Methodenartikel

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proximity labeling (PL) technieken met behulp van engineered ascorbate peroxidase (APEX) of Escherichia coli biotine ligase BirA (bekend als BioID) zijn met succes gebruikt voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPR's) in zoogdiercellen. De eisen aan toxische waterstofperoxide (H2O2)in PL op basis van APEX, langere incubatietijd met biotine (16-24 uur) en een hogere incubatietemperatuur (37 °C) in PL op basis van bio-ID beperken hun toepassingen in planten ernstig. De onlangs beschreven TurboID-gebaseerde PL adressen vele beperkingen van BioID en APEX. TurboID maakt snelle nabijheid etikettering van eiwitten in slechts 10 min onder kamertemperatuur (RT) voorwaarden. Hoewel het nut van TurboID is aangetoond in diermodellen, hebben we onlangs aangetoond dat TurboID-gebaseerde PL beter presteert in planten in vergelijking met BioID voor het labelen van eiwitten die proximaal zijn voor een eiwit van belang. Hier is een stapsgewijs protocol voor de identificatie van eiwitinteractiepartners met behulp van het N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domein van de nucleotide-bindende leucine-rich repeat (NLR) eiwitfamilie als model. De methode beschrijft vectorbouw, agroinfiltratie van eiwitexpressieconstructies, biotinebehandeling, eiwitextractie en ontzouten, kwantificering en verrijking van de bioateulaateiwitten door affiniteitszuivering. Het hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere eiwitten die van belang zijn voor Nicotiana en andere plantensoorten te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPR's vormen de basis van verschillende cellulaire processen. Traditionele methoden voor het identificeren van PPR's omvatten gist-twee-hybride (Y2H) screening en immunoneerslag in combinatie met massaspectrometrie (IP-MS)1. Echter, beide lijden aan een aantal nadelen. Y2H-screening vereist bijvoorbeeld de beschikbaarheid van de Y2H-bibliotheek van de doelplanten- of diersoorten. De bouw van deze bibliotheken is arbeidsintensief en duur. Bovendien wordt de Y2H-benadering uitgevoerd in de heterologe eencellige eukaryotische organismengist, die mogelijk niet de cellulaire status van hogere eukaryotische cellen vertegenwoordigt.

Ip-MS laat daarentegen een lage efficiëntie zien bij het vastleggen van voorbijgaande of zwakke PPR's, en het is ook ongeschikt voor eiwitten met een lage overvloed of hoge hydrofobie. Veel belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de plant signalering trajecten zoals receptor-achtige kinases (RLKs) of de NLR familie van immuunreceptoren worden uitgedrukt op lage niveaus en vaak interageren met andere eiwitten tijdelijk. Daarom beperkt het sterk het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van deze eiwitten.

Onlangs zijn proximity labeling (PL) methoden op basis van engineered ascorbate peroxidase (APEX) en een mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekend als BioID) ontwikkeld en gebruikt voor de studie van PPR's2,3,4. Het principe van PL is dat een doeleiwit van belang wordt gefuseerd met een enzym, dat de vorming van labiel biotinyl-AMP (bio-AMP) katalyseert. Deze vrije bio-AMP worden vrijgegeven door PL enzymen en diffuus naar de nabijheid van het doeleiwit, waardoor de biotinylation van proximale eiwitten op de primaire amines binnen een geschatte straal van 10 nm5.

Deze aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele Y2H- en IP-MS-benaderingen, zoals de mogelijkheid om voorbijgaande of zwakke PPR's vast te leggen. Bovendien maakt PL het labelen van proximale eiwitten van het doeleiwit in hun eigen cellulaire omgevingen mogelijk. Verschillende PL enzymen hebben unieke nadelen bij het toepassen van hen op verschillende systemen. Hoewel APEX bijvoorbeeld hogere tagging kinetiek biedt in vergelijking met BioID en met succes wordt toegepast in zoogdiersystemen, maakt de eis van toxische waterstofperoxide (H2O2)in deze aanpak het ongeschikt voor PL-studies in planten.

BioID-gebaseerde PL vermijdt daarentegen het gebruik van de toxische H2O2, maar de etiketteringssnelheid is traag (waarbij 18-24 uur nodig is om biotinylation te voltooien), waardoor het vangen van voorbijgaande PPR's minder efficiënt wordt. Bovendien introduceert de hogere incubatietemperatuur (37 °C) die nodig is voor een efficiënte PL van BioID externe stress voor sommige organismen, zoals planten4. Daarom is een beperkte inzet van op BioID gebaseerde PL in planten (d.w.z. rijstprotoplasten, Arabidopsis en N. benthamiana) gemeld6,7,8,9. De onlangs beschreven TurboID enzym overwint de tekortkomingen van APEX en BioID-gebaseerde PL. TurboID toonde een hoge activiteit die de verwezenlijking van PL binnen 10 min op RT10mogelijk maakt. TurboID-gebaseerde PL is met succes toegepast in zoogdiercellen, vliegen en wormen10. Onlangs hebben wij en andere onderzoeksgroepen onafhankelijk geoptimaliseerd en uitgebreid het gebruik van TurboID-gebaseerde PL voor het bestuderen van PPR's in verschillende plantaardige systemen, waaronder N. benthamiana en Arabidopsis planten en tomatenharige wortels11,12,13,14. Vergelijkende analyses wezen uit dat TurboID beter presteert voor PL in fabrieken in vergelijking met BioID11,14. Het heeft ook aangetoond dat de robuustheid van TurboID-gebaseerde PL in planta door het identificeren van een aantal nieuwe interacties met een NLR immuunreceptor11, een eiwit waarvan de interactie partners zijn meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van traditionele methoden.

Dit protocol illustreert de op TurboID gebaseerde PL in planta door de identificatie van interactie-eiwitten van het N-terminal TIR-domein van de NLR-immuunreceptor in N. benthamiana-planten te beschrijven. De methode kan worden uitgebreid tot alle eiwitten die van belang zijn in N. benthamiana. Wat nog belangrijker is, het verstrekt een belangrijke verwijzing voor het onderzoeken van PPR's in andere installatiesoorten zoals Arabidopsis,tomaat, en anderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Een overzicht van de methode wordt weergegeven in figuur 1.

1. Materiaalbereiding van planten

  1. Kweek N. benthamiana zaden in natte grond met een hoge dichtheid en bewaar ze in een klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol/m2s) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23-25 °C.
  2. Ongeveer 1 week later, zorgvuldig overbrengen van elke jonge zaailing tot 4 'x 4' potten en houd de zaailingen in dezelfde kamer.
  3. Onderhoud de planten in de kamer voor ongeveer 4 weken totdat ze groeien tot een blad stadium van 4-8 voor de daaropvolgende agroinfiltratie15.

2. Bouw van TurboID-fusies

  1. Gebruik standaard moleculaire kloontechniek om fusie van het doeleiwit te genereren met TurboID (PCR TurboID van Addgene plasmid #107177). Hier gebruikten we de N-terminal TIR domein van de NLR immuunreceptor als het doel eiwit van belang en gebouwd TIR gesmolten tot TurboID onder de controle van Bloemkool mozaïek virus 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
    OPMERKING: De fusie van het TurboID-enzym aan het carboxyl-eindpunt of het amino-eindpunt van het doeleiwit is afhankelijk van het eiwit van belang. Meestal moeten voor een cytoplasma-eiwit beide termini aanvaardbaar zijn, zolang de TurboID-fusie de functie van het doeleiwit niet beïnvloedt. Echter, voor een membraan gelokaliseerd eiwit, de eiwittopologie moet worden gekenmerkt op voorhand voorafgaand aan de bepaling welke eindpunt is het beste voor TurboID fusie.
  2. Bouw een door TurboID gesmolten citroen onder dezelfde promotor om te dienen als controle voor latere kwantitatieve proteomische analyse.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een TurboID-besturingselement te construeren voor het identificeren van het proteoomproximale voor het doeleiwit. De TurboID-fusieregeling moet een expressieniveau vertonen dat vergelijkbaar is met dat van het door TurboID gefuseerde doeleiwit. Dit kan empirisch worden bepaald door het aanpassen van de Agrobacterium concentratie tijdens agroinfiltratie. Daarnaast is het belangrijk dat het controle-eiwit een subcellulair lokalisatiepatroon heeft dat vergelijkbaar is met dat van het doeleiwit van belang.

3. Agroinfiltratie

  1. Transformatie van de plasmiden naar Agrobacterium
    1. Voeg 0,5 μg van de plasmiden die zijn gegenereerd uit stappen 2.1 en 2.2 tot 50 μL Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 bevoegde cellen, bereid zoals eerder beschreven16.
      LET OP: Andere Agrobacterium stammen, zoals GV2260, kunnen ook worden gebruikt.
    2. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
    3. Hitteschok in een waterbad bij 42 °C voor 60 s.
    4. Voeg 400 μL LB-medium (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract en 10 g/L NaCl; pH = 7,0) toe aan de Agrobacterium en incubeer bij 28 °C gedurende 90 min.
    5. Verguld de volledige inhoud in de buis op LB agar aangevuld met geschikte antibiotica om de plasmide te selecteren, evenals voor de Agrobacterium (voor GV3101: 50 mg/L gentamicin en 50 mg/L rifampicin).
    6. Incubeerplaten bij 28 °C gedurende 36-48 uur tot individuele kolonies zichtbaar zijn.
  2. Pluk en streep verschillende afzonderlijke kolonies op een verse LB agar plaat met antibiotica (zie stap 3.1.5) en groeien bij 28 °C 's nachts.
    OPMERKING: Het is beter om de kolonie PCR uit te voeren om de aanwezigheid van de specifieke binaire constructie in de Agrobacteriumte bevestigen. In onze ervaring, meer dan 95% van de kolonies bevatten de geïntroduceerde binaire constructies.
  3. Inenting 3 mL lb medium plus passende antibiotica (zie stap 3.1.4) met Agrobacterium kolonie herbergen de constructie van belang, en incuberen door te schudden 's nachts bij 28 °C tot de OD600 van de Agrobacterium cultuur bereikt 2.0.
  4. Centrifugeer de cellen op 3.000 x g en stoer ze opnieuw tot OD600 = 1.0 in agroinfiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringon).
    OPMERKING: Hoewel het optimaal is om het intartikelum 2 uur lang bij RT voorafgaand aan agroinfiltratie uit te broeden, is er in onze ervaring met de GV3101-stam geen groot verschil tussen de doeleiwitexpressie met vs. zonder incubatie.
  5. Gebruik een 1 mL naaldloze spuit om het entmateriaal te infiltreren in de (abaxiale) opperhuid van de volledig volwassen N. benthamiana bladeren.
    OPMERKING: Om een voldoende hoeveelheid bladmaterialen voor te bereiden op drie biologische replicaties: een heel blad wordt meestal geïnfiltreerd, drie bladeren worden per plant geïnfiltreerd en voor elke constructie worden drie tot vier planten gebruikt. Voor elk blad is 1,5-2,0 mL geresuspendeerde agrobacteriën voldoende.
  6. Na 36 uur post-infiltratie (hpi), infiltreren 200 μM biotine (in 10 mM MgCl2 oplossing) in de bladeren vooraf geïnfiltreerd met TurboID constructies.
  7. Onderhoud de plant 3-12 uur extra voordat u het bladweefsel oogst zoals beschreven in punt 4.
    OPMERKING: De reden voor het kiezen van de 36 hpi voor biotine infiltratie is dat de beoogde eiwitexpressie pieken op dit moment volgens eerdere studies11. Het wordt aangeraden om de tijd te bepalen die nodig is voor een optimale expressie van het doeleiwit van belang. De incubatietijd na biotine infiltratie is afhankelijk van het experimentele ontwerp en het doeleiwit dat in studie wordt bestudeerd. Meestal, 3-12 uur van biotine behandeling maakt het labelen van de meeste eiwitten proximale aan het doeleiwit door de TurboID fusies.

4. Bladmonsterverzameling

OPMERKING: Draag voor de latere verwerking van de bladmonsters steriele handschoenen om keratinebesmetting van de monsters te voorkomen. Alle reagentia moeten ook zo keratinevrij mogelijk zijn.

  1. Snijd de geïnfiltreerd bladeren aan de basis van de petiole, verwijder de bladader, dan flash-freeze het bladweefsel in vloeibare stikstof.
  2. Maal het bladweefsel met behulp van een stamper en mortel en bewaar het bladpoeder in 15 mL of 50 mL valkbuizen bij -80 °C voor later gebruik.
    LET OP: Neem drie tot vier stukken bladeren voor elk van de drie biologische repliceert van verschillende planten. Het protocol kan hier worden onderbroken. Voorafgaand aan de volgende stappen wordt aanbevolen om eiwitexpressie en biotinylation van het doeleiwit te beoordelen aan de hand van immunoblot-analyses. Typische westerse vlekken worden weergegeven in figuur 2.

5. Extractie van bladtotaaleiwit

  1. Breng ongeveer 0,35 g bladpoeder over op een buis van 2 mL. Bereid twee buizen voor elk monster.
    LET OP: Draag handschoenen bij het aanraken van een voorwerp gekoeld door vloeibare stikstof.
  2. Voeg 700 μL RIPA lysisbuffer (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% natriumdeoxycholaat [w/v], 1 mM DTT, 1 tablet proteaserremcocktail) tot 0,35 g bladpoeder
  3. Draai de buizen 10 min.
  4. Laat de monsters 30 min op ijs staan.
  5. Meng de inhoud om de 4-5 min door de buizen meerdere keren ondersteboven te draaien.

6. Verwijdering van gratis biotine door ontzouten

LET OP: Deze sectie duurt ongeveer 50 min.

  1. Equilibrate de ontzouten kolom.
    1. Verwijder de sealer aan de onderkant van de ontzouten kolom en zet de kolom in een 50 mL buis.
    2. Verwijder de opslagoplossing door centrifugering bij 1000 x g en 4 °C gedurende 2 min en zorg ervoor dat de dop wordt losgemaakt.
    3. Doe de ontzouten kolom in een 50 mL buis. Equilibrate de kolom 3x met 5 mL ripa lysis buffer, elke keer centrifugeren op 1000 x g en 4 °C voor 2 min en het weggooien van de flowthrough.
    4. Breng de ontzouten kolom in een nieuwe 50 mL buis en bewaar tijdelijk bij 4 °C voor later gebruik.
  2. Draai de buizen van stap 5.4 bij 16.500 x g en 4 °C gedurende 10 min en breng de supernatant van de twee buizen over in een nieuwe 2 mL buis.
  3. Voeg 1.500 μL eiwitextract toe aan de bovenkant van de hars van de geëquilibrate desalting kolom (vanaf stap 6.1.4). Wanneer het eiwitextract in de hars komt, voegt u nog eens 100 μL RIPA lysisbuffer toe.
    OPMERKING: Hoewel 1.400 μL RIPA lysisbuffer werd gebruikt voor eiwitextractie uit de bladeren, werd het totale volume na eiwitextractie en ontzouten steevast tot op zekere hoogte verhoogd ten opzichte van het oorspronkelijke volume. Daarom kan een combinatie van de monsters van elke groep zoals beschreven in stappen 5.1 en 5.4 resulteren in ten minste 1.500 μL eiwitextract per monster.
  4. Centrifugeer bij 1000 x g en 4 °C gedurende 2 min en laat de gedezouten monsters tijdelijk op ijs staan.

7. Kwantificering van de gedezouten eiwitextracten met behulp van een Bradford-test

  1. Bereid 50 μL van elke gradiënt BSA-oplossing: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL en 1 mg/mL.
  2. Verdun het gedezouten eiwitextract door een 5 μL monster te mengen met 45 μL ddH2O.
  3. Bereid 1x Bradford regent door het verdunnen van de 5x Bradford regent (100 mg Coomassie briljante blauwe G250, 47 mL, 100 mL van 85% fosforzuur, 53 mL van methanol2O).
  4. Voeg 50 μL van de bsa-oplossing per verloop en 50 μL verdund eiwitextract toe aan de 2,5 mL van 1x Bradford regent.
  5. Incubeer bij RT voor 10 min.
  6. Voeg 200 μL oplossing van elk monster toe aan één put van een ELISA-plaat (drie technische replica's per monster).
  7. Meet de OD595 met behulp van een microplaatlezer.
  8. Teken de standaardcurve op basis van de waarde van de gradiënt BSA-oplossing en bereken de concentratie van de gedezouten eiwitmonsters. Meestal varieert de totale eiwitconcentratie verkregen uit 0,7 g bladeren van 3-6 mg/mL.
  9. Bereid 6-8 mg ontzout eiwitextract voor op latere affiniteitszuivering.

8. Verrijking van bioatlateeiwitten

  1. Neem 200 μL streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen in een buis van 2 mL.
  2. Equilibrate de streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen met 1 mL ripa lysis buffer voor 1 min bij RT.
  3. Gebruik na elke wasbeurt het magnetische rek om de kralen 3 min te adsorberen en verwijder de oplossing voorzichtig door te pipetteren.
  4. Herhaal stap 8.2 en 8.3.
  5. Breng het gedezouten eiwitextract over op de geequilibrate streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen.
  6. Incubeer de buis bij 4 °C gedurende 12 uur (of 's nachts) op een rotator om de biotinylated eiwitten te beschermen.
  7. Leg de kralen op een magnetisch rek gedurende 4 minuten bij RT tot de kralen verzamelen aan de ene kant van de buis, verwijder dan voorzichtig de supernatant door pipet.
  8. Voeg 1,7 mL wasbuffer I (2% SDS in water) toe aan de buis en houd deze 8 minuten op de rotator bij RT. Herhaal stap 8.3.
  9. Voeg 1,7 mL wasbuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic acid [w/v], 1% Triton X-100) toe aan de buis en houd het 8 min op de rotator bij RT. Herhaal stap 8.3.
  10. Voeg 1,7 mL wasbuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic acid [w/v], 1% NP40 [v/v]) toe aan de buis en bewaar het op de rotator bij RT gedurende 8 min. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3.
  11. Voeg 1,7 mL van 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) toe om het wasmiddel te verwijderen en herhaal stap 8.3.
  12. Breng de kralen naar een nieuwe buis van 1,5 mL en herhaal de stappen 8.11 en 8.3.
  13. Was de kralen 6x voor 5 min elk met 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer bij RT.
  14. Voeg 1 mL van 50 mM ammoniumbicarbonaatbuffer toe aan de magnetische kralen en meng goed.
  15. Verwijder 100 μL kralen voor immunoblotanalyse om de verrijking van bioateuze eiwitten te bevestigen. Een typische westelijke vlek wordt getoond in Figuur 3.
  16. Zet de rest van de eiwitmonsters in en wordt opgeslagen bij -80 °C of stuur ze onmiddellijk voor LC-MS/MS-analyse op droogijs.
    OPMERKING: Typische MS-resultaten worden weergegeven in een eerdere publicatie (Zhang et al. 2019; Figuur 2, Aanvullende gegevens 1 en aanvullende gegevens 2)11. De hele gegevenssets zijn beschikbaar op MassIVE (te vinden op ) met behulp van de id: MSV000083018 en MSV000083019.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De representatieve gegevens, die de verwachte resultaten op basis van het beschreven protocol illustreren, zijn aangepast van Zhang etal. 11. Figuur 1 vat de procedures voor het uitvoeren van TurboID-gebaseerde PL in N. benthamiana. Figuur 2 toont de eiwitexpressie en biotinylation in de geïnfiltreerd N. benthamiana bladeren. Figuur 3 toont aan dat de bioatlateeiwitten in de geïnfiltreerd bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De TurboID biotine ligase wordt gegenereerd door gist display-gebaseerde gerichte evolutie van de BioID10. Het heeft vele voordelen ten opzichte van andere PL enzymen. TurboID maakt de toepassing van PL op andere modelsystemen mogelijk, waaronder vliegen en wormen, waarvan de optimale groeitemperatuur ongeveer 25 °C10ligt. Hoewel de PL-aanpak op grote schaal is gebruikt in dierlijke systemen, is de toepassing ervan in planten beperkt. Het protocol dat hier wordt beschreven ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 tot Y.Z.), de National Natural Science Foundation of China (31872637 aan Y.Z.), en de Fundamental Research Funds voor de Centrale Universiteiten (2019TC028 aan Y.Z.), en NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 en NIH-GM132582-01 naar S.P.D.K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
721 SpectrophotometerMetash, gemaakt in ChinaQ/SXFZ6Voor OD600 meting
Ammonium bicarbonaatSigmaA6141-500G
BiotineSigmaB4639-1G50 mM Stock
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
DeoxycholzuurSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001Voor affiniteitszuivering
EDTASigmaE6758-500G
ELISA plaatCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Zoutzuur (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF membraanMilliporeIPVH00010Voor Western blot analyse
Lithium chloride oplossing (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Laagsnelheid gekoelde centrifugeZonkia, gemaakt in ChinaKDC-2046Voor desalting
Magnesium Chloride, Hexahydraat (MgCl2·6H2O)SigmaM9272-500G
Magnetische rekInvitrogen123.21DVoor bead adsorptie
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher ScientificN07710Voor OD595 meting
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rat anti-HARoche11867423001
Roterende mixerKylin-Bell Lab InstrumentWH-986Voor IP
Shock incubatorLabotery, gemaakt in ChinaZQPZ-228
Natriumchloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Natrium deoxycholaatSigmaD2510-100G
Natrium dodecylsulfaat (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidine-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubatorBlue pard, gemaakt in ChinaGHP-9080Voor Agrobacterium incubatie
Zeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89893Voor verwijdering van biotine

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864(2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TurboID nabijheidslabelingeiwit eiwitinteractiesNLR immunoreceptorenNicotiana benthamianaagroinfiltratieprotocolbiotinebhandelingstreptavidine verrijkingWestern blot analysemassaspectrometrieextractie van planteiwitten

Gerelateerde artikelen