Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Summary

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Abstract

Het bestuderen van meerdere post-translationele modificaties (PTMs) van eiwitten is een cruciale stap om PTM crosstalk te begrijpen en meer holistische inzichten te krijgen in de eiwitfunctie. Ondanks het belang van multi-PTM verrijking studies, weinig studies onderzoeken meer dan een PTM per keer, deels te wijten aan de kosten, tijd, en grote eiwithoeveelheden die nodig zijn om meerdere wereldwijde proteomische analyse van PTM's uit te voeren. De in dit protocol beschreven affiniteitsverrijking met één pot overwint deze barrières door de gelijktijdige identificatie en kwantificering van peptiden met lysineresiduen die acetylatie en succinylation PTM's met lage hoeveelheden monster bevatten, mogelijk te maken Input. Het protocol omvat de voorbereiding van eiwitlysaat uit muizenlevers van SIRT5 knock-out muizen, prestaties van trypsine spijsvertering, verrijking voor PTM's, en de prestaties van massaspectrometrische analyse met behulp van een data-onafhankelijke acquisitie (DIA) workflow. Omdat deze workflow het mogelijk maakt om twee PTM's uit hetzelfde monster tegelijkertijd te verrijken, biedt het een praktisch hulpmiddel om PTM-crosstalk te bestuderen zonder grote hoeveelheden monsters te vereisen, en het vermindert de tijd die nodig is voor de voorbereiding van monsters, gegevens acquisitie en analyse. De DIA-component van de workflow biedt uitgebreide PTM-specifieke informatie. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van PTM site lokalisatie, omdat DIA uitgebreide sets van fragmentionen biedt die computationeel kunnen worden ontcijferd om onderscheid te maken tussen verschillende PTM-lokalisatie-isovormen.

Introduction

Een groot aantal post-translationele wijzigingen reguleren dynamisch eiwitten en trajecten door effecten op de activiteit¹, signalering², en omzet^3,4. Eiwitkinasen worden bijvoorbeeld geactiveerd of gedeactiveerd door de toevoeging van fosfaatgroepen⁵, en histonacetylatie en andere wijzigingen bieden een mechanisme om de chromatinestructuur te veranderen en dienen als transcriptieregulerende mechanismen^6,7. In de afgelopen jaren is gebleken dat meerdere PTM's in overleg werken of concurreren om de eiwitfunctie of activiteit^8,9,10,11te reguleren . Daarom is het begrijpen van PTM crosstalk een opkomende behoefte in PTM-onderzoek. De meeste beschikbare proteomische workflows om PTM-sites te identificeren en te kwantificeren, richten zich echter op afzonderlijke wijzigingen, in plaats van het samenspel van meerdere wijzigingen. De beschreven workflow correleert specifieke eiwitmodificatie "hot-spots" en lysine residuen die worden gewijzigd door meerdere verschillende PTM's.

Er is een groeiende behoefte in de wetenschappelijke gemeenschap aan haalbare methoden om meerdere PTM's tegelijkertijd te bestuderen¹². De meeste methoden om de sites van meerdere soorten PTM's wereldwijd te identificeren en te kwantificeren zijn uitdagend vanwege de hoge kosten en hoeveelheid weefsel die nodig zijn^12,13. Niet alleen zijn multi-PTM verrijking experimenten tijdrovend in termen van monster voorbereiding, gegevensverwerving, en data-analyse, maar deze studies vereisen meestal grote en vaak onbetaalbaar hoeveelheden eiwit¹¹. Hier beschreven is een protocol voor gelijktijdige verrijking en analyse van meerdere PTM's, die ook een aantal van deze barrières aanpakt en grootschalige PTM-profilering mogelijk maakt en crosstalk tussen verschillende PTM's beoordeelt¹⁴. Deze one-pot workflow schetst een praktische manier voor biomedische onderzoekers om wereldwijd meerdere PTM's te profileren, gecoöpgemodificeerde peptiden te identificeren en PTM-crosstalk op een efficiënte en kosteneffectieve manier te bestuderen^14,15.

Hier wordt deze methode tentoongesteld door mitochondriale eiwitacytie te onderzoeken, die meer dan 50 jaar geleden voor het eerst werd^bestudeerd. Het concentreert zich specifiek op lysineacetylatie¹⁷ en succinylation¹⁸, met inbegrip van het medeoptreden van deze wijzigingen op eiwitten en zelfs co-modificatie op peptideniveau. Omdat de studie gebruik maakt van een knock-outmuismodel van Sirtuin 5 (SIRT5), is gekozen om zich te richten op de verrijking van acetylatie- en succinylation-locaties. Dit besluit is genomen omdat succinylation sites zijn het doelwit van SIRT5 desuccinylase en zal dus naar verwachting een aanzienlijke upregulation in KO muizen, waardoor ze de meest relevante PTM's in dit geval. Beide PTM's zijn biologisch relevant zoals onlangs samengevat door Carrico et al.¹⁹. In het algemeen vertoont acetylatie belangrijke effecten op genexpressie en metabolisme, en succinylation is gemeld om het metabolisme en functie²⁰te reguleren.

Het beschreven protocol kan worden uitgevoerd met een lage hoeveelheid eiwitinputmateriaal (bijvoorbeeld 1 mg eiwitlysaat) en vermindert de totale duur van het experiment door de tijd die wordt besteed aan monsterverwerking, MS-acquisitie en gegevensanalyse te verkorten. Er wordt een werkstroomschema opgegeven in figuur 1. We hebben ook nog lagere hoeveelheden uitgangsmateriaal gebruikt (tot 100 μg eiwitlysaat, waardoor de hoeveelheid kralen dienovereenkomstig wordt gebruikt), wat zoals verwacht de totale opbrengst van geïdentificeerde acylated peptiden vermindert; echter, het biedt nog steeds zeer waardevolle resultaten en kwantificeerbare acylated peptiden.

Hoewel zogenaamde top-down of middle-down workflows doorgaans geen proteolytische spijsverteringsbenaderingen gebruiken (en dus de connectiviteit van meerdere PTM's binnen één eiwit behouden), richt dit protocol zich op een op peptide-gebaseerde affiniteitsverrijkingsbenadering om extra diepte en gevoeligheid te krijgen voor PTM-identificatie en kwantificering(figuur 1). Bovendien maakt deze peptide-centric workflow gebruik van moderne massaspectrometriemethoden, waaronder 1) een combinatie van data-afhankelijke acquisitie (DDA) om spectrale bibliotheken te genereren, en 2) data-onafhankelijke acquisitie (DIA) voor nauwkeurige PTM-kwantificering in een labelvrije workflow.

DIA workflows overwinnen sampling stochasticiteit van typische DDA scan schema's door uitgebreid fragmenteren alle peptide signalen binnen de bemonsterde m / z bereik²¹. Deze functie is ook zeer gunstig in termen van site lokalisatie, omdat het gemakkelijker is om informatie te krijgen over welke specifieke fragment ionen worden gewijzigd binnen het peptide. Daarnaast maken DIA-workflows identificatie en kwantificering van kleine PTM-peptide-isovormen met identieke voorloper-ionen mogelijk. DIA-methoden kunnen ook een specifieke PTM-sitelokalisatie binnen een peptide bepalen op basis van specifieke overeenkomstige fragmentionen die te allen tijde uitvoerig worden gemeten. Dda-benaderingen maken echter vaak gebruik van "dynamische uitsluitingsfuncties" die meerdere steekproeven van MS/MS voor dezelfde voorloper-ion uitsluiten, waardoor kleine PTM-isovormen ontbreken.

De hier beschreven gelijktijdige verrijkingsstrategie is bij uitstek geschikt voor studies die zullen profiteren van de wereldwijde profilering en kwantificering van meerdere PTM's, het onderzoeken van PTM-crosstalk en het begrijpen van de dynamische interacties van posttranslationele wijzigingen. Identificatie van meerdere verrijkte PTM's in één gecombineerde workflow zijn beschreven door: wereldwijde, seriële of parallelle verrijking van PTM met proteolytische peptiden, of als alternatief door de analyse van intacte eiwitten. In vergelijking met seriële verrijking van acetylatie en succinylation werd vastgesteld dat de efficiëntie van de éénpotige methode zeer vergelijkbaar was^{met 14}. Deze alternatieve protocollen vereisen aanzienlijke hoeveelheden uitgangsmateriaal en tijd en kunnen onbetaalbaar zijn. Het one-pot protocol daarentegen biedt een goedkope en efficiënte methode voor de verrijking van meer dan één PTM met latere analyse en identificatie.

Muis leverweefsels worden verkregen uit SIRT5 knock-out muizen en worden hier gebruikt als uitgangsmateriaal. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd voor eiwitlysaten uit verschillende weefsels of celkweekexperimenten. Dit protocol kan worden toegepast op eiwitlysaten verkregen uit weefsels of celkweekpellets.

Protocol

Alle experimenten beschreven in het protocol volgen de richtlijnen van het Buck Institute Institutional Animal Research Committee.

1. Extractie van eiwitten uit gehomogeniseerd weefsel en vertering met protease

1. Bereid de lysisbuffer vers voor op een eindconcentratie van 8 M ureum, 50 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB), 1 μM trichostatin A (TSA), 20 mM nicotinamide, 75 mM natriumchloride (NaCl), 1x protease/fosphatase inhibitor cocktail (PIC) met HPLC-grade water.
2. Voeg een steriele stalen kraal toe aan een buis van 2 mL die compatibel is met een kraalmolenhomogenisator en plaats vervolgens het weefselstuk (erwtenformaat) in de buis. Voeg lysisbuffer (500 μL) en vortex kort toe om ervoor te zorgen dat de buffer het weefselstuk bedekt (voeg indien nodig meer lysisbuffer toe). Plaats buizen op voorgekoelde adaptersets, zodat de buizen in balans zijn tussen de twee adapters van de homogenisator.
3. Homogeniseer monsters 2x bij 25 Hz gedurende 3 min elk bij 4 °C. Als het weefsel niet volledig gehomogeniseerd is, draai de buizen kort en breng het gehomogeniseerde lysaat over in een vers gelabelde 1,5 mL buis. Voeg vervolgens extra lysisbuffer toe aan het resterende weefselstuk en herhaal de homogenisatie 2x bij 25 Hz gedurende 3 min per stuk. Twee rondes van homogenisatie zijn meestal voldoende om het weefsel te breken.
4. Verwijder de metalen kraal met een pincet. Spoel tussen elk monster de pincet opnieuw af met HPLC-grade water, HPLC-grade methanol en HPLC-grade water.
5. Combineer de gehomogeniseerde lysaten als twee rondes van homogenisatie werden toegepast en sonicate monsters met een ultrasoon gedurende 10 cycli op 30 s op/30 s uit en 4 °C op hoog vermogen.
6. Centrifugeer de gehomogeniseerde lysaten bij 14.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C om het lysaat te zuiveren. Breng de supernatant (gewist lysate) naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis, het vermijden van een vetlaag die kan zitten op de top van de supernatant en eventuele puin op de bodem van de buis.
7. Voer een bicinchoninisch zuur (BCA) test uit om de eiwitconcentratie van het gewiste lysaat te meten met een goede verdunning (bijvoorbeeld 1:20 en/of 1:200). Volgens bca resultaten, aliquot 1 mg eiwit uit elk monster.
8. Breng eiwitten in 4,5 mM dithiothreitol (DTT) bij 37 °C gedurende 30 min met agitatie bij 1.400 tpm. Vervolgens alkylaat eiwitten in 10 mM iodoacetamide (IAA) met incubatie in het donker (plaats in lade of kast) op kamertemperatuur (RT) voor 30 min.
   OPMERKING: Alternatieve reagentia kunnen worden gebruikt, zoals N-ethylmaleimide (NEM) in plaats van IAA.
9. Voeg 50 mM TEAB toe aan de monsters om de ureeconcentratie te verdunnen tot minder dan 2 M. Spot 1 μL van het monster op een pH-papier om ervoor te zorgen dat de pH van het verdunde monster tussen 7,0-8,5 ligt. Voeg trypsine toe aan elk monster met een verhouding van 1:50 (trypsine-eiwit, wt/wt) en verteer het eiwit met agitatie bij 37 °C 's nachts (ongeveer 14-16 uur).
10. Blus de digesten met 10% mierenzuur om de volgende dag 1% mierenzuur te bereiken. Vortex en draai kort. Spot 1 μL van het monster op pH-strips om ervoor te zorgen dat de samenvatting pH = 2-3 is. Centrifugemonsters bij 1.800 x g gedurende 15 min bij RT om onoplosbaar materiaal te pelleteren.

2. Ontzouten van niet-verrijkte proteolytische peptiden via grootschalige winning van vaste fase

1. Verkrijg cartridges met C18-hars die tot 10 mg eiwit kunnen binden. Plaats deze cartridges in een vacuümapparaat om vacuümzuiging te gebruiken die de vloeistof tijdens elk van de volgende stappen door de cartridge kan trekken. Wijs één cartridge aan voor elk peptidemonster.
2. Voeg 800 μL van 80% acetonitril (ACN) in 0,2% mierenzuur toe aan cartridges met 19,8% water en gebruik vacuümzuiging om de vloeistof erdoor te trekken. Herhaal deze stap 1x, het vermijden van het drogen van de cartridges volledig.
3. Equilibrate cartridges door 800 μL van 0,2% mierenzuur in water met vacuümzuiging toe te voegen om het volledige volume door het filter te trekken. Herhaal dit 2x. Laad peptiden op de cartridges met vacuümzuiging. Was peptiden 2x met 800 μL van 0,2% mierenzuur in water onder vacuümzuiging.
4. Schik 1,5 mL microcentrifuge buizen onder elke cartridge om peptide eluting te verzamelen in de laatste stap. Onder vacuümzuiging elute peptiden uit cartridges, eerst met 800 μL van 80% ACN in 0,2% mierenzuur en 19,8% water, dan met 400 μL van dezelfde oplossing. Droog de ontzouten peptidemonsters volledig in een vacuümconcentrator (2-3 uur).

3. Gelijktijdige verrijking van K-geacetyleerde en K-succinylated peptiden met immunoaffinity kralen

1. Resuspend de gedroogde peptiden in 1,4 mL koude 1x immuno-affinity zuivering (IAP) buffer. Vortex om te mengen en zorgen voor een pH van ~ 7. Centrifugemonsters bij 10.000 x g voor 10 min bij 4 °C. Een kleine pellet kan verschijnen.
2. Zet peptiden opzij op ijs tijdens de voorbereiding van antilichaam-kralen. Voeg aan een buis k-acetyl en buis k-succinyl antilichaamdrijfmest (volume: 100 μL drijfmest per buis) 1 mL koude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en meng door ppetters. Breng de hele oplossing over op een nieuwe 1,5 mL buis en draai in een miniatuurcentrifuge voor 30 s bij RT.
3. Aanzuigen van de PBS, zorg ervoor dat het aspirating uit alle kralen. Herhaal de was 3x door opnieuw te wassen met 1 mL koude 1x PBS, centrifugeren voor 30 s bij RT en het aspirating off de PBS.
4. Hang de kralen opnieuw op in ongeveer 440 μL PBS. Een kwart van het aantal kralen in elke PTM-buis (100 μL, verstrekt door de fabrikant) wordt gebruikt voor de verrijking van één pot (ongeveer 62,5 μg van elk geïmmobiliseerd antilichaam voor zowel K-acetyl als K-succinyl antilichaamkralen). Pipetteer de kralen meerdere malen om goed te mengen. Verwijder 100 μL acetyl-lysine antilichaamkralen en breng over in één buis met 200 μL voorgesneden tips, zodat de mastermix consistent goed gemengd blijft.
5. Doe hetzelfde met de succinyl-lysine antilichaam kralen door het verwijderen van 100 μL van succinyl-lysine antilichaam kralen aan de buis om gelijke delen van de acetyl-lysine antilichaam en succinyl-lysine antilichaam in elke buis te bereiken. Draai 30 s in een miniatuurcentrifuge en zuig media aan met gelladerpunt (kralen worden wit).
   LET OP: Elke buis moet een soortgelijke kraal pellet aan de onderkant.
6. Pipeter het opnieuw opgehangen peptide direct op de gewassen kralen. Wees voorzichtig om pellets te vermijden (voeg snel toe om te voorkomen dat de kralen uitdrogen). Incubeer de peptiden met kralen bij 4 °C 's nachts met agitatie.

4. Elutie van de peptiden gebonden aan antilichaamkralen

1. Draai de peptidemonsters op 2.000 x g voor 30 s bij 4 °C. Verwijder de supernatant met ongebonden peptiden en sla op voor toekomstige experimenten indien gewenst. Voeg 1 mL koude 1x IAP buffer toe aan de kralen om te wassen en te mengen door 5x om te keren. Draai op 2.000 x g voor 30 s bij 4 °C. Aanzuigen uit de IAP oplossing en herhaal de IAP wassen stap 1x voor een totaal van twee wasbeurten.
2. Voeg 1 mL koud HPLC-water toe aan de kralen en meng door 5x om te keren. Draai op 2.000 x g voor 30 s bij 4 °C. Aanzuigen uit het water. Herhaal de waterwasstap twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. Draai een extra tijd op 2.000 x g voor 30 s bij 4 °C om het resterende water in de bodem van de buis te verzamelen. Aanzuigen van alle extra water dat kan hebben verzameld met flat-tipped gel laden tips. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het aspirating van de kralen.
3. Voeg 55 μL van 0,15% trifluoroacezuur in water toe aan de kralen. Incubeer de kralen voor 10 min bij RT, terwijl af en toe tikken op de onderkant van de buis te mengen. Draai de kralen bij RT voor 30 s in een miniatuur centrifuge. Verwijder de geëualste peptiden en zet apart met behulp van een flat-tip voor het laden van gel.
4. Voeg 45 μL van 0,15% trifluoroacezuur in water toe aan de kralen. Incubeer gedurende 10 min bij RT terwijl u af en toe op de onderkant van de buis tikt om te mengen. Draai de kralen bij RT voor 30 s in een miniatuur centrifuge. Verwijder de tweede elutie met behulp van een flat-tip met een punt gel-loading en combineer met de eerste elutie.
5. Draai de gecombineerde geëxueerde peptiden op 12.000 x g voor 5 min bij RT om eventuele kralen die over te dragen pellet. Breng de monsteroplossing van peptiden over in een nieuwe buis van 500 μL.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

5. Ontzouten van verrijkte peptiden

OPMERKING: De pH van de monsters moet minder dan 4 zijn voor een optimale binding aan de punt met C18-hars. Gebruik een pipettip van 10 μL met 0,6 μL C18-hars en een pipet van 10 μL om de punt te bedienen.

1. Maak de C18-tip vooraf nat door 10 μL acetonitril in de punt te belanden. Giet acetonitril uit in afval. Herhaal deze stap nog twee keer.
2. Equilibrate de tip door 3x wassen met 10 μL van 0,2% mierenzuur in water. Giet de oplossing na elke evenwicht in afval.
3. Laad peptiden uit het monster op de tip door continu te besmeifen en verrijkt peptidemonster met de tip uit te delen. Pipetteer herhaaldelijk minstens 20x op en neer en doseer de resterende oplossing uit de punt.
4. Was de tip met gebonden peptide met 10 μL van 0,2% mierenzuur in water. Doseer oplossing in afval. Herhaal deze stap 9x.
5. Elute peptiden in een nieuwe buis met behulp van 10 μL van een elutiebuffer met 0,2% mierenzuur, 50% acetonitril en 49,8% water. Herhaaldelijk pipeten en de 10 μL oplossing in de nieuwe buis 15x. Herhaal deze stap met een extra 10 μL elutiebuffer, herhaaldelijk pipetteren in dezelfde buis als de vorige elutie.
6. Droge peptiden volledig in vacuümconcentrator (ongeveer 20 min). Resuspend de gedroogde peptiden in de juiste volume van 0,2% mierenzuur in water.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

6. Gegevensverwerving met BEHULP van DDA en DIA

OPMERKING: Analyseer de monsters met DDA- en DIA LC-MS/MS-methoden, die kunnen worden aangepast afhankelijk van het beschikbare massaspectrometrische instrument. Hier werden de monsters geanalyseerd met behulp van een nano-LC 2D HPLC-systeem gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometer.

1. Gebruik een HPLC-systeem in combinatie met een chipgebaseerd hplc-systeem dat rechtstreeks is aangesloten op een massaspectrometer (veel LC-MS-configuraties en -systemen kunnen ook worden gebruikt).
2. Analyse van monsters met reverse-phase HPLC-ESI-MS/MS
   1. Breng na injectie de peptidemengsels over op een C18 pre-kolomchip en ontzouten de peptiden door te wassen met mobiele fase A bij 2 μL/min gedurende 10 min. Breng vervolgens de peptiden over naar een analytische kolom en elute met een stroomsnelheid van 300 nL/min met een 2-3 uur helling met behulp van mobiele fasen A en B. Gebruik specifiek een lineaire gradiënt van 5% mobiele fase B naar 35% mobiele fase B over 80 min.
   2. Vervolgens, helling de mobiele fase B tot 80% meer dan 5 min, dan houden op 80% B voor 8 min alvorens terug te keren naar 5% B voor een 25 min re-equilibration.
3. Bouw een MS-instrumentmethode voor DDA en definieer de volgende instrumentscan-experimenten
   1. Experiment 1: MS1 voorloper ionenscan van m/z 400-1.500 (accumulatietijd van 250 ms). Stel de intensiteitsdrempel in om MS/MS-scans te activeren voor ionen van laadtoestanden van 2-5 tot 200 tellingen. Stel de dynamische uitsluiting van voorloper-ionen in op 60 s.
   2. Experiment 2: MS/MS productionenscan met een MS2-scan variëren van m/z 100-1.500 (accumulatietijd van 100 ms per elke 30-product ionencan per cyclus). Stel de botsingsenergiespread in op CES = 5 en selecteer vervolgens de "high sensitivity product ion scan mode".
      OPMERKING: De DDA-methode zal MS / MS spectra te verwerven voor de 30 meest voorkomende voorloper ionen na elke enquête MS1 scan per cyclus, en de totale cyclus tijd zal worden ~ 3.3 s. DDA overnames zullen worden gebruikt om spectrale bibliotheken te bouwen zoals beschreven in sectie 7.
4. Het bouwen van een MS-instrumentmethode voor DIA en het definiëren van de volgende instrumentscanexperimenten.
   1. Experiment 1: voer MS1 voorloper-ionenscan uit van m/z 400-1.250 (accumulatietijd van 250 ms).
   2. Experiment 2: voer MS/MS-productionenscans uit voor 64 variabele SWATH-segmenten met een MS2-scanbereik van m/z 100-1.500 (accumulatietijd van 45 ms per 64-productionscan per cyclus). Stel de botsingsenergiespread in op CES = 10 en selecteer vervolgens de "high sensitivity product ion scan mode".
   3. Gebruik de 64 variabele venster DIA / SWATH acquisitie strategie zoals beschreven door Schilling et al.²² om label-vrije kwantificering te verkrijgen met een totale cyclus tijd van ~ 3.2 s. Kortom, in deze overname, in plaats van de Q1 quadrupole die een smal massabereik doorgeeft naar de botscel, wordt een breder venster van variabele vensterbreedte (5 -90 m/z) doorgegeven in incrementele stappen over het volledige massabereik (m/z 400 -1.250 met 64 SWATH-segmenten, elk met een accumulatietijd van 45 ms, wat een cyclustijd van 3,2 s oplevert, waaronder één MS1-scan met een accumulatietijd van 250 ms).
      OPMERKING: De variabele vensterbreedte wordt aangepast aan de complexiteit van de typische MS1-ionstroom die binnen een bepaald m/z-bereik wordt waargenomen met behulp van een variabel vensterrekenmachinealgoritme²² (meer smalle vensters worden gekozen in "drukke" m/z-reeksen, brede vensters in m/z-reeksen met weinig eluting voorloperionen). Op andere MS-instrumentplatforms kunnen andere DIA-vensterstrategieën worden geïmplementeerd.

7. Gegevensanalyse

OPMERKING: Sommige instellingen voor gegevensanalyse moeten worden gewijzigd en afgestemd op het specifieke experiment. De geselecteerde eiwitdatabase (FASTA-bestand) is bijvoorbeeld afhankelijk van de soort waaruit het monster is bereid (hier Mus musculus). Hieronder wordt de gegevensanalyse voor muizenmonsters die zijn verrijkt met acetylated en succinylated peptiden beschreven.

1. Gebruik een MS-databasezoekmachine om DDA-acquisities te analyseren. Maak als volgt een methode voor de zoekmachine voor een database:
   1. Voor voorbeeldbeschrijvingsparameters: selecteer "Identificatie" onder voorbeeldtype, selecteer "Iodoacetic Acid" onder "Cysteine Alkylation", selecteer "Trypsin" onder "Digestie" (uitgaande van C-terminal decolleté bij lysine en arginine), selecteer "TripleTOF 6600" onder Instrument, onder speciale factoren, controleer acetylatienadruk en succinylation verrijking, en selecteer Musculus onder Soorten.
   2. Selecteer " Biologische modificaties " onder ID Focus "Biologische modificaties" onder ID Focus , selecteer "SwissProt" onder Database , de optie" Thorough ID" onder Zoekinspanning, selecteer "0,05 (10%)" onder "Gedetecteerde eiwitdrempel" en controleer "Run False Discovery Rate Analysis" onder "Resultatenkwaliteit". Sla de zoekmachinemethode op en dien de massaspectrometrische raw-bestanden in voor verwerking door de databasezoekmachine met behulp van de gegenereerde methode.
      OPMERKING: In een iteratief proces worden alle MS- en MS/MS-scans automatisch opnieuw gekalibreerd door de zoekmachine op basis van initiële annotaties en resultaten.
2. Klik op "Samenvatting van het Peptide exporteren" na voltooiing van de zoekopdracht en filter alle peptide-identificatieresultaten op een "betrouwbaarheidsdrempel" van 99 in een spreadsheetsoftware (bijvoorbeeld Excel; false discovery rate [FDR] van 1%).
3. Filter in het spreadsheetbestand "Peptide Summary" voor alle peptiden die de PTM-annotatie "acetylatie" en "succinylation" bevatten in de wijzigingskolom om een resultatenrapport te genereren om uitsluitend de acylated peptiden en hun bijbehorende eiwitten te presenteren.
4. Open de DIA Quantitative Analysis Software om ms/ms spectrale bibliotheken te bouwen voor verdere verwerking van het RAW-bestand DIA en verdere relatieve kwantificering. Selecteer het tabbladBibliotheeken klik vervolgens (onderaan de pagina) op " SpectralLibrary genereren" in " DatabaseSearch Engine" en open een FDR-rapport van de databasezoekmachine (het *FDR.xlsx-bestand), dat automatisch werd gegenereerd als onderdeel van het DDA raw-bestandsdatabasezoekproces. Klik vervolgens op 'volgende' en selecteer het' LibrarySettings Schema' en "volgende" . Selecteer "Uniprot_mouse_proteome" als de database en klik vervolgens op "volgende" en "goa_mouse" als het genannotatie (ontologie) bestand. Klik ten slotte op "afwerking", en de spectrale bibliotheek wordt gegenereerd.
   OPMERKING: Informatie over de geacetyleerde en sappige peptiden uit raw databestanden van het DDA, voorloperionscans van MS1 en fragmentionscans van MS2 zal worden opgenomen in de spectrale bibliotheken (dit omvat retentietijd, MS/MS fragmentatiepatroon, enz.).
5. Gebruik DIA kwantitatieve proteomics analysesoftware om relatieve kwantificering van acetylatie- en succinylation-niveaus uit te voeren en spreadsheets te maken van kandidaat PTM-bevattende peptiden die kunnen worden gebruikt voor verdere gegevensanalyse.
   1. Als u PTM-bevattende peptiden wilt analyseren en kwantificeren, opent u de DIA Quantitative Analysis Software, gebruik het sjabloonanalyseschema. Het sjabloonschema is beschikbaar in de software door de optie "Instellingenperspectief" te selecteren | "DIA-analyse" | "BGS PTM's" (significant of schaars, afhankelijk van het experiment).
      OPMERKING: In plaats van de BGS PTM-analysesjabloon in de DIA Quantitative Analysis Software te gebruiken, kunnen alle PTM-specifieke instellingen ook handmatig worden ingesteld volgens deze instructies: 1) onder "identificatie", selecteer "PTM lokalisatie" (waarschijnlijkheidscuter = 0,75); 2) in "kwantificering", selecteer "minor peptide grouping" | "gewijzigde volgorde"; en 3) in het kader van "post-analyse", selecteer "differentiële overvloedgroepering" | "kleine groep" (kwantificeringsinstellingen). Deze instellingen activeren de PTM lokalisatiefunctie, zodat gewijzigde peptiden worden vermeld als afzonderlijke vermeldingen en differentiële analyse worden uitgevoerd op peptideniveau.
   2. Als u de kwantificeringsanalyse wilt starten, selecteert u het tabblad " Pijplijn "Pijplijn"Een DIA-analyse instellen vanuit bestand", open de RAW-bestanden van MS DIA die van belang zijn voor relatieve kwantificering. Selecteer 'Spectrale bibliotheek toewijzen' en selecteer de bibliotheek die hierboven is gebouwd, klik op' load' | "volgende". Selecteer het "BGS PTMs "analyseschema en klik op "volgende". Selecteer het juiste fasta-bestand voor de database "Uniprot_mouse_proteome" | "volgende". Definieer de voorwaardeset-up, die de verschillende voorwaarden aan de monsters toewijst en klik op "volgende". Selecteer "goa_mouse" als het genannotatie (ontologie) bestand en klik op "volgende". Bekijk het analyseoverzicht (samenvatting van de experimentset-up) en selecteer "uitvoermap" | "afwerking". Klik ten slotte op" Run Pipeline" om de labelvrije kwantitatieve analyse uit te voeren.
      OPMERKING: Statistische modules in de DIA Quantitative Analysis Software voeren automatisch FDR-analyse uit, genereren warmtekaarten en vulkaanplots die de verschillende omstandigheden vergelijken, lijsten genereren van geïdentificeerde en gekwantificeerde peptiden en eiwitten, en bieden Q-waarden samen met relatieve vouwwijzigingen die verschillende voorwaarden vergelijken.
6. Als alternatief, gebruik software voor interferentie verwijdering van DIA datasets voor de verwerking van gegevens en het uitvoeren van statistische analyse na de export van de geëxtraheerde piekgebieden voor acetylatie en succinylation sites.

8. Datavisualisatie van gemodificeerde peptiden en beoordeling van ptm-sitelokalisatie

1. Als u een gegenereerde DIA Quantitative Analysis wilt openen, selecteert u het tabblad" Analyse", gevolgd door " laadhet kwantitatieve Analysis Software Experiment" (van een opgeslagen experiment dat een *. SNE-bestand). Navigeer naar de *. SNE resultaten bestand en selecteer "openen".
2. Klik in het linkerdeelvenster op de pijl links van de derde raw data *.wiff-bestand van bovenaf om alle 64 SWATH-segmenten uit te vouwen en te visualiseren. Klik op de pijl links van het segment [428.7-437.3] om het specifieke segment uit te breiden en de gewijzigde peptiden weer te geven die voor dit massabereik zijn geïdentificeerd. Klik op het triply charged peptide KQYGEAFEK[Acetyl]R.
   OPMERKING: Standaard geeft het rechter bovenste paneel doorgaans de MS2 XIC weer en in het onderste paneel wordt MS1 Isotope Envelope XIC weergegeven
   1. Selecteer in het bovenste deelvenster "PTM-lokalisatieplot". Selecteer in het onderste deelvenster "PTM-lokalisatieplot".
   2. Selecteer in de PTM Localization Plot de bovenste peptidesequentie "KQYGEAFEK[Acetyl]R", met een totale PTM lokalisatiescore van 18,32. Klik op de pijl aan de linkerkant om de weergave uit te breiden en de bevestigende en weerleggende ionen te visualiseren. Klik op de pijl naast de "Confirming Ionen", selecteer vervolgens de ionen "y3 [+42]" om die specifieke ionen te markeren, wat bevestigt dat de acetylatiesite zich op K2 van de peptidesequentie bevindt.
   3. Selecteer in de PTM Localization Plot de tweede peptidesequentie "K[Acetyl]QYGEAFEKR" met een totale (zeer lage) PTM lokalisatiescore van 1. Klik op de pijl aan de linkerkant om de weergave uit te breiden en de bevestigende en weerleggende ionen te visualiseren. Klik op de pijl naast de "Confirming Ionen", en vervolgens op de pijl naast de "Weerleggenionen", selecteer vervolgens enkele fragmentionen om het geëxtraheerde ionenchromatogram en MS/MS-spectra(figuur 5) te visualiseren en te beoordelen.
      OPMERKING: De toegewezen PTM-lokalisatiescore en visuele inspectie geven aan dat de juiste PTM-isomer KQYGEAFEK[Acetyl]R is, terwijl er geen of minimaal bewijs bestaat voor de andere mogelijke PTM-isomer K[Acetyl]QYGEAFEKR.

Results

Figuur 1 toont een algemeen diagram van de workflow, inclusief het oogsten van het weefsel van muislevers, met behulp van 1 mg eiwit voor het verteren van het eiwitlysaat met trypsine, het uitbroeden van peptiden met antilichaamgeconjugeerde kralen, het verkrijgen van de monsters op de MS en ten slotte het uitvoeren van DIA/SWATH-analyse van de gegevens met behulp van verschillende kwantitatieve proteomics-softwarepakketten (academisch en commercieel).

Figuur 2A laat zien hoe de tijdlijn van de workflow en de benodigde hoeveelheden monster en eiwit, vergeleken met alternatieve methoden die momenteel worden gebruikt voor verrijkingsstudies met meerdere PTM's. De one-pot methode kan worden uitgevoerd in de helft van zoveel tijd en met de helft van het aantal monsters als deze alternatieve methoden. In vergelijking met de twee single-PTM verrijkingsmethode vereist het one-pot protocol ook de helft van de hoeveelheid eiwit.

Dit protocol is een haalbaar en kosteneffectief alternatief gebleken. Figuur 2B toont aan dat de mediane variatiecoëfficiënt (CV) voor gemodificeerde peptidegebieden lager was in de éénpotige methode dan bij de single-PTM- en seriële PTM-verrijkingen. Figuur 2C,D toont aan dat, hoewel de éénpotige PTM- en single-PTM-verrijkingsmethoden werden vergeleken, er geen noemenswaardige verschillen zichtbaar waren tussen de correlaties van kwantificeringen op locatieniveau voor de twee wijzigingen. Dit gold ook voor de peptide-niveau en fragment-niveau correlaties. Dezelfde constatering voor alle drie de correlaties bij het vergelijken van de verrijkingen van één pot en seriële PTM. Alle onderliggende gegevens over de gegevens van MS en verwerkte Excel-resultatenbladen die zijn gekoppeld aan een recent rapport van Basisty et al.¹⁴ zijn beschikbaar en kunnen worden gedownload van MassIVE (MSV00081906) en ProteomeXchange (PXD008640).

Hoewel strategieën voor de verrijking van antilichamen in het algemeen bepaalde beperkingen kunnen vertonen, zoals potentiële epitoopocclusie of beperkte specificiteit, zijn de antilichamen die in deze studie worden gebruikt mengsels van onafhankelijk gegenereerde klonen en bieden ze zo een breder bereik van Specificiteit.

Experimentele resultaten documenteren de mogelijkheid om PTM crosstalk op te sporen en te beoordelen. Figuur 3 toont gegevens van een succesvolle verrijking en illustreert een voorbeeld voor een peptide dat meerdere en verschillende acylmodificaties bevat die PTM-crosstalk visualiseren. Figuur 3A toont een peptide dat is geacetyleerd op het ene lysineresidu en aan de andere kant wordt geacetyleerd, en figuur 3B toont hetzelfde peptide dat bij beide lysines is geacetyleerd. Dit toont aan dat hetzelfde lysineresidu met beide acyatiegroepen kan worden gewijzigd en dat er op die locatie sprake is van crosstalk. Figuur 4 toont het aantal lysineresiduen dat is geïdentificeerd zoals beschreven in de punten 7.1-7.3 om beide wijzigingen te vervoeren, waarbij ook wordt gewezen op mogelijke PTM-dwarsloop.

Zoals figuur 5 laat zien, kunnen we met de verwerking van DIA PTM-datasets met kwantitatieve proteomics-software bepalen welke specifieke lysineresiduen worden gewijzigd. Dit is een concept dat bekend staat als site lokalisatie, dat is een essentiële stap voor elke analyse voor de bepaling van mogelijke PTM crosstalk. Figuur 5 toont twee potentiële isovormen samen met de bevestigende en weerleggende ionen voor elk die kunnen worden gevisualiseerd en beoordeeld zoals beschreven in de punten 8.1-8.3 (met name de stappen 8.3.2 en 8.3.3). Op basis van deze informatie konden we vol vertrouwen vaststellen welke van de twee isovormen in het oorspronkelijke monster aanwezig was. Het MS/MS-spectrum van het bevestigde isoforme KQYGEAFEKacR toont duidelijk aan dat de y ionen (y₂-y₅₎die het geacetyleerde lysineresidu bevatten, dat met 42 m/z (de toenamemassa van een acetylgroep) verschoof, het specifieke lysineresidu in het peptide bevestigde dat werd gewijzigd.

Figuur 1: Typische werkstroom voor éénpotverrijking van PTM's. Weefsel (hier, levers) worden geoogst uit SIRT5 KO en wild-type (WT) muizen, en eiwitten worden lysed, trypsine verteerd in peptiden, en ontzout. Peptiden worden vervolgens verrijkt door immunoaffiniteit met combinaties van succinyl- en acetyl-antilichaamkralen. Parallelle MS-workflows meten zowel 1) kleine aliquots van hele lysate eiwitexpressieveranderingen (voor eiwitnormalisatie) als 2) verrijkte acylbevattende peptiden voor identificatie van acyatiesite (DDA-MS) en locatielokalisatie, gevolgd door kwantificering (DIA-MS). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Vergelijking van eenpotige workflow met alternatieve methoden. (A) Vergelijking van tijd, kosten en materialen die nodig zijn voor de eenpotige workflow, seriële PTM-verrijking en twee single-PTM-verrijkingen. (B) Vergelijking van cv's tussen de éénpotige workflow, enkele acetyl-lysine PTM-verrijking en enkelvoudige succinyl-lysine PTM-verrijking. Spearman correlatie analyse vergelijken van de acyl peptide piekgebieden verkregen uit de one-pot workflow, en de single-PTM verrijkingen: overeenkomstige percelen van de log2 piekgebied resultaten voor (C) acetylatie sites en (D) succinylation sites. Regressiehellingen en correlatiefactoren worden aangegeven in de afzonderlijke panelen¹⁴. Twee onafhankelijke biologische replica's werden verwerkt voor elk van de voorwaarden. Dit cijfer is gewijzigd van Basisty et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Kruisbespreking tussen acetylatie en succinylation wijzigingen van lysineresiduen. MS/MS-spectra van tryptische peptiden van mitochondriale 3-ketoacyl-CoA thiolase die dezelfde aminozuursequentie vertonen, maar zijn gewijzigd bij twee lysineresiduen met verschillende PTM's. (A) MS/MS van peptide AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK en (B) MS/MS van peptide AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Dit cijfer is gewijzigd van Basisty et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Overlap en crosstalk tussen de geacetyleerde en sappige lysineresiduen-specifieke voorbeelden in eiwitcomplexen. (A) Venn diagram met overlapping tussen 2.235 acetylatie en 2.173 succinylation sites. Hiervan werden 943 sites geacetyleerd en sappig. Lever van een SIRT5 (de-succinylase) knock-out muis werd geanalyseerd, en veel succinylation sites werden geïdentificeerd. In feite waren ze overvloediger dan normaal waargenomen in de muis lever (gemodificeerde peptiden werden gefilterd op een Q-waarde van <0,05). (B) Eiwitcomplexen met het percentage van hun subeenheden die zowel geacetyleerde als sappige sites bevatten (vetrode lijn vertegenwoordigt de betekenis zoals bepaald door fisher's exacte test). (C) Diagram van ATP synthase complex: eiwit subeenheden in het rood verbeelden de subeenheden die zowel geacetyleerde en sappige sites bevatten. Dit cijfer is gewijzigd van Basisty et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Kwantitatieve proteomics software ontcijfert de peptide site lokalisatie van PTMs. Op basis van MS/MS fragmentatie van het peptide is het mogelijk om informatie te verstrekken over het specifieke lysineresidu dat de acetylgroep wijzigt. Dit toont het vermogen van de software om waardevolle informatie te bieden over site lokalisatie van PTMs. (A) Twee mogelijkheden van lysine residu modificatie en PTM site lokalisatie: KQYGEAFEKacR (links) en KacQYGEAFEKR (rechts). "Bevestigen" en "weerleggen" fragment ionen worden getoond voor elk van de potentiële site lokalisatie isovormen van het peptide. Op basis van deze informatie worden bevestigende scores en weerleggingsscores toegewezen, die de aanwezigheid van isoform KQYGEAFEKacR in de steekproef bevestigen. (B) MS/MS-spectrum dat overeenkomt met het bevestigde isoforme KQYGEAFEKacR dat aangeeft dat alle y-ionen, met inbegrip van het geacetyleerde lysineresidu (y₂ en hoger) een toenamemassa van +42 m/z bevatten, wat overeenkomt met de acetylwijziging. Waargenomen b ionen bevatten de wijziging niet. (C) Geëxtraheerd ionchromatogram (XIC) met overvloedige piekgebieden als gevolg van y₂ en y₃ ionen, die beide deel uitmaken van de acetylatie site in de bevestigde isoform KQYGEAFEKacR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek voor gelijktijdige meervoudige PTM verrijking om PTM crosstalk effectiever te begrijpen. Alternatieve methoden om deze doelstelling te bereiken zijn meestal onbetaalbaar tijdrovend en duur, en ze vereisen grote hoeveelheden eiwit om succesvol te zijn^11,13. Dit protocol presenteert een multi-PTM verrijking workflow die incubatie in antilichaam-geconjugeerde kralen voor twee PTM's tegelijk omvat om de algehele efficiëntie van het experiment te verbeteren. Deze methode omvat ook het gebruik van DDA voor spectrale bibliotheekgeneratie en DIA MS-acquisities om de peptiden te detecteren en te kwantificeren die aanwezig zijn met verminderde interferentie van fragmentionen^22,23. Softwareprogramma's, zoals MS database zoekmachines worden gebruikt om gegevens van DDA-overnames te analyseren en te kwantificeren, terwijl Kwantitatieve Proteomics Software²⁴ en specifieke DIA Quantitative Analysis Software²⁵ nodig zijn om de complexe spectra van DIA-acquisities te interpreteren.

Er zijn verschillende kritieke stappen binnen dit protocol die zorgvuldig moeten worden gevolgd. Aangezien het belangrijkste doel van het protocol is om voor meerdere PTM's tegelijk te verrijken, is de antilichaam-affiniteitsverrijkingsstap (sectie 2) van cruciaal belang voor het succes van het experiment. Bij het uitvoeren van wasbeurten op de kralen, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat geen van de kralen per ongeluk worden aangezogen. Ervoor zorgen dat de ureeconcentratie is verdund tot 1 M voorafgaand aan de spijsvertering met trypsine (stap 1.8) is ook noodzakelijk. Hoewel 8 M urea eerder vereist is in het protocol voor eiwitoplosbaarheid, zullen ureaconcentraties boven 1 M de enzymatische activiteit van trypsine remmen. Daarnaast is het belangrijk om de pH van het monster in het hele protocol consistent te controleren. Dit is vooral belangrijk voorafgaand aan de spijsvertering. Als de pH van het monster en de trypsineoplossing niet voldoende worden geneutraliseerd voorafgaand aan de incubatie, kan dit resulteren in een inefficiënte spijsvertering waarbij veel decolletéplaatsen kunnen worden gemist, wat resulteert in minder peptide-identificaties.

Een paar wijzigingen in het protocol kan nuttig zijn bij de voorbereiding van monsters. Voor een eiwitlysaat dat is verkregen uit 1 mg uitgangsmateriaal, kan een kwart van de antilichaamkralen in elke PTM-scanbuis worden gebruikt als een kosteneffectief alternatief. Een grotere hoeveelheid uitgangsmateriaal kan worden gebruikt voor betere resultaten, zolang de hoeveelheid gebruikte antilichaamkralen proportioneel wordt verhoogd. Een andere wijziging die de workflow kan verbeteren is om monsters te verteren met een andere protease in aanvulling op trypsine. Deze wijziging zou resulteren in meer variabiliteit in de peptiden gespleten, het verstrekken van een verhoogde dekking van eiwitresten. Hoewel niet nodig, wordt aanbevolen dat trypsine een van de enzymen zijn die worden gebruikt voor PTM-analyse vanwege de hoge decolletéspecificiteit²⁶.

Een beperking van dit protocol is dat de onderzochte PTM's vergelijkbare chemiemoeten hebben om gelijktijdig¹⁴te worden verrijkt . De procedures voor de verschillende antilichaam-geconjugeerde kralen moeten vergelijkbaar zijn, met behulp van soortgelijke oplosmiddelen en oplossingen, met inbegrip van soortgelijke elutie voorwaarden, en bij voorkeur van dezelfde leverancier. Om deze reden gebruikt de hier geschetste methode consequent acetylatie en succinylation als voorbeeld, die beide antilichaamgeconjugeerde kralen gebruiken (Cell Signaling Technology, Inc). Hoewel deze methode theoretisch kan worden toegepast op een willekeurig aantal PTM's, zouden aanvullende studies nodig zijn om de exacte beperking van het protocol in dit verband te beoordelen. Aangezien dit een op antilichamen gebaseerde verrijkingsmethode is, kan de methode bovendien alleen zorgen voor een relatieve kwantificering van PTM-sites.

In vergelijking met bestaande multi-PTM verrijkingsmethoden is deze workflow een haalbaarder en kosteneffectiever alternatief. Uit dit experiment werd geconstateerd dat de werkzaamheid van deze methode zeer goed vergelijkt met alternatieve methoden, zoals individuele of seriële verrijkingen. Figuur 2B toont aan dat het mediane CV voor gemodificeerde peptidepiekgebieden daadwerkelijk is verlaagd in de one-pot-methode in vergelijking met single-PTM-verrijkingen en seriële PTM-verrijkingen¹³. We hebben de experimentele resultaten verder geanalyseerd waarin kwantificeringen op locatieniveau voor acetylatie of succinylation werden beoordeeld. Bovendien toonde de correlatieanalyse van Spearman (figuur 2C,D) aan dat de ptm-verrijking met één pot op dezelfde manier heeft gepresteerd als de verrijkingsworkflows voor één PTM. Dit gold ook voor de peptide- en fragment-niveau correlaties. Dezelfde constatering voor alle drie de correlaties bij het vergelijken van één pot met seriële PTM-verrijking.

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om fascinerende biologische inzichten te maken in PTM crosstalk op een snelle en kosteneffectieve manier. De DIA-component van de workflow stelt onderzoekers in staat om meer te begrijpen over PTM's, omdat het informatie biedt over locatielokalisatie en uitdagingen overwint, zoals een lage locatiebezetting van PTM's. Voorloper-ionen zijn meestal uitgesloten bij DDA, wat vooral belangrijk is bij het bestuderen van PTM's, omdat de bezetting van de site vaak laag is tot het punt waarop deze peptiden niet worden geselecteerd voor MS/MS, maar nog steeds cruciale informatie bevatten. Follow-up experimenten kunnen worden uitgevoerd om de bovengrens van hoeveel PTM's gelijktijdig kunnen worden verrijkt met behulp van deze methode te beoordelen. Een toekomstige verbetering van deze workflow kan de ontwikkeling van meer geavanceerde softwareplatforms omvatten om de analyse van sitelokalisatie en PTM-sitebezetting verder te automatiseren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	36XL66
Bioruptor sonicator	Diagenode, Denville, NJ, USA	B01020001
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)	SCIEX, Framingham, MA, USA	5015841
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å)	SCIEX, Framingham, MA, USA	804-00001
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	T1317-1EA
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	22363352
Formic acid	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Ki-3002-2
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
mapDIA		web link	software for interference removal of DIA datasets
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC230-4
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser	VWR International, Radnor, PA, USA	89204-088
mProphet in Skyline		incorporated in Skyline	integrated statistical algorithms for FDR assessments
Oasis HLB SPE cartridges	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT094225	cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material
Phosphate buffered saline solution	Life Technologies	10010023
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225
ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine'	SCIEX, Framingham, MA, USA	software download SCIEX	MS database search engine
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764	Cell Signaling Technology	13764	antibody beads for affinity enrichment
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416	Cell Signaling Technology	13416	antibody beads for affinity enrichment
Sequencing-grade lyophilized trypsin	Life Technologies	23225
Skyline - 'Quantitative Proteomics Software'	MacCoss lab (academic)	open source software	Quantitative Proteomics Software (academic)
Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software'	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Sw-3001	DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115	instrument to concentrate liquid volume of samples
TissueLyser II	Qiagen, Hilden, Germany	85300	instrument for efficient lysis of tissue
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508-1L
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer	SCIEX, Framingham, MA, USA	Per quote	high resolution mass spectrometer
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system	SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	Model #845	chromatographic separation system
Urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
Water, Burdick and Jackson LC-MS	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	600-30-76
ZipTip C18 Pipette Tips, P10	Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL	ZTC18S096	C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures