Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hirofumi Nishizono; Mohamed Darwish; Hideki Uosaki; Nanami Masuyama; Motoaki Seki; Hiroyuki Abe; Nozomu Yachie; Ryohei Yasuda

doi:10.3791/60808

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60808

⸱

2 april 2020

Hirofumi Nishizono^*¹^,²^,³ , Mohamed Darwish^*⁴^,⁵ , Hideki Uosaki⁶^,⁷ , Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰ , Motoaki Seki⁸^,¹¹ , Hiroyuki Abe³ , Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³ , Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Samenvatting

Het gebruik van genetisch gemodificeerde (GM) muizen is cruciaal geworden voor het begrijpen van de genfunctie en het ontcijferen van de onderliggende mechanismen van menselijke ziekten. Het CRISPR/Cas9-systeem stelt onderzoekers in staat om het genoom te wijzigen met ongekende efficiëntie, trouw en eenvoud. Gebruikmakend van deze technologie, onderzoekers zijn op zoek naar een snelle, efficiënte en eenvoudige protocol voor het genereren van GM muizen. Hier introduceren we een verbeterde methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's die leidt tot een hogere ontwikkelingsgraad van de invriesontdooide embryo's. Door het te combineren met geoptimaliseerde elektroporatieomstandigheden, maakt dit protocol het mogelijk om binnen korte tijd knock-out- en knock-in muizen te genereren met een hoog rendement en lage mozaïeksnelheden. Verder tonen we een stapsgewijze uitleg van ons geoptimaliseerde protocol, dat betrekking heeft op CRISPR reagensvoorbereiding, in vitro fertilisatie, cryopreservatie en ontdooiing van eencellige embryo's, elektroporatie van CRISPR-reagentia, muisgeneratie en genotypering van de oprichters. Met behulp van dit protocol moeten onderzoekers gm-muizen met ongeëvenaard gemak, snelheid en efficiëntie kunnen voorbereiden.

Inleiding

Het geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeats (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) systeem is een wetenschappelijke doorbraak die ongekende gerichte modificatie in het genoom¹biedt. Het CRISPR/Cas9 systeem bestaat uit Cas9 eiwit- en gidsRNA (gRNA) met twee moleculaire componenten: een doelspecifiek CRISPR RNA (crRNA) en een transactiverend CRISPR RNA (tracrRNA)² . Een gRNA stuurt het Cas9-eiwit naar de specifieke locus in het genoom, 20 nucleotiden complementair aan crRNA en grenzend aan het protospacer aangrenzende motief (PAM). Het Cas9-eiwit bindt zich aan de doelsequentie en induceert dub....