Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Samenvatting

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Samenvatting

Muismodellen zijn de benchmarktests voor in vivo kankerstudies. Kosten, tijd en ethische overwegingen hebben echter geleid tot oproepen tot alternatieve in vivo kankermodellen. Het kipchorioallantoïsche membraan (CAM) model biedt een goedkoop, snel alternatief dat directe visualisatie van tumorontwikkeling mogelijk maakt en geschikt is voor in vivo beeldvorming. Als zodanig probeerden we een geoptimaliseerd protocol te ontwikkelen voor het enten van gynaecologische en urologische tumoren in dit model, dat we hier presenteren. Ongeveer 7 dagen na bevruchting wordt de luchtcel verplaatst naar de gevasculariseerde kant van het ei, waar een opening in de schaal wordt gecreëerd. Tumoren uit murine en menselijke cellijnen en primaire weefsels kunnen dan worden geënt. Deze zijn meestal gezaaid in een mengsel van extracellulaire matrix en medium om cellulaire verspreiding te voorkomen en bieden voedingsstoffen ondersteuning totdat de cellen werven een vasculaire levering. Tumoren kunnen dan groeien tot een extra 14 dagen voorafgaand aan de eieren uitkomen. Door het implanteren van cellen stabiel getrans-transduced met firefly luciferase, bioluminescentie beeldvorming kan worden gebruikt voor de gevoelige detectie van tumorgroei op het membraan en kankercel verspreid over het embryo. Dit model kan mogelijk worden gebruikt om tumorigeniciteit, invasie, metastase en therapeutische effectiviteit te bestuderen. De kip CAM model vergt aanzienlijk minder tijd en financiële middelen in vergelijking met traditionele murine modellen. Omdat de eieren immuungecompromitteerd en immuuntolerant zijn, kunnen weefsels van elk organisme mogelijk worden geïmplanteerd zonder kostbare transgene dieren (bijvoorbeeld muizen) die nodig zijn voor implantatie van menselijke weefsels. Echter, veel van de voordelen van dit model kan potentieel ook beperkingen, met inbegrip van de korte tumor generatie tijd en immunogecompromitteerde / immuun tolerante status. Bovendien, hoewel alle tumortypes hier engraft in de kip chorioallantoic membraan model, ze doen dit met verschillende mate van tumorgroei.

Inleiding

Muizen hebben gediend als het klassieke model organisme voor de studie van menselijke ziekten, met inbegrip van maligniteit. Als zoogdieren, ze delen veel overeenkomsten met de mens. Hun hoge mate van genetische gelijkenis heeft transgene manipulatie van het muizengenoom toegestaan om een enorm inzicht te geven in de genetische bestrijding van menselijke ziekten¹. Uitgebreide ervaring in de behandeling van en experimenteren met muizen heeft geresulteerd in hun zijn het model van keuze voor biomedisch onderzoek. Echter, in aanvulling op de ethische en wetenschappelijke bezorgdheid met betrekking tot murine modellen, kunnen ze ook vrij duur en tijdrovend^2,3. De ontwikkeling van tumoren kan weken of zelfs maanden duren. De huisvesting bij een typische instelling alleen kan draaien in de honderden tot duizenden dollars, terwijl tumoren zich ontwikkelen. Eierstokkanker is een voorbeeld van dit nadeel, omdat de groei van murine modellen kan gemakkelijk maanden duren. Vertragingen in de voortgang van het onderzoek hebben mogelijk gevolgen voor de aanhoudend lage overlevingskans van 5 jaar van 5 jaar van patiënten met eierstokkanker (d.w.z. een toename van de overleving van slechts 10% over 30 jaar)⁴. Op dezelfde manier vormen urologische kankers (nier-, prostaat- en blaaskanker) 19% van alle kankergevallen in de Verenigde Staten en 11% van de sterfgevallen in verband met kanker⁴. Zo kan een nieuwe in vivo benadering van gynaecologische en urologische kankers een laboratorium veel tijd, arbeid en geld besparen, zelfs als dit model alleen wordt toegepast op eerste screeningexperimenten. Bovendien kan de resulterende versnelling van de onderzoeksresultaten aanzienlijke gevolgen hebben voor de 177.000 personen gediagnosticeerd met deze kankers per jaar.

Het kip CAM model biedt vele voordelen die de bovengenoemde problemen aanpakken. Een populair model voor het bestuderen van angiogenese^5,6, tumorcel invasie^7,8, en metastase^7,9, het kuiken embryo CAM model is al gebruikt om vele vormen van kanker te bestuderen, waaronder glioom^10,11,12, hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom^13,14,leukemie^15,16, alvleesklierkanker¹⁷, en colorectale kanker¹⁸. Daarnaast zijn CAM-modellen gegenereerd voor neuroblastoom¹⁹, Burkitt lymfoom²⁰, melanoom²¹, en feline fibrosarcoma²². Eerdere studies hebben ook gepresenteerd engraftment van blaaskanker²³ en prostaatkanker cel lijnen²⁴, maar met beperkte protocol details. Eieren zijn niet alleen veel goedkoper dan muizen, maar produceren ook zeer reproduceerbare resultaten^25,26. Ze tonen een snelle vasculatuur ontwikkeling, en tumor engraftment kan optreden in zo snel als een paar dagen en worden in de lengterichting gevisualiseerd door het open venster. Met het 21 dagen tijdsbestek tussen eibevruchting en uitkomen, kunnen experimenten binnen een paar weken worden voltooid. Bovendien, de lage kosten, beperkte huisvesting behoeften, en kleine omvang gemakkelijk mogelijk grootschalige experimenten die onbetaalbaar zou zijn voor muis studies.

Daarom hebben we geprobeerd om het CAM-model te optimaliseren voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankers. Door de immunogecompromitteerde status van het vroege kippenembryo²⁷kunnen zowel muis- als menselijke cellen gemakkelijk worden geïmplanteerd. Als zodanig hebben we met succes geënt eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Voor elk van deze tumortypes accepteert de CAM gemakkelijk gevestigde murine- en/of menselijke tumorcellijnen. Belangrijk is dat vers geoogste primaire menselijke tumorweefsels ook kunnen enten van verteerde cellen of stukken vast weefsel met een hoog succespercentage. Elk van deze soorten kanker en celbronnen vereist optimalisatie, die we hier delen.

Protocol

Alle experimenten die hierin werden gepresenteerd werden beoordeeld en goedgekeurd door de juiste ethische commissies aan de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA). Het gebruik van gedeidentificeerde, primaire menselijke tumoren is goedgekeurd door de UCLA Institutional Review Board (Protocolnummers 17-000037, 17-001169 en 11-001363). Bij UCLA is onderzoek van het Comité voor dieronderzoek niet nodig voor experimenten met kippenembryo's; protocol goedkeuring is alleen vereist wanneer de eieren zullen worden uitgebroed. Best practices, zoals de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren, werden echter gebruikt om kippenembryo's ethisch te behandelen en pijn zoveel mogelijk te voorkomen. Onderzoekers worden aangespoord om de toezichtvereisten bij hun instelling te verifiëren voorafgaand aan het initiëren van studies met behulp van CAM-modellen.

1. Bereiding van de eieren

1. Voordat u de eieren ontvangt, moet u de eierbroedmachine assembleren tot 37,8 °C (100 °F) met een luchtvochtigheid van 60-70% volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Om besmettingsrisico's te minimaliseren, kan autoclaved water worden gebruikt om de vochtigheid te controleren.
2. Bij ontvangst bevrucht, Rhode Island Rode kippeneieren van een gecertificeerd laboratorium-grade eileverancier, droog veeg het oppervlak van de schelpen met papieren handdoeken. Een licht gedempte papieren handdoek kan worden gebruikt om vastgezet materiaal te verwijderen. Droog onmiddellijk.
   OPMERKING: Het natmaken van de schaal met vloeistof onder de 43,3 °C kan bacteriën in het ei brengen. Als men ervoor kiest de eieren te wassen of te desinfecteren, moet de temperatuur van de vloeistof tussen 43,3-48,9 °C liggen. Hogere temperaturen kunnen de eieren koken. De keuze van het ontsmettingsmiddel moet worden gemaakt op basis van de micro-organismen die bezorgdheid veroorzaken.
3. Gebruik een potlood of markering om de datum op het ei te labelen. Dit wordt beschouwd als ontwikkelingsdag 0.
4. Plaats de eieren in de eierbroedmachine en broed gedurende ten minste 7 dagen met rotatie om cam-ontwikkeling mogelijk te maken. Er mag een automatische rotator worden gebruikt of de eieren mogen 180° 2-3x per dag worden gedraaid.

2. Opening van de eieren

OPMERKING: Het openen van de eieren moet worden gedaan wanneer de CAM volledig is ontwikkeld. Dit is meestal op ontwikkelingsdag 7 of 8.

1. Desinfecteer een bioveiligheidskast met 70% ethanol. Op dezelfde manier desinfecteren en plaats in de bioveiligheidskast een eierrek, ei candler, marker, draadloze roterende gereedschap met een silicium carbide slijpsteen en cirkelsnijdenwiel, 18 G naald, pipet controller met kwart-inch vacuüm buizen, verpakkingstape, kantoor schaar, gebogen schaar, Semken (of iets dergelijks) tangen, katoenen ballen, en 6 x 7 cm transparante film dressing. Gebruik waar mogelijk steriele, wegwerp- of autoclaved-gereedschappen.
2. Zet de eierrotator uit. Plaats ongeveer 1-3 eieren in de bioveiligheidskast op het eierrek. Terwijl in het donker, plaats het ei kandelaar tegen de eierschaal om de luchtcel te identificeren. Markeer de locatie van de luchtcel.
   OPMERKING: De intensiteit van de verlichting van het ei kandelaar is cruciaal voor het visualiseren van het interieur van het ei. Als de luchtcel of vasculatuur is consequent moeilijk te zien, probeer het vervangen van de ei candler batterijen.
3. Verplaats het ei kandelaar over de schaal om een groot bloedvatnetwerk te vinden. Draai het ei indien nodig. Een ideale vasculatuur zal vertakken in de buurt van het midden van het ei. Gebruik een marker om over de vasculatuur te trekken om te worden gebruikt voor implantatie.
4. Doe het licht in de motorkap aan. Met behulp van een draadloze roterende gereedschap uitgerust met een silicium carbide slijpsteen, boor een klein gat in de schelp direct over het midden van de luchtcel. Boor tot het grootste deel van de schaal is verwijderd, maar het witte, binnenste membraan is intact.
   OPMERKING: Boren over de luchtcel voordat het richten van de vasculatuur maakt het mogelijk het bepalen van de dikte van die specifieke eierschaal over de luchtcel in plaats van over de CAM en vasculatuur. Als de CAM of vasculatuur wordt verstoord, is het ei niet bruikbaar voor implantatie.
5. Boor en open een ander klein gaatje waar het vaatvenster zal worden geopend zoals werd gedaan voor de luchtcel (stap 2.4).
6. Met behulp van een naald van 18 G, voorzichtig doorboren van het witte, binnenste membraan over de luchtcel en vasculatuur. Als niet in staat om de schelp te penetreren, dan voorzichtig boren een beetje meer. Zorg ervoor dat het witte, binnenste membraan (maar niet de CAM) wordt verstoord in het gehele geboorde gebied. Verwijdering van het membraanstuk is niet nodig.
   OPMERKING: Als de CAM of vasculatuur tijdens deze stap wordt verstoord, gooi het ei weg. Schade is duidelijk als er bloed of albumine lekt uit een geboord gat.
7. Doe het licht van de kap uit. Controleer met behulp van de eierkaars dat de luchtcel van het einde van het ei naar het gebied over de vasculatuur is overgebracht. Plaats indien nodig de vacuümslang die in een pipetcontroller rond het gat over de oorspronkelijke luchtcel wordt geplaatst en breng voorzichtig zuigkracht aan in korte uitbarstingen om de luchtcel te verplaatsen.
8. Gebruik een markering om de nieuwe locatie van de luchtcel ongeveer 0,5 cm binnen de lucht-CAM-grens te schetsen. Breng een stuk verpakkingstape net over de nieuwe luchtcel. Gebruik indien nodig een standaard kantoorschaar om de tape op een passende grootte te knippen.
   OPMERKING: Tape kan de luchtstroom door de schaal verstoren en mag niet groter zijn dan nodig is om de luchtcel volledig te bedekken.
9. Breng de eieren terug naar de couveuse om zonder rotatie te verwarmen met de nieuwe luchtcel naar boven gericht. Herhaal stap 2.2-2.9 voor de resterende eieren die moeten worden geopend.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Indien de kwaliteit van de CAM-ontwikkeling niet zeker is, moet een klein aantal eieren door stap 2.16 worden voortgezet voordat de resterende eieren worden geopend.
10. Plaats ongeveer 1-3 eieren met verplaatste luchtcellen op het eirek in de bioveiligheidskast.
    OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat besmetting in het geopende ei wordt voorkomen. Open daarom altijd eieren in een bioveiligheidskast en gebruik waar mogelijk steriele gereedschappen en apparatuur.
11. Met behulp van een draadloze roterende gereedschap uitgerust met een cirkelvormig snijwiel, snijd een kleine lijn over de luchtcel grens getrokken in stap 2.8. Zorg ervoor dat dit ongeveer 0,5 cm binnen de werkelijke lucht-CAM grens ligt om te voorkomen dat de CAM of vasculatuur wordt verstoord. Snijd volledig door de schelp, maar wees voorzichtig niet diep genoeg door te dringen om de CAM of vasculatuur te verstoren.
12. Met behulp van gebogen schaar, snijd rond de resterende luchtcel om een venster in de shell te creëren.
    OPMERKING: Als er bloed of membraan aanwezig is op de verwijderde schaal, is het ei niet geschikt voor implantatie. Als een groot deel van de eieren niet netjes worden geopend, overweeg dan minstens 1 extra dag te wachten om de resterende eieren te openen om een betere CAM-vorming mogelijk te maken. Als de schelpen van de resterende eieren niet zijn doorboord, moet de rotatie van de eieren in de couveuse worden hervat.
13. Controleer de levensvatbaarheid van het embryo. Levensvatbare embryo's tonen uitgebreide vasculatuur, duidelijke albumine, embryobeweging of een zichtbare hartslag.
14. Met behulp van Semken forceps, trek kleine stukjes katoen uit een steriele katoenen bal. Dep het CAM-oppervlak voorzichtig uit om het stof en vuil van de schaal te verwijderen.
    OPMERKING: Het verwijderen van vuil moet worden uitgevoerd op dezelfde dag dat de eieren worden geopend.
15. Bedek de shell opening met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante film dressing.
16. Breng de eieren terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat het ei stevig zit met het geopende raam naar boven gericht en de CAM niet aanraken van de transparante film dressing. Gebruik een stuk eirek, de rand van de ei rotator, of een ander geschikt item om alle eieren die blijven rollen prop.
17. Herhaal stap 2.10-2.16 voor alle resterende eieren die moeten worden geopend.
    OPMERKING: Het openen van de eieren hoeft niet te worden voltooid op dezelfde dag als implantatie. Wachten ten minste 1 dag kan helpen elimineren eieren waarvan de levensvatbaarheid werd aangetast door het openen van de shell.

3. Voorbereiding van de kankercelschorsing voor transplantatie (optie 1)

OPMERKING: Dit moet vlak voor de implantatie worden voltooid, die idealiter tussen dag 7 en 10 moet plaatsvinden. Zie notities aan het begin van stap 5 of 6 voor meer informatie over de implantatiedatum. Deze aanpak werd gebruikt voor alle cellijnen en gekweekte nierkanker tumor verteert.

1. Ontdooi de extracellulaire matrixoplossing op ijs.
2. Met behulp van mechanische en/of enzymatische spijsvertering, het verkrijgen van een eencellige suspensie met behulp van een methode die geschikt is voor het type cel wordt geïmplanteerd.
3. Het totale aantal cellen dat moet worden geïmplanteerd opnieuw opschorten in een geschikt medium voor implantatie. Implantaten van 1-2 x 10⁶ cellen per ei zijn typisch.
   OPMERKING: Het medium dat wordt gebruikt voor de implantatie van de cellijnen is meestal het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van de cellen, met FBS of serumvervanging. De implantatie van tumordigesten maakt meestal gebruik van het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van cellijnen van hetzelfde kankertype. Indien nodig kunnen de mediumformulering echter experimenteel worden aangepast. De effecten op tumorontwikkeling en groei zouden empirisch moeten worden bepaald.
4. Pellet de cellen met behulp van een centrifuge snelheid en tijd die geschikt is voor de cellen worden gebruikt. Typische snelheden zijn 250-300 x g,en tijden zijn 5-10 min.
5. Verwijder de supernatant uit de pelletse cellen door te besneeuwen. Mechanisch opnieuw opschorten van de cellen in het resterende medium via flicking of pipetteren. Plaats op ijs om af te koelen. Meet het volume cellen en medium met behulp van een geschikte grootte pipet.
6. Bereken implantatievolumes zodanig dat 1-2 x 10⁶ cellen worden geïmplanteerd in een volume van 20-100 μL per ei met een uiteindelijke extracellulaire matrixconcentratie van 2,7-4 mg/mL-eiwit. Voeg medium, alle gewenste groeifactoren of additieven, en extracellulaire matrix oplossing volgens deze berekening. Blijf op ijs tot klaar om te implanteren.
   OPMERKING: Voor de berekeningen in de stappen 3.3 en 3.6 moet een extra volume van ten minste de helft van het eiimplantaat worden opgenomen om een voldoende volume voor alle eieren in de groep te garanderen. Voor implantatie van de eierstokkankercellijnen (d.w.z. SKOV3 en ID8) werden 10⁶ cellen per ei geïmplanteerd. Voor implantatie van de niercelcarcinoma cellijn RENCA, gekweekte cellen afgeleid van verteerd primair menselijk niercelcareloom, prostaatkankercellijnen (d.w.z. CWR, C4-2 en MyC-CaP) en blaaskankercellijnen (d.w.z. HT-1376 en T24), werden 2 x 10⁶ cellen geïmplanteerd.

4. Voorbereiden van tumorstukken op implantatie (optie 2)

OPMERKING: Dit moet vlak voor de implantatie worden voltooid, die idealiter tussen dag 7 en 10 moet plaatsvinden. Zie notities aan het begin van stap 5 of 6 voor meer informatie over de implantatiedatum. Primaire eierstokkanker en blaaskanker werden geïmplanteerd als tumor stukken.

1. Ontdooi extracellulaire matrixoplossing op ijs. Verdun tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 2,7-4 mg/mL in een geschikt medium dat de gewenste groeifactoren of additieven bevat. Blijf op ijs.
   OPMERKING: Implantatie van tumorstukken gebruikt meestal het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van cellijnen van hetzelfde kankertype. Echter, aanpassingen aan de medium formulering kan worden gedaan indien nodig experimenteel. De effecten op tumorengraftment en groei zouden empirisch moeten worden bepaald.
2. Met behulp van een scalpel of schaar, accijns stukken van de verse tumor. Ideale maten variëren van 2-5 mm aan elke kant. Houd weefsels ondergedompeld in het medium tot ze klaar zijn om te implanteren.

5. Implantatie met behulp van een antiaanbakring (optie 1)

OPMERKING: Cellen kunnen worden geïmplanteerd vanaf ontwikkelingsdag 7 als de CAM volledig is ontwikkeld. Implantatie kan optreden op elk moment voorafgaand aan het uitkomen dat voldoende tijd voor tumorontwikkeling en het gewenste experiment mogelijk maakt, maar merk op dat het embryo immuuncellen beginnen aanwezig te zijn rond dag 10 postbevruchting²⁷. Tumor groei percentage varieert aanzienlijk per cel type en moet empirisch worden bepaald voor de cel type rente. De eierstokkanker en de prostaatkankercellen werden geïmplanteerd met behulp van de nonstick ring methode. Houd er rekening mee dat wanneer een antiaanstokring niet beschikbaar is, een pipettip kan worden gesneden op een vergelijkbare grootte en gebruikt.

1. Gebruik 70% ethanol om een bioveiligheidskast en alle benodigde gereedschappen te desinfecteren: een eierrek, gebogen iristangen, antiaanbakringen (1/4 inch binnendiameter), glazen roerstaaf, geschikte volumebuizen en -tips, 6 x 7 cm transparante foliedressing, kantoorschaar en marker of potlood. Waar mogelijk moeten steriele, wegwerp- of autoclaved-gereedschappen worden gebruikt.
2. Plaats eieren die op een eierrek moeten worden geïmplanteerd in een bioveiligheidskast. Selecteer een beheersbaar aantal eieren. Tot zes is typisch. Vermijd het toestaan van de eieren om aanzienlijk af te koelen tijdens het werken met hen.
3. Verwijder transparante filmdressing van de schaal door de randen naar het open raam te rollen om te voorkomen dat stukken shell wegtrekken. Controleer of de eieren levensvatbaar en gezond zijn. Ideale eieren hebben een groot vat in het midden van het geopende gebied met kleinere schepen vertakking van het.
4. Met behulp van gebogen iris tangen, plaats een steriele, nonstick ring op de CAM over het schip, idealiter over een tak punt. Gebruik een steriele glazen roerstaaf om de CAM voorzichtig te schuren.
5. Pipet de cel vering van stap 3.6 in het midden van de antiaanbakring. U ook tangen gebruiken om een tumorstuk van stap 4.2 in het midden van de nonstickring te plaatsen en te bedekken met 20-50 μL van de extracellulaire matrixoplossing gegenereerd in stap 4.1.
6. Sluit de opening af met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante filmdressing. Label de eieren met een passende implantaataanduiding.
   OPMERKING: Het nummeren van de eieren binnen een groep vergemakkelijkt longitudinale waarnemingen.
7. Breng het ei terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat de opening van de schaal rechtop zit en dat het ei veilig is.
   LET OP: Eieren kunnen zonder rotatie worden teruggebracht naar een eierbroedmachine. Als alternatief kan een hoge postimplant levensvatbaarheid worden verkregen met behulp van een 37-38 °C cel incubator met de CO₂ gedeactiveerd en een hygrometer om de luchtvochtigheid te controleren, die moet worden 50%-80%.

6. Implantatie zonder antiaanbakring (optie 2)

OPMERKING: Cellen kunnen worden geïmplanteerd vanaf ontwikkelingsdag 7 als de CAM volledig is ontwikkeld. Implantatie kan optreden op elk moment voorafgaand aan het uitkomen dat voldoende tijd voor tumorontwikkeling en het gewenste experiment mogelijk maakt, maar merk op dat het embryo immuuncellen beginnen aanwezig te zijn rond dag 10 postbevruchting²⁷. Deze methode werd gebruikt voor het implanteren van de niercel carcinoma cellen en de blaas kankercellen.

1. Gebruik 70% ethanol om een bioveiligheidskast en alle benodigde gereedschappen te desinfecteren: geschikte volumebuizen en -tips, steriele weefselkweekschotels van 10 cm, eirek, 6 x 7 cm transparante filmdressing, kantoorschaar en marker.
2. Aanzuigen een inentingsvolume van de celvering gegenereerd in stap 3.6 in een geschikt formaat pipet tip (200 μL is typisch). Terwijl u het bovenste gedeelte van de punt vasthoudt, werpt u de pipettip voorzichtig uit en plaats horizontaal in een steriele weefselkweekschaal van 10 cm.
3. Herhaal stap 6.2 voor alle monsters binnen een groep met één gerecht voor elke groep.
4. Plaats tips in een 37 °C incubator voor 15-30 min om de extracellulaire matrix gedeeltelijk te polymeriseren.
5. Na 15 min incubatie, beginnen met het controleren op polymerisatie. Een kleine hoeveelheid vloeistof lekt meestal uit de punt wanneer geplaatst op de schotel. Polymerisatie van deze vloeistof kan worden gebruikt om de omvang van de polymerisatie van de vloeistof in de tip te schatten.
6. Plaats de te implanteren eieren op een eierrek in een bioveiligheidskast. Selecteer een beheersbaar aantal eieren. Tot zes is typisch. Vermijd het toestaan van de eieren om aanzienlijk af te koelen tijdens het werken met hen.
7. Verwijder de transparante foliedressing van de schaal door de randen naar het open raam te rollen. Dit voorkomt het wegtrekken van stukken van shell.
8. Controleer of de eieren levensvatbaar en gezond zijn. Ideale eieren hebben een groot vat in het midden van het geopende gebied met kleinere schepen vertakking van het.
9. Plaats een pipet tip op een geschikt formaat pipet. Druk de zuiger om de gedeeltelijk gepolymeriseerde celvering op de CAM te dwingen over een groot, goed ontwikkeld vat, idealiter over een takpunt.
10. Sluit de opening af met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante filmdressing.
11. Label het ei met een passende implantaataanduiding.
    OPMERKING: Het nummeren van de eieren binnen een groep vergemakkelijkt longitudinale waarnemingen.
12. Breng het ei terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat de opening van de schaal rechtop zit en dat het ei veilig is.
    LET OP: Eieren kunnen zonder rotatie worden teruggebracht naar een speciale eierbroedmachine. Als alternatief kan een hoge postimplant levensvatbaarheid worden verkregen met behulp van een 37-38 °C cel incubator met de CO₂ gedeactiveerd en een hygrometer om de luchtvochtigheid te controleren, die moet worden 50%-80%.

7. Bioluminescentie beeldvorming van firefly luciferase gemarkeerde tumoren

OPMERKING: Als de geïmplanteerde cellen stabiel werden trans-transduced met het gen coderen firefly luciferase of andere beeldvormingfactoren, dan kunnen de resulterende tumoren worden gevisualiseerd met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Fluorescentie beeldvorming wordt niet aanbevolen op intacte eieren als gevolg van een hoge achtergrond van de eierschaal. Dit is endpoint analyse, als de opening van de shell drastisch vermindert de overleving. Tumoren kunnen worden afgebeeld op elk gewenst moment dat geschikt is voor experimentele behoeften en de snelheid van de tumorgroei. Echter, gemiddeld, eieren uitkomen 21 dagen postbevruchting. Daarom is ontwikkelingsdag 18 een geschikt eindpunt om ongewenst uitkomen te voorkomen.

1. Breng indien nodig eieren naar de beeldvormingsfaciliteit. Plak eieren op weefselkweekgerechten van 10 cm. Breng ze terug naar een eierbroedmachine van 37,8 °C (100 °F) met het rotatiemechanisme verwijderd of gedeactiveerd. Vochtigheid is niet cruciaal voor transport en beeldvorming.
2. Met behulp van gebogen iristangen duwt u de CAM voorzichtig weg van de schaal totdat de CAM gelijk is met het albumine en embryo. Met behulp van breed getipt eitje forceps, los stukken van de shell om de shell opening voldoende uit te breiden voor tumor visualisatie.
3. Injecteer minimaal 50 μL van 30 mg/mL D-luciferinin in het eialbumine. Een vergelijkbaar volume van D-luciferine kan ook worden gepipettttineerd in de antiaanbakring of op het oppervlak van de CAM in het gebied dat de geïmplanteerde cellen bevat. Dit zorgt voor een optimale bioluminescentie bij afwezigheid van een ideale vasculaire toevoer. Incubeer voor 8 min.
4. Injecteer 20-50 μL isoflurane in de albumine van het ei om het ei te verdoven. Incubeer voor nog eens 2 min. Als alternatief kan het ei worden geplaatst in een inductiekamer met 2-2,5% verdampte isoflurane. Adequate anesthesiediepte wordt verkregen wanneer embryonale beweging ophoudt.
   OPMERKING: Grotere hoeveelheden isoflurane (100 μL) kunnen worden gebruikt om het ei te euthanaseren.
5. Plaats eieren in een bioluminescentie-inrichting en -afbeelding met behulp van de juiste instellingen zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. Voor deze studie werd een blootstellingstijd van 1 min gebruikt.
6. Om de resterende CAM en embryo in beeld te brengen, opent u het ei in een weefselkweekschaal van 10 cm.
   1. Pak het ei met de vingers van beide handen aan de onderkant van het ei in de buurt van het midden van het ei en de duimen aan weerszijden van de shell opening.
   2. Trek voorzichtig de twee helften van het ei uit elkaar met de duimen terwijl u zachtjes met de vingers in het ei drukt.
   3. Wanneer de schaal ongeveer half gescheiden is van de CAM en het embryo, draai het ei ondersteboven over een weefselkweekschaal van 10 cm.
   4. Blijf de shell helften scheiden. Als de CAM aan de binnenkant van de schaal kleeft, gebruikt u de vingers voorzichtig om de CAM van de schaal weg te duwen.
   5. Het embryo kan indien gewenst in een andere schotel worden omgedraaid.
   6. Indien nodig kan aanvullende isoflurane worden toegediend als in stap 7.4.

8. Tumor oogsten

OPMERKING: Tumoren kunnen worden geoogst op elk moment dat geschikt is voor de experimentele behoeften en de snelheid van de tumorgroei. Echter, gemiddeld, eieren uitkomen 21 dagen postbevruchting. Daarom is ontwikkelingsdag 18 een geschikt eindpunt om ongewenst uitkomen te voorkomen.

1. Grijp tumor met tangen. Met behulp van een schaar (veer iris schaar goed werken) of een scalpel, zorgvuldig accijns tumor van CAM.
2. Als de tumor is trans-transduced met de firefly luciferase gen, reimaging kan worden uitgevoerd om succesvolle verwijdering van moeilijk te visualiseren tumoren te verifiëren.
   OPMERKING: Accijnstumoren kunnen worden geanalyseerd door elke methode die geschikt is voor een bepaald experiment. Tumoren kunnen ook opnieuw worden geïmplanteerd in CAM of muizen. Om de tumoridentiteit te bevestigen, kunnen tumoren worden gefixeerd, paraffine ingebed en onderzocht met hematoxyline en eosine of immunohistochemische vlekken.

Resultaten

Tot nu toe hebben we deze methode van implantatie succesvol gevonden voor eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Elk werd geoptimaliseerd om specifieke voorwaarden voor implantatie te identificeren, hoewel er flexibiliteit kan zijn. Van de geteste tumortypes was de groei van eierstokkanker veel minder uitgesproken en meestal niet zichtbaar zonder de hulp van bioluminescentiebeeldvorming(figuur 1). Echter, een versteviging van de CAM kan worden gevoe...

Discussie

Tumorexpansie en -engraftment met behulp van het CAM-model maakt een snellere en direct waarneembare tumorgroei mogelijk dan bestaande in vivo diermodellen. Bovendien zijn de kosten aanzienlijk lager zodra de eerste aankoop van apparatuur is voltooid, vooral in vergelijking met de kosten van immuungecompromitteerde muizen. De eerste, immuungecompromitteerde toestand van kippenembryo's maakt het gemakkelijk mogelijk engraftment van menselijk en murineweefsel. Zelfs met deze sterke punten heeft het CAM-model beperkingen. D...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring voor celzaaien. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluorethyleen (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Menselijke prostaatkankercellijn.
CWR22Rv1			CWR-cellen waren het vriendelijke geschenk van Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Gebaat bij een verdunning van 1:100 voor immunohistochemische analyse van menselijke ovariële CAM-tumoren.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke gekromde schaar zou ook werken.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	Deze kit bevat alle benodigde gereedschappen.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Er zou een lokale eierleverancier moeten worden geïdentificeerd, aangezien deze leverancier alleen regionaal levert.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Menselijke blaaskankercellijn.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Andere eier-incubators kunnen worden gebruikt, maar hun betrouwbaarheid zou moeten worden geverifieerd. Na implantatie kan ook een celincubator met de CO2 uitgeschakeld worden gebruikt.
ID8			Niet commercieel verkrijgbaar, zie alstublieft PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Andere kaarsen kunnen worden gebruikt; dit wordt echter geprefereerd onder degenen die we hebben getest. Deze kaars is opgenomen in de eerder genoemde incubatorkit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke gekromde pincet zou ook werken. Voor deze methode zijn meerdere merken gebruikt.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellulaire matrixoplossing
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Muis prostaatkankercellijn.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Elke soortgelijke pipetcontroller zou geschikt zijn.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke 18G naald zou op dezelfde manier werken.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke pincet of een andere stijl die past bij de voorkeur van de onderzoeker zou geschikt zijn.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Menselijke ovariële kankercellijn.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	Dit wordt als voorbeeld gegeven. De pincetten die worden gebruikt om de schaal voor bioluminiscentie-beeldvorming weg te trekken zijn ongeveer 12,8 cm lang met 3 mm brede uiteinden.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke steriele wattenbolletjes zijn voldoende.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke glazen roerstaaf zou ook werken.
T24	ATCC	HTB-4	Menselijke blaaskankercellijn.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke, steriele 10-cm schaal mag worden gebruikt. Weefselcultuurbehandeling is niet nodig.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	Dit wordt als voorbeeld gegeven. Elke soortgelijke buis zou ook werken.