Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het membraan gebonden pyrofosfatasen (mPPases) zijn dimere enzymen die voorkomen bij bacteriën, Archaea, planten en protist parasieten. Deze eiwitten klieven pyrofosfaat in twee orthofosfaatmoleculen, die gepaard gaat met proton en/of natriumionen die over het membraanpompen. Omdat er geen homologe eiwitten voorkomen bij dieren en mensen, zijn mPPases goede kandidaten in het ontwerp van potentiële geneesmiddel doelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het scherm voor mPPase-remmers met behulp van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat systeem. We gebruiken mPPase van de thermofiele bacterie Thermo toga maritima (tmppase) als een model enzym. Dit protocol is eenvoudig en goedkoop en produceert een consistent en robuust resultaat. Het duurt slechts ongeveer een uur om het activity assay protocol te voltooien vanaf het begin van de assay tot de extinctie meting. Aangezien de blauwe kleur die in deze test wordt geproduceerd gedurende een lange periode stabiel is, kunnen de volgende test (s) onmiddellijk na de vorige batch worden uitgevoerd en kan de extinctie later voor alle batches tegelijk worden gemeten. Het nadeel van dit protocol is dat het handmatig wordt gedaan en dus kan worden vermoeiend en vereisen goede vaardigheden van pipetteren en tijd houden. Bovendien bevat de in deze bepaling gebruikte arseniet-citraatoplossing natrium arseniet, wat giftig is en met de nodige voorzorgsmaatregelen moet worden behandeld.
Inleiding
Ongeveer 25% van de totale cellulaire eiwitten zijn membraan eiwitten en ongeveer 60% van hen zijn drug targets1,2. Een van de potentiële drug targets3, membraangebonden pyrofosfatasen (mPPases), zijn dimere enzymen die proton en/of natrium ion over het membraanpompen door hydrolyse van pyrofosfaat in twee orthofosfaataten4. mPPases kan worden gevonden in verschillende organismen5 zoals bacteriën, Archaea, planten, en protist parasieten, met uitzondering van mensen en dieren4. Bij protist parasieten, bijvoorbeeld
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. eiwit preparaat
Opmerking: de uitdrukking en zuivering van TmPPase is elders beschreven13.
- Bereid 10 ml van de reactiverings Bufferoplossing met 20 mm 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (mes) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm dithiotreïtol (DTT) en 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
- Bereid 10 mL van het reactiemengsel met 200 mM tris-cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCl en 67 mm NaCl.
Opmerking: mg2 + is vereist om het pyrofosfaat te cheleren als het substraat van Mppase, K+ is nodig om de enzymactiviteit te verhogen, aangezien tmppase een kalium-afhank....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol werden acht verbindingen (1 − 8) getest (Figuur 2a) samen met IDP, een gemeenschappelijke remmer van pyrofosfatasen, als een positieve controle. Elke verbinding werd getest in drie verschillende concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) in drievat. De workflow van de screening wordt afgebeeld in Figuur 1, beginnend bij monster-en reagens voorbereiding tot de extinctie meting bij 860 nm.
Aan het einde van dit protocol, na de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige screening van remmers voor membraan-gebonden pyrofosfatase van T. maritima in een 96 goed plaat formaat op basis van Vidilaseris et al.14. Dit protocol is goedkoop en gebaseerd op 12-fosforolybdisch zuur, dat wordt gevormd uit ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden en gereduceerd tot fosforolybdenum soorten met een duidelijke blauwe kleur12. Deze methode heeft de voorkeur boven andere proto.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de subsidies van de Jane en Aatos Erkko Foundation en de BBSRC (BB/M021610) aan Adrian Goldman, de Academie van Finland (nr. 308105) aan Keni Vidilaseris, (nr. 310297) aan Henri Xhaard, en (nr. 265481) aan Jari Yli-Kauhaluoma, en de studie fondsen van de Universiteit van Helsinki aan Gustav boije af Gennäs. De auteurs danken Bernadette Gehl voor haar technische hulp tijdens het project.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
Referenties
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
