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Research Training Group GRK 2338).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellen
A549ATCCCCL-185
Cellen kweekmedium en benodigdheden
DMEMBiochrom, Berlijn, DuitslandFG 0415gebruikt als groeimedium
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Duitsland22320gebruikt als blootstellingsmedium
FBS superiorBiochrom, Berlijn, DuitslandS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlijn, DuitslandA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, DuitslandL 0180
PBSBiochrom, Berlijn, DuitslandL 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)Biochrom, Berlijn, DuitslandL 2143
Cellen kweekmateriaal
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, DuitslandREF 05651794
Cellen kweekplatenCorning, Wiesbaden, Duitsland35166­-well platen
Corning Transwell cellen kweek insertsCorning, Wiesbaden, Duitsland345024mm inserts; 6-­well platen; 0.4 µm
Chemie
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, DuitslandREF 05651808001
Perslucht (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Duitsland2290152
WST-1Abcam, Cambridge, Verenigd Koninkrijkab155902
Instrumenten + apparatuur
CASY CeltellerSchärfe System GmbH, Reutlingen, Duitsland
CirculatiethermostaatLAUDA, Lauda-Königshofen, DuitslandEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulische persCultex® Technology GmbH, Hannover, Duitsland
CULTEX insert sleeveCultex® Technology GmbH, Hannover, Duitsland
CULTEX RFS - Radiaal stromingssysteem Type 2 (module voor deeltjesblootstelling)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Duitsland
CULTEX RFS - Radiaal stromingssysteem Type 2 (module voor schone luchtblootstelling)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Duitsland
CULTEX bevoorrading
Debietregelaar 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Debietregelaar 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (groot)Munktell & Filtrak GmbH, Saksen, DuitslandLP-050Munktell steriele filter; Deeltjesretentie-efficiëntie > 99,999%
Filters (klein)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Duitsland9933-05-DQBalston wegwerpfilter
Medium pompCole-Parmer GmbH, Wertheim, DuitslandIsmatec IPC High Precision Multichannel Dispenserdigitale peristaltische pomp
Microplate Reader Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Duitsland
VakuumpompKNF, Freiburg, DuitslandN86 KT.18
Vögtlin massaflowregelaar 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
WaterbadLAUDA, Lauda-Königshofen, DuitslandEcoline Staredition RE 104

Referenties

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

In vitro blootstellingradiale stroomingssysteemaerosolgeneratieparticulair depositiecelviabiliteitsassayWST1 oplossing
Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.