Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Samenvatting

Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.

Samenvatting

Het membraan gebonden pyrofosfatasen (mPPases) zijn dimere enzymen die voorkomen bij bacteriën, Archaea, planten en protist parasieten. Deze eiwitten klieven pyrofosfaat in twee orthofosfaatmoleculen, die gepaard gaat met proton en/of natriumionen die over het membraanpompen. Omdat er geen homologe eiwitten voorkomen bij dieren en mensen, zijn mPPases goede kandidaten in het ontwerp van potentiële geneesmiddel doelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het scherm voor mPPase-remmers met behulp van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat systeem. We gebruiken mPPase van de thermofiele bacterie Thermo toga maritima (tmppase) als een model enzym. Dit protocol is eenvoudig en goedkoop en produceert een consistent en robuust resultaat. Het duurt slechts ongeveer een uur om het activity assay protocol te voltooien vanaf het begin van de assay tot de extinctie meting. Aangezien de blauwe kleur die in deze test wordt geproduceerd gedurende een lange periode stabiel is, kunnen de volgende test (s) onmiddellijk na de vorige batch worden uitgevoerd en kan de extinctie later voor alle batches tegelijk worden gemeten. Het nadeel van dit protocol is dat het handmatig wordt gedaan en dus kan worden vermoeiend en vereisen goede vaardigheden van pipetteren en tijd houden. Bovendien bevat de in deze bepaling gebruikte arseniet-citraatoplossing natrium arseniet, wat giftig is en met de nodige voorzorgsmaatregelen moet worden behandeld.

Inleiding

Ongeveer 25% van de totale cellulaire eiwitten zijn membraan eiwitten en ongeveer 60% van hen zijn drug targets^1,2. Een van de potentiële drug targets³, membraangebonden pyrofosfatasen (mPPases), zijn dimere enzymen die proton en/of natrium ion over het membraanpompen door hydrolyse van pyrofosfaat in twee orthofosfaataten⁴. mPPases kan worden gevonden in verschillende organismen⁵ zoals bacteriën, Archaea, planten, en protist parasieten, met uitzondering van mensen en dieren⁴. Bij protist parasieten, bijvoorbeeld Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii en Trypanosoma brucei, zijn mppases essentieel voor de parasiet virulentie⁶ en Knockout van deze expressie in de parasieten leiden tot falen bij het handhaven van intracellulaire pH bij blootstelling aan de uitwendige basis pH⁷. Vanwege hun belang en gebrek aan homologe eiwitten die aanwezig zijn in gewervelde dieren, kunnen mPPases worden beschouwd als potentiële geneesmiddel doelen voor protistal ziekten³.

De in vitro screening van mPPase-remmers in dit werk is gebaseerd op een TmPPase-modelsysteem. TmPPase is een natrium-ion-pomp en kalium-ion-afhankelijke mPPase van T. maritima en heeft zijn optimale activiteit bij 71 °c⁸. Voordelen van dit enzym zijn bijvoorbeeld het gemak in de productie en zuivering, goede thermische stabiliteit en hoge specifieke activiteit. Tmppase vertoont zowel een hoge gelijkenis als de volledige instandhouding van de positie en de identiteit van alle katalytische residuen aan de protist mppases^3,9 en aan de opgeloste structuur van Vigna radiata¹⁰ mppase. De beschikbare structuren van TmPPase in verschillende conformaties zijn ook nuttig voor structuur gebaseerde drug design experiment (als virtuele screening en de Novo ontwerp).

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van TmPPase remmers in een 96 goed plaat formaat (Figuur 1). Het protocol is gebaseerd op de colorimetrische methode van de molybdeen-blauwe reactie, die voor het eerst werd ontwikkeld door Fiske en Subbarow¹¹. Deze methode omvat de vorming van 12-fosforzuurzuur uit het ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden, die vervolgens wordt gereduceerd tot karakteristieke blauw kleurige fosforolybdenum soorten¹².

Protocol

1. eiwit preparaat

Opmerking: de uitdrukking en zuivering van TmPPase is elders beschreven¹³.

1. Bereid 10 ml van de reactiverings Bufferoplossing met 20 mm 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (mes) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm dithiotreïtol (DTT) en 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Bereid 10 mL van het reactiemengsel met 200 mM tris-cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl₂, 333 mm KCl en 67 mm NaCl.
   Opmerking: mg^{2 +} is vereist om het pyrofosfaat te cheleren als het substraat van Mppase, K⁺ is nodig om de enzymactiviteit te verhogen, aangezien tmppase een kalium-afhankelijke mppase is en na⁺ nodig is voor de enzymactiviteit tijdens natriumiontranslocatie door tmppase.
3. Bereid 30 mg/mL liposomen voor enzym reactivering.
   1. Voeg 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 toe met 1 mM DTT tot 0,3 g L-α-dunlaag van sojabonen tot 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 met 1 mM DTT.
   2. Zet het liposoom op ijs en sonificeren met 1 seconde puls interval gedurende 1 minuut, pauzeer gedurende 1 minuut en herhaal dit totdat de oplossing transparant geel wordt.
   3. Aliquot de liposomen, Vries in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot gebruikt.
4. Het enzym opnieuw activeren.
   1. Meng 40 μL van de liposomen oplossing met 22,5 μL van 20% DDM.
   2. Verwarm het mengsel gedurende 15 minuten bij 55 °C en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
   3. Voeg 36,5 μL van de reactiverings bufferoplossing toe, meng en voeg 1 μL geconcentreerd eiwit (13 mg/mL) toe om een totale concentratie van 0,13 mg/mL te maken.
      Opmerking: eiwitten worden gewoonlijk bevroren in 10 μL aliquots na zuivering en ontdooid op ijs voor gebruik.
5. Neem 20 μL van het gereactiveerde enzym en voeg toe aan 1.480 μL van het reactiemengsel en meng vervolgens zachtjes.
   Opmerking: de toevoeging van het gereactiveerde enzym aan het reactiemengsel moet worden uitgevoerd vlak voordat het wordt gebruikt.

2. samengestelde preparaat

1. Los de verbindingen in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) op om stamoplossingen van 25 − 100 mM te maken in 50 − 200 μL, op basis van de beschikbaarheid van de verbindingen.
   Opmerking: alle verbindingen die hier worden gebruikt (afbeelding 2A) zijn eerder gepubliceerd⁹. Als de samengestelde oplosbaarheid laag is, kan de voorraad concentratie dienovereenkomstig worden aangepast.
2. Bereid drie verschillende concentraties van elke verbinding in water.
   NB: de uiteindelijke concentraties in het reactiemengsel zijn respectievelijk 1, 5 en 50 micromolar of 1,5 en 20 micromolaire voor oplosbare en slecht oplosbare verbindingen.
   1. Verdun de stamoplossing met water tot 1 mL in microbuisjes om 2 μM, 10 μM en 100 μM te geven voor oplosbare verbindingen, of als alternatief 2 μM, 10 μM en 40 μM voor slecht oplosbare verbindingen.
   2. Vortex de samengestelde oplossing onmiddellijk na verdunning van de stamoplossing voor een goede menging.
3. Controleer op samengestelde aggregatie met behulp van een nephelometer.
   Opmerking: dit werd bestudeerd als triplicaten in drie concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) en genormaliseerd naar de blanco in een 96 goed plaat.
   1. Verdeel 75 μL van het reactiemengsel in elke put met behulp van een multikanaalspipet.
   2. Voeg 75 μL van elke stof toe (voor de blanco, gebruik in plaats daarvan 75 μL water) en meng door pipetteren op en neer 5 ×.
   3. Meet elk goed op 300 V met behulp van een microplaat nephelometer.

3. reagentia voor de bereiding van de assay

1. Bereid de arseniet-citraat oplossing.
   1. Weeg 5 g natrium arseniet en 5 g triatriumcitraat dihydraat af.
      VOORZICHTIG: natrium arseniet is giftig, dus gebruik de juiste beschermende uitrusting en handvat met speciale zorg. Behandel als voorzorgsmaatregel niet voordat alle noodzakelijke veiligheidsmaatregelen zijn gelezen en begrepen. Behandel alleen in een rook afzuigkap om stof/dampen van de stof of de oplossing (en) niet te inhaleren. Bij inademing, naar de frisse lucht gaan en medische hulp inroepen. Draag een geschikte chemische veiligheidsbril, beschermende handschoenen en kleding om inslikken en ogen/huidcontact te voorkomen. Bij inslikken onmiddellijk een Antigifcentrum of een arts raadplegen. Als het op de huid of in het oog (s), wassen met veel water en het verkrijgen van medische hulp.
   2. Los in 100 mL water.
   3. Voeg 5 mL ijsazijn, meng, en voeg water toe aan 250 mL.
   4. Bewaren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
      Opmerking: de oplossing is langer dan een jaar stabiel.
2. Oplossing A en oplossing B voorbereiden.
   1. Voeg voor oplossing A 10 mL ijskoude 0,5 M HCl toe aan 0,3 g ascorbinezuur. Los het ascorbinezuur op door vortexing.
   2. Voeg voor oplossing B 1 mL ijskoud water toe aan 70 mg ammonium heptamolybdaat tetrahydraat en Vortex om op te lossen.
      Opmerking: Bewaar beide oplossingen op ijs tot het gebruik. Voor de consistentie van het testresultaat kunnen beide oplossingen maximaal één week op ijs worden opgeslagen.
3. Bereid de fosfaat (P_i) standaard met de concentratie van 0 μM, 62,5 μm, 250 μm en 500 μm voor kalibratie.
   1. Voeg 0 μL, 25 μL, 50 μL en 100 μL van 5 mM na₂HPO₄ dihydraat toe aan vier microbuisjes met 370 μl van het reactiemengsel.
   2. Top tot 1 mL met water.

4. activiteitstest voor 1 96 well plate

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor de schematische workflow van de assay.

1. Voeg 1 ml oplossing B toe aan 10 ml oplossing A, Meng door grondig en bewaar de oplossing op ijs.
   Opmerking: deze oplossing moet transparant en geel zijn. Houd de oplossing A + B op ijs gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik. Echter, gebruik de oplossing binnen 3 h als het slecht zal gaan na lange termijn opslag.
2. Voeg met een multikanaalspipet 40 μL van 0 μM, 62,5 μM, 250 μM en 500 μM P_i standaard toe aan de buis stroken in drievat.
   Opmerking: het reactiemengsel met geen P_Ik toegevoegd zal worden gebruikt als een blanco.
3. Voeg met een meerkanaalspipet 25 μL samengestelde oplossing toe aan de buis stroken.
   Opmerking: elke verbinding heeft drie verschillende concentraties in drievat wat voldoende is voor de initiële schatting van de halve maximale remmende concentratie (IC₅₀). Voor een nauwkeurigere IC₅₀ bepaling kunnen acht verschillende samengestelde concentraties worden gebruikt. Voor het niet-geremde enzym wordt de samengestelde oplossing vervangen door gelijke hoeveelheid water. Als positieve controles werden 2,5 μM, 25 μM en 250 μM van imidodifosfaat (IDP) natriumzout gebruikt.
4. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 15 μL mPPase-oplossing mengsel toe aan de buisstrips (behalve aan de buizen die P_i -standaard bevatten).
5. Sluit de buis stroken af met een zelfklevende afdichtings plaat. Snijd de afdichtings plaat om elke buis strook te scheiden.
6. Pre-incuberen de monsters gedurende 5 min bij 71 °C. Plaats de monsters op het verwarmingsblok met een interval van 20 s tussen elke strook om het tijdverbruik tijdens de volgende stappen te minimaliseren.
7. Open de zelfklevende afdichting voor elke strook. Voeg 10 μL van 2 mM Natriumpyrofosfaat dibasisch toe met behulp van een multikanaalspipet en meng door pipetteren op en neer gedurende 5 ×. Sluit de buis strook opnieuw met dezelfde afdichting.
   Opmerking: deze stap kan in eerste instantie moeilijk te bereiken zijn in 20 s; echter, het zal gemakkelijker worden na sommige assays.
8. Incuberen bij 71 °C gedurende 5 min.
9. Plaats de monsters op het koelapparaat met een interval van 20 s tussen elke strook. Laat ze 10 min afkoelen, maar Centrifugeer elke strook kort na 5 min afkoeling, gietwater druppels onder de afdichtings plaat, zet het terug naar het koelapparaat en verwijder de afdichting.
   Opmerking: het koelapparaat kan eenvoudig worden gemaakt door het plaatsen van een 96 goed PCR-plaat op een polystyreen Petri schaal (maat 150 mm × 15 mm) gevuld met water en bevroren gedurende ten minste 1 uur. Het apparaat moet ongeveer 5 minuten vóór het begin van de test uit de vriezer worden gehaald. Haal het koelapparaat niet uit het midden voordat u het monster afkoelt, omdat het het reactiemengsel blokkeert en de kleurontwikkeling belemmert.
10. Voeg na 10 min van de koeling 60 μL oplossing A + B toe, Meng door pipetteren op en neer gedurende 5 × en houd de buis stroken op het koelapparaat gedurende 10 minuten.
11. Voeg 90 μL van de arseniet citraat oplossing toe en houd gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur om een stabiele blauwe kleur te produceren.
    Let op: vanwege de toxiciteit moeten alle oplossingen die natrium arseniet bevatten, te allen tijde met extra verzorging worden behandeld. Zo moet de toevoeging van arseniet-citraatoplossing worden gedaan in een rook afzuigkap.
12. Verdeel 180 μL van elk reactiemengsel in een heldere 96 goed polystyreen microplaat.
13. Meet de extinctie van elke put bij 860 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer.

5. resultaat analyse

1. Gemiddelde van de triplicaten van elk monster en de P_i -normen. Vervolgens aftrekken met de blanco om het achtergrond signaal te elimineren.
2. Maak een ijkcurve door het uitzetten van de extinctie (A₈₆₀) waarden ten opzichte van de hoeveelheid P_i standaard (nmol) en voer een lineaire regressie uit om de trendlijn functie te verkrijgen met behulp van de volgende formule:
   
3. Bereken de fosfaat hoeveelheid (nmol) die vrijkomt uit de enzymatische reactie op basis van de bovenstaande lineaire regressie formule.
4. Bereken de specifieke activiteit met behulp van de volgende formule:
   
   waar NP_i de hoeveelheid fosfaat is die vrijkomt uit de reactie (nmol), t is de reactietijd (min), en m_TmPPase is de hoeveelheid zuivere tmppase die wordt gebruikt in de assay (mg).
5. Bereken de procentuele activiteit voor elke concentratie van de remmer met behulp van de volgende formule:
   
   waar sa_iis de specifieke activiteit van een monster met remmer en sa_un is de specifieke activiteit van de onbevangen monster.
6. Bereken de logica₅₀ (raming) en IC₅₀ (raming) met een niet-lineaire regressie die past bij de 4-parameter dosis-responscurve met behulp van de volgende formule:
   
   waar X is log van concentratie (μM), Y is activiteit (%), boven en onder zijn plateaus in dezelfde eenheid als Y (100% en 0%, respectievelijk), logica₅₀ heeft dezelfde log eenheden als X, en Hill slope = helling factor of heuvel helling, die unitless is.
   Opmerking: de software (tabel met materialen) wordt gebruikt voor de montage. Gebruik de concentratie van 0,01 μM (in plaats van 0,00 μM) voor het monster zonder remmer, aangezien de logaritme van nul niet is gedefinieerd.

Resultaten

In dit protocol werden acht verbindingen (1 − 8) getest (Figuur 2a) samen met IDP, een gemeenschappelijke remmer van pyrofosfatasen, als een positieve controle. Elke verbinding werd getest in drie verschillende concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) in drievat. De workflow van de screening wordt afgebeeld in Figuur 1, beginnend bij monster-en reagens voorbereiding tot de extinctie meting bij 860 nm.

Aan het einde van dit protocol, na de ...

Discussie

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige screening van remmers voor membraan-gebonden pyrofosfatase van T. maritima in een 96 goed plaat formaat op basis van Vidilaseris et al.¹⁴. Dit protocol is goedkoop en gebaseerd op 12-fosforolybdisch zuur, dat wordt gevormd uit ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden en gereduceerd tot fosforolybdenum soorten met een duidelijke blauwe kleur¹². Deze methode heeft de voorkeur boven andere proto...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG