Dit protocol demonstreert de nauwkeurige en reproduceerbare meting van het zuurstofverbruik in niet-humane primaat alvleesklier eilandjes. De laad technieken van het eilandje en de coating van de microplaat bieden een kader voor een efficiënte meting van de ademhaling in andere soorten gekweekte spheroids.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De meting van het zuurstofverbruik in spheroid-clusters van cellen, zoals ex-vivo pancreas eilandjes, is van oudsher een uitdaging geweest. We demonstreren de meting van het zuurstofverbruik op het eilandje met behulp van een 96-well microplaat die is ontworpen voor het meten van het zuurstofverbruik in spheroids. In deze test worden spheroid-microplaten op de dag voorafgaand aan de test gecoat met een cel-en weefsellijm. We gebruiken een kleine hoeveelheid lijm oplossing om de hechting van het eilandje aan te moedigen tot alleen de bodem van de put. Op de dag van de assay worden 15 eilandjes direct in de basis van elke put geladen met behulp van een techniek die zorgt voor een optimale positionering van eilandjes en een nauwkeurige meting van het zuurstofverbruik. Verschillende aspecten van de mitochondriale ademhaling zijn geprobed farmacologisch in niet-menselijke primaten eilandjes, met inbegrip van ATP-afhankelijke ademhaling, maximale ademhaling, en Proton lek. Deze methode maakt consistente, reproduceerbare resultaten mogelijk met slechts een klein aantal eilandjes per put. Het kan theoretisch worden toegepast op elke gekweekte sferoïden van vergelijkbare grootte.
Inleiding
Om de normale bloedglucosespiegels te handhaven, moet de cel alvleesklier β een verhoging in glucose voelen en insuline dienovereenkomstig afscheiden. De koppeling van insuline secretie met glucoseniveaus is direct gekoppeld aan glucose metabolisme en de productie van ATP via Mitochondriale oxidatieve fosforylering. Dus, mitochondriën spelen een cruciale rol in stimulus-secretie koppeling1. Beoordeling van β-cel mitochondriale functie kan defecten die leiden tot verminderde insuline secretie onthullen. De secretie van glucagon door pancreas α-cellen is ook nauw verbonden met de mitochondriale functie2. Hoewel vereeuwigd eilandje-cellijnen nuttig zijn gebleken voor sommige soorten assays, geeft de Fysiologie van deze cellen niet nauwkeurig de hele eiland functie weer, zoals geïllustreerd door de potentiëring van de insuline secretie door glucagon3,4 en de remming van de glucagonsecretie door insuline/Somatostatine5,6 in intacte eilandjes. Dit toont aan dat het zuurstofverbruik moet worden gemeten met behulp van hele, intacte eilandjes.
Technieken voor het meten van eilandje Cell respirometrie zijn geëvolueerd in de loop van de tijd, van het gebruik van zuurstof gevoelige fluorescerende kleurstoffen7 tot Solid-State sensoren die direct meten van het zuurstofverbruik8. In eerste instantie ontworpen voor monolayer, aanhandige cellen, veelgebruikte cel cultuur plaat systemen hebben bewezen ondoeltreffend te zijn voor pancreas eilandjes. Omdat eilandjes niet van nature aan de putjes hechten, zijn ze gevoelig voor geduwd naar de periferie van de cultuur, wat resulteert in onnauwkeurige meting van zuurstofverbruik9. Om dit probleem te bestrijden, gespecialiseerde 24-put platen met een centrale depressie die kon bevatten eilandjes werden ontwikkeld9. Het 24-goed plaat systeem werd echter beperkt door het grote aantal vereiste eilandjes (50-80 per put) en het aantal voorwaarden dat tegelijkertijd getest kon worden10. De recente ontwikkeling van 96-well microplaten speciaal ontworpen voor extracellulaire flux analyse in sferoïden heeft deze barrières overwonnen, waardoor de meting van het eilandje respirometrie met 20 of minder eilandjes per put10.
Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem voor het meten van het zuurstofverbruik in eilandjes van de Japanse makaak (Macaca fuscata), een diermodel met vergelijkbare eilandje-biologie voor mensen11,12. In dit protocol worden 15 makaak-eilandjes per put geanalyseerd. In onze handen, 15 eilandjes per goed geproduceerd hogere Baseline zuurstofverbruik dan minder eilandjes, met robuuste activering en onderdrukking van de ademhaling in reactie op de farmacologisch manipulatie. We benadrukken de stappen om voor te bereiden op de Assay, een effectieve methode voor het consistent laden van eilandjes in het midden van elke put, en gemeenschappelijke uitdagingen bij het uitvoeren van deze test.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van de microplaat en de sensor cartridge op de dag voorafgaand aan het uitvoeren van de test
Islets werden geïsoleerd van drie jaar oude Japanse makagen zoals eerder beschreven13. Deze methode is zeer vergelijkbaar met die gebruikt voor het isoleren van menselijke eilandjes van kadaver donoren, maar verschilt van muizen, waarin pancreata vaak worden opgeblazen met collagenase oplossing terwijl het dier onder sedatie en voorafgaand aan orgaanverwijdering. Het ophalen van een eilandje werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Oregon National Primate Research Center (ONPRC) en de Oregon Health and Science University en werden goedgekeurd door de ONPRC IACUC. De ONPRC houdt zich aan de dierenwelzijns wet en-regelgeving die wordt afgedwongen door het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA) en het beleid inzake de volksgezondheid inzake humane verzorging en het gebruik van proefdieren overeenkomstig de gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren die door de National Institutes of Health worden gepubliceerd.
- Bereiding van Spheroid-microplaat
- Bereid 3 mL van een 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing. Filter steriliseren de oplossing. We gebruikten een 0,45 μm filter (tabel van materialen).
- Voeg in een celkweek-kap 200 μL cel-en weefsellijm (tabel met materialen) toe aan 2,8 ml van 0,1 m natriumbicarbonaat. Voeg vervolgens 20 μL van deze oplossing toe aan de onderzijde van elke put van de 96-well spheroid-microplaat (tabel met materialen). Zorg ervoor dat luchtbellen uit de pipetpunt worden verwijderd en dat alleen de onderkant van de plaat bedekt is. Coating van de microplaat voorkomt dat eilandjes de zijkanten van de putjes omhoog bewegen wanneer geneesmiddelen worden toegevoegd en in de put worden gemengd tijdens de test.
Opmerking: het is alleen nodig om zoveel putjes te gebruiken als voor eilandjes wanneer de test wordt uitgevoerd. Als er slechts een paar putten zullen worden gebruikt, kan de cellijm oplossing op de juiste manier worden geschaald. De cellijm die in de test wordt gebruikt, is een samengestelde eiwit oplossing die uit de mariene mossel is geëxtraheerd. Als alternatief kunnen microplaat putten worden gecoat met 20 μL van 100 μg/mL poly-D-Lysine. - Incueren van de plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator gedurende één uur.
- In een steriele omgeving, aspiraat cel lijm oplossing van de plaat. Was elke put tweemaal met 400 μL 37 °C steriel water met behulp van een pipet met meerdere kanalen. Laat de lucht drogen.
- Bedek na 30-40 minuten de plaat en bewaar deze op 4 °C.
- Hydratatie van de sensor cartridge
- In een steriele omgeving, open het sensor cartridge pakket (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de gebruiks plaat.
- Vul elke put van het hulpstuk plaat met 200 μL steriel water en verlaag de sensor cartridge terug in de gebruiks plaat. Plaats geassembleerde sensor cartridge en hulp plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator 's nachts.
- Bereiding van Kalibrerende
- Aliquot 25 mL kalibrant (tabel van de materialen) in een conische buis van 50 ml. Plaats de buis in een 37 °C, niet-CO2 -incubator 's nachts.
2. protocol voor het voorbereiden van de media, het laden van eilandjes en het laden van de sensor cartridge op de dag van de test
- Voorbereiding van media
- Tot 48,5 mL basismedia (minimale DMEM, Zie tabel met materialen), voeg 500 μL toe van 1 mm natrium pyruvaat en 2 mm glutamine. Voeg bovendien 496 μL van 200 mg/ml glucose (uiteindelijke concentratie van glucose in de media is 5,5 mM).
Opmerking: Baseline glucoseconcentratie werd constant gehouden voor deze experimenten. Echter, glucose kan ook worden gebruikt om het stimuleren van de ademhaling naast de farmacologische manipulaties beschreven Blow10. - Bevestig dat de pH 7,4 +/-0,1 is, indien nodig aanpassen.
- Tot 48,5 mL basismedia (minimale DMEM, Zie tabel met materialen), voeg 500 μL toe van 1 mm natrium pyruvaat en 2 mm glutamine. Voeg bovendien 496 μL van 200 mg/ml glucose (uiteindelijke concentratie van glucose in de media is 5,5 mM).
- Voorbereiding van de sensor cartridge
- Neem sensor cartridge uit de incubator, verwijder het deksel van de sensor cartridge en stort water uit putten. Plaats 200 mL voorverwarmde kalibrant in elk goed en vervang het deksel van de sensor cartridge.
- Plaats de sensor cartridge ongeveer 1 uur terug in de incubator (totdat nodig).
- Bereiding van geneesmiddelen voor mitochondriale stress assay
- Open de stress testkit (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Make-up voorraad en werkoplossingen voor Oligomycine, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP), en Rotenone/Antimycine A (AA) als volgt.
- Oligomycine: Voeg 630 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun vervolgens tot 45 μM met media om de poort concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie na injectie is 4,5 μM)
- FCCP: Voeg 720 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun tot 10 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 1 μM)
Opmerking: BSA en/of FBS mogen niet worden toegevoegd aan media, omdat dit de werking van mitochondriale uncouplers kan beïnvloeden14. - Rotenone/AA: Voeg 540 μL geassembleerde media toe aan de buis om 50 μM voorraad te maken. Verdun tot 25 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 2,5 μM)
Opmerking: de bovenstaande concentraties hebben consistente resultaten in onze handen opgeleverd. Extra FCCP leidde tot geen verdere toename van de ademhaling. Echter, drugs concentraties moeten afhankelijk van de grootte van het eilandje worden aangepast, en vooral met eilandjes van verschillende soorten of niet-eilandje-spheroïden. Ter referentie, de gemiddelde diameter van een niet-menselijk primaten eilandje is ongeveer 150 μm15.
- Open de stress testkit (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Make-up voorraad en werkoplossingen voor Oligomycine, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP), en Rotenone/Antimycine A (AA) als volgt.
- Bereiding van spheroid-plaat en overdracht van eilandjes
- Hand-pick alvleesklier eilandjes in een celkweek schaal van 60 mm x 15 mm met geassembleerde media te verkrijgen in de buurt van 100% zuiverheid.
Opmerking: Islets moeten worden afgerond, met een duidelijk gedefinieerde omtrek, en lijken dichter dan exocriene weefsel contaminanten. Vermijd eilandjes die beschadigd of gerafeld lijken. In dit experiment werd de grootte van het eilandje niet direct gemeten, hoewel we probeerden om eilandjes van ongeveer dezelfde grootte voor elke put en sample te kiezen. - Laad elke put van spheroid-microplaat met 175 μL geassembleerde media met behulp van een multikanaalspipet.
- Gebruik een P20-pipet ingesteld op 15 μL, aspiraat 15 eilandjes van celkweek schotel. Islets moeten zichtbaar zijn in de pipetpunt tot het blote oog.
- Om eilandjes over te brengen naar spheroid-microplaat, verlaagt u de pipetpunt naar de onderkant van de put, gaat u nauwelijks omhoog en Pipetteer u langzaam een zeer klein volume (~ 5 μL). Bevestig dat alle eilandjes de pipetpunt hebben verlaten. Elk goed moet 15 eilandjes ontvangen. Controleer af en toe de spheroid-microplaat onder de Microscoop om te controleren of de eilandjes zich aan de onderkant van elk goed bevinden in plaats van vast te zitten aan de zijkanten.
Opmerking: Vermijd het laden van de hoek putten met eilandjes. Zuurstof en pH-flux uit het plastic kan optreden tijdens de bepaling, en dit wordt verergerd in de vierhoek putten. - Zodra alle eilandjes zijn overgebracht naar de spheroid-microplaat, incueren de microplaat in een incubator van 37 °c, niet-co2 , terwijl u de onderstaande stappen uitvoert.
- Hand-pick alvleesklier eilandjes in een celkweek schaal van 60 mm x 15 mm met geassembleerde media te verkrijgen in de buurt van 100% zuiverheid.
- Het laden van de sensor cartridge en het uitvoeren van de test
- Verwijder de sensor cartridge uit de incubator. Poorten A-C voor elke put moeten worden geladen met een van beide geneesmiddelen of media. Putten met eilandjes en de vierhoek putten moeten worden geladen met geneesmiddel. Niet-hoek putten zonder eilandjes moeten worden geladen met media. Poort D kan leeg worden gelaten. Laadpoort A (linksboven van elke sensor) met 20 μL oligomycine of media. Laadpoort B (rechtsboven) met 22 μL FCCP of media. Laadpoort C (linksonder) met 25 μL Rotenone/AA of media.
- Program meer een extracellulaire flux Analyzer test voor een ademhalings periode van 30 minuten Baseline (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 42 minuten oligomycine meetperiode (7 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 30 minuten FCCP (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), en 30 minuten Rotenone/AA (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat).
- Voer de test uit en volg de instructies op het scherm voor het kalibreren van de sensor en het plaatsen van de microplaat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om eilandjes in microplaat te laden, moeten 15 μL media worden aangezuigen, zoals weergegeven in Figuur 1A. Islets zullen zich binnen enkele seconden natuurlijk in de richting van de onderkant van de pipetpunt vestigen. Vervolgens wordt de pipetpunt naar de bodem van de put verlaagd. De punt is zeer licht opgeheven en een klein volume (ongeveer 5 μL) wordt samen met de eilandjes uitgelicht. Deze techniek resulteert in een consistente plaatsin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De studie van het zuurstofverbruik in het eiland is eerder belemmerd door de bolvormige vorm van eilandjes, hun gebrek aan naleving van cultuur oppervlakken en het aantal vereiste eilandjes per put. In dit protocol benadrukken we de werkzaamheid van de 96-well spheroid-microplaat voor het meten van het zuurstofverbruik op het eilandje op een klein aantal eilandjes en demonstreren we een techniek voor het hanteren en laden van eilandjes die technisch haalbaar is en consistente Resultaten.
Om te...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de Vanderbilt High throughput screening core voor het gebruik van hun faciliteiten, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) voor niet-menselijke primaten-eilandje-isolaties en Eric Donahue (Vanderbilt University) voor hulp bij figuur 1, erkennen. J.M.E. werd gesteund door NIGMS van de National Institutes of Health onder het awardnummer T32GM007347. M.G. werd gesteund door de NIH/NIDDK (R24DK090964-06) en het departement Veterans Affairs (BX003744).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | Voor glucose-oplossing, 200 mg/ml, sterieel gefilterd |
| Disposable reservoirs (sterieel), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | voor het laden van multikanaals pipet |
| EZFlow steriele 0,45 µm PES spuitfilter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multikanaals pipetpunten | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multikanaals pipet, 15-1250 µL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Aanbevolen |
| P20, P200 en P1000 pipetten | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH-sonde | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipetpunten, 20 µL, 200 µL, 1000 µL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Basismedium | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cel Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Bevat Oligomycine, FCCP en Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Inclusief voorbereidingsstation met 37 °C niet-CO2-incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroïde Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Bevat sensorcartridge, sferoïde microplaat en kalibrator |
| Natriumbicarbonaat | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Natriumpyruvaat | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereomicroscoop | Olympus | SZX9 | |
| Spuit (sterieel), 5 mL | BD | 309603 | Voor steriele filtratie |
| Water (sterieel) | Sigma | W3500-500mL |
Referenties
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420(1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139(2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023(2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Tags
Eilandjes van niet-menselijke primatenmeting van zuurstofverbruikspheroid microplate-assayanalyse van mitochondriale respiratieeilandjesadhesietechniekExtracellular Flux Analyzeroligomycine FCCP rotenonprotocol voor het zaaien van eilandjeshantering van primaire eilandjesbeoordeling van mitochondriale functie
