Methodenartikel

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 april 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bottom-up assemblage benadering voor de bouw van synthetische cellen is een effectief instrument voor het isoleren en onderzoeken van cellulaire processen in een cel nabootsen omgeving. Bovendien heeft de ontwikkeling van celvrije expressiesystemen aangetoond dat het vermogen is om de eiwitproductie-, transcriptie- en vertaalprocessen (DNA→RNA→eiwit) op een gecontroleerde manier te reconstrueren, waarbij synthetische biologie wordt gebruikt. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van een cel-vrije expressie systeem, met inbegrip van de productie van een krachtige bacteriële lysaat en inkapselen dit lysaat binnen cholesterol-rijke lipide-gebaseerde gigantische unilamellar vesicles (GUVs) (dat wil zeggen, stabiele liposomen), om synthetische cellen te vormen. Het protocol beschrijft de methoden voor de voorbereiding van de componenten van de synthetische cellen, met inbegrip van de productie van actieve bacteriële lysaten, gevolgd door een gedetailleerde stapsgewijze voorbereiding van de synthetische cellen op basis van een water-in-olie emulsie overdracht methode. Deze vergemakkelijken de productie van miljoenen synthetische cellen op een eenvoudige en betaalbare manier met een hoge veelzijdigheid voor het produceren van verschillende soorten eiwitten. De verkregen synthetische cellen kunnen worden gebruikt om de productie en activiteit van eiwitten/RNA te onderzoeken in een geïsoleerde omgeving, in gerichte evolutie, en ook als een gecontroleerd geneesmiddelenleveringsplatform voor on-demand productie van therapeutische eiwitten in het lichaam.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthetische cellen zijn kunstmatige celachtige deeltjes, die een of meerdere functies van een levende cel nabootsen, zoals het vermogen om te verdelen, membraaninteracties te vormen en eiwitten te synthetiseren op basis van een genetische code1,2,3. Synthetische cellen die celvrije eiwitsynthese (CFPS) systemen omsluiten bezitten een hoge modulariteit vanwege hun vermogen om verschillende eiwitten en RNA sequenties te produceren na veranderingen in de DNA-sjabloon. CFPS-systemen zijn gebaseerd op cellysaat, gezuiverde componenten of synthetische componenten en bieden een aantrekkelijk alternatief voor de huidige benaderingen van eiwitproductie en omvatten alle transcriptie- en vertaalmechanismen die nodig zijn voor eiwitsynthese, zoals ribosomen, RNA-polymerase, aminozuren en energiebronnen (bijvoorbeeld 3-fosfhoglyceren en adenine trifosfaat)4,5,6,7,8,9. De inkapseling van een CFPS-systeem in lipideblaasjes maakt de eenvoudige en efficiënte productie van eiwitten mogelijk zonder afhankelijk te zijn van een levende cel10. Bovendien, dit platform maakt synthese van peptiden die kunnen degraderen in natuurlijke cellen, de productie van eiwitten die giftig zijn voor levende cellen, en eiwitten te wijzigen met niet-natuurlijke aminozuren11,12. Synthetische cellen zijn gebruikt als een model voor onderzoeksdoeleinden het onderzoeken van de minimale celcomponenten die nodig zijn om cellulair leven mogelijk te maken vanuit een evolutionair perspectief1,13. Synthetische cellen zijn ook gebruikt voor het bouwen en implementeren van genetische circuits en als modellen voor gerichte evolutie14,15,16. Andere studies hebben zich gericht op het vermogen van synthetische cellen om de biologische activiteit van natuurlijke cellen na te bootsen, gericht op het vervangen van beschadigde natuurlijke cellen, zoals bètacellen bij patiënten met diabetes17. Bovendien illustreert het vermogen van deze CFPS om synthetische cellen in te kapselen om een verscheidenheid aan therapeutische eiwitten te produceren, het potentieel ervan om in klinisch gebruik te worden opgenomen18.

Hier beschrijven we een bottom-up lab-schaal protocol (Figuur 1) voor de productie van RNA en eiwitproducerende synthetische cellen op basis van een CFPS-systeem ingekapseld in een lipide blaasje. Dit toont het mogelijke gebruik van synthetische celplatforms als nieuwe systemen voor de levering van geneesmiddelen voor de on-site productie van een therapeutisch eiwitmedicijn in vivo19. Eerdere studies hebben de optimalisatie van de CFPS-reactie en de cellysaatvoorbereidingsprocessen4,8,20onderzocht. Bovendien zijn verschillende technieken toegepast voor liposoompreparaat ter grootte van celformaat, zoals microfluïdische en polymeergebaseerde druppelstabilisatiemethoden21,22,23, die ook verschillen in de lipidesamenstelling van liposomen24,25,26. In het gepresenteerde protocol worden synthetische cellen geproduceerd met behulp van een water-in-olie emulsieoverdrachtsmethode en wordt het inkapselingsproces uitgevoerd bij lage temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28. Deze milde omstandigheden bleken gunstig te zijn voor het behoud van de bio-functionele integriteit van de moleculaire machines, namelijk ribosomen en eiwitten27,29,30. De lipidesamenstelling van de deeltjes bestaat uit zowel cholesterol als 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC). De eerste is te vinden in alle zoogdiercelmembranen en is essentieel voor de stabiliteit, stijfheid en doorlaatbaarheid vermindering van het membraan, en de laatste bootst zoogdier fosfolipide samenstelling11,13. De cellulaire transcriptie en vertaling moleculaire machines worden gewonnen uit de BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, die wordt getransformeerd met pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase om CFPS potentie en eiwitsynthese te verhogen. Dit systeem is gebruikt voor de productie van diagnostische en therapeutische eiwitten, met moleculaire gewichten tot 66 kDa in vitro en in vivo19,31. Het volgende protocol biedt een eenvoudige en effectieve methode voor de productie van het synthetische celsysteem, dat een breed scala aan fundamentele vragen in verband met eiwitsynthese in de natuur kan aanpakken en ook kan worden gebruikt voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De afbeelding van het productieprotocol van de volledige synthetische cellen wordt gepresenteerd in figuur 1. Afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kunnen de eiwitexpressie (paragraaf 3.2) en de synthetische celvorming (punt 4) delen van het protocol ook onafhankelijk (met enkele aanpassingen) onafhankelijk worden uitgevoerd.

1. Bereiding van S30-T7 lysaat

  1. Streepplaat de E. coli BL21(DE3) bacteriën getransformeerd met de T7 RNA polymerase uitdrukken pAR1219 plasmide op een LB-agar plaat aangevuld met 50 μg/mL ampicillin om enkele kolonies te verkrijgen.
  2. Bereid een starteroplossing voor: inenoculeer een enkele kolonie in 5 mL LB-media aangevuld met 50 μg/mL ampicillin in een 100 mL Erlenmeyer-kolf en groei 's nachts met behulp van een incubatorshaker op 250 tpm en 37 °C. Maak duplicaten voor.
  3. Inent elke 5 mL starter afzonderlijk in 500 mL tb-media aangevuld met 50 μg/mL ampicillin in een 2 L Erlenmeyer-kolf met schotten en kweek deze met behulp van een incubatorshaker op 250 rpm en 37 °C tot het OD600 van 0,8-1 bereikt. Controleer periodiek met behulp van een spectrofotometer.
  4. Voeg 2-3 mL van 100 mM voorraad IPTG (tot 0,4 - 0,6 mM) voor inductie van T7 RNA polymerase expressie en blijven groeien van de cultuur totdat het od600bereikt ∙4.
  5. Breng de oplossing van elke Erlenmeyer-kolf over in twee gesteriliseerde centrifugebuizen van 250 ml.
  6. Centrifugeer elk op 7.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
    LET OP: In dit stadium kan de bacteriële pellet enkele dagen bij -20 °C worden bewaard voordat ze naar de volgende stappen gaan.
  7. Hang elke pellet opnieuw op in 250 mL koude (4 °C) S30 lysatebuffer en centrifugeer op 7.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    OPMERKING: De S30 lysaatbuffer wordt gebruikt voor het handhaven van de eiwitstabiliteit nadat cellyse wordt uitgevoerd met behulp van de homogenisator in stap 1.9. Vanaf deze stap moeten alle stappen tot 1.12 achtereenvolgens en snel worden uitgevoerd.
    LET OP: Voordat u doorgaat naar de volgende stap, pre-cool de tips en 1,5-milliliter flesjes die nodig zijn voor het opslaan van de lysaat
  8. Gooi de supernatant weg en hang alle pellets samen op in 15 mL koude S30 lysate buffer. Filter de suspensie met gaaskussen.
    LET OP: 15ml oplossing is te wijten aan homogenisator min. volume. Moet worden opgemerkt dat bacteriën concentratie is ook belangrijk.
  9. Homogeniseren bij een werkdruk van 15.000 psi, met een luchtdruk van 4 bar (twee passen) voor celbreuk. Vermijd oplossingverdunning voor een meer geconcentreerd en actief lysaat.
  10. Voeg 100 μL van 0,1 M DTT (LET) per 10 mL van de gehomogeniseerde suspensie toe.
  11. Centrifugeer de vering op 24.700 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
  12. Voer de volgende stap snel uit voor het behoud van de lysaatactiviteit: verdeel de supernatant één voor één in 200 μL aliquots in voorgekoelde 1,5 mL-flacons en klik onmiddellijk vast met vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 °C voor verder gebruik.
    LET OP: DTT is geclassificeerd als irriterend en schadelijk en moet daarom met zorg worden behandeld.

2. Bereiding van lipiden in olieoplossing

  1. Los POPC en cholesterol in chloroform (CAUTION) afzonderlijk op, elk tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/mL. Vortex elk flesje afzonderlijk.
    1. Combineer de componenten in een 2mL glazen flacon: voeg 50 μL POPC in chloroform, 50 μL cholesterol in chloroform en 500 μL minerale olie toe. Voor 100 μL synthetische cellen zijn 2 flacons lipiden in olie nodig.
    2. Vortex, en verwarm dan ongeveer 1 uur bij 80 °C in een chemische kap om de chloroform te verdampen. Zorg ervoor dat volledige verdamping heeft plaatsgevonden door de opgegeven tijd/omstandigheden te volgen en het volume van de oplossing te controleren.
      LET OP: De resulterende lipide-in-olie oplossing kan maximaal twee weken bij kamertemperatuur worden bewaard. Voor betere resultaten wordt aanbevolen om voor elk experiment een nieuwe bereiding te gebruiken. Lipide- en cholesterolverhoudingen kunnen worden gewijzigd volgens de gewenste membraansamenstelling. Een hoge concentratie cholesterol kan leiden tot de vorming van aggregaten in de uiteindelijke synthetische celoplossing.
      LET OP: Chloroform is geclassificeerd als irriterend en schadelijk en moet daarom met zorg en in gebieden met rookextractie worden behandeld.

3. Preparaten van uiterlijke, voor- en voedingsoplossingen

  1. Voorbereiding van voorraadoplossingen
    1. Bereid de in tabel 2 vermelde voorraadoplossingen voor met ultrazuiver water (UPW).
      LET OP: Voorraadoplossingen moeten van tevoren worden voorbereid en bij -20 °C worden opgeslagen tot verder gebruik. Reagens 7 heeft de neiging om aggregaten te vormen. Verwarming tot 37 °C vermindert de aggregatie. Lichte aggregatie heeft geen invloed op de reactie. Reagens 8 oplossing is melkachtig en troebel.
  2. Buitenoplossing
    1. Los glucose op in DNase/RNase-vrije H2O tot een eindconcentratie van 200 mM.
    2. Bereid voor 100 μL binnenoplossing 1,6 mL van de buitenste oplossing voor.
  3. Pre-inner oplossing
    1. Voeg reagentia 1-14 toe op basis van de in tabel 2vermelde bedragen en concentratie . Bereid bijvoorbeeld voor een laatste synthetisch celvolume van 100 μL 100 μL binnenoplossing voor.
      OPMERKING: UPW moet worden toegevoegd om het uiteindelijke vereiste volume te voltooien. In dit stadium kan het mengsel enkele uren bij 4 °C worden bewaard.
  4. Voeroplossing
    1. Voeg alle reagentia toe op basis van de in tabel 3 vermelde bedragen en concentratie.
      LET OP: Gebruik 1:1 verhouding van de voedingsoplossing:innerlijke oplossing. Bereid voor een laatste synthetisch celvolume van 100 μL 100 μL voedingsoplossing voor. Het wordt aanbevolen om een klein teveel volume van de buitenste, binnenste en voeding oplossing voor te bereiden.

4. Bereiding van synthetische cellen

OPMERKING: De volgende volumes worden aangepast voor de bereiding van 100 μL synthetische cellen.

  1. Synthetische cellen die eiwitten produceren
    1. In een buis van 15 mL, plaats 12 mL van de buitenste oplossing en voeg langzaam, op de top een laag, van 500 μL lipiden in olieoplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    2. Om de voorbereiding van de innerlijke oplossing af te ronden: meng de ingrediënten van de innerlijke oplossing op gemalen ijs tot een eindvolume van 100 μL door het ontdooien en toevoegen van S30-T7 Lysaat (reagens 15) en DNA plasmimid (reagens 16) aan het opgeslagen mengsel.
    3. Voeg aan de tweede 2 mL glasflacon met 500 μL lipiden in olieoplossing 100 μL van de binnenoplossing toe. Pipette er krachtig op en neer gedurende 1 minuut en vortex voor nog een minuut op niveau vijf.
      1. Incubeer gedurende 10 min op gemalen ijs en voeg langzaam de resulterende emulsie toe bovenop de oliefase in de 15 mL buis (van 4.1.1).
    4. Centrifugeer gedurende 10 min bij 100 x g en 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °C. Tegen het einde van de centrifugering moet een pellet aan de onderkant van de buis worden waargenomen.
      OPMERKING: Het gebruik van een swingende emmer centrifuge rotor heeft hier de voorkeur voor het verkrijgen van een betere dekking van een tweede laag lipiden tijdens de water-in-olie druppels passage door de interfase. In het geval dat er geen waarneembare pellet is, kan de centrifugatiesnelheid worden verhoogd tot 1000 x g. Zie anders de sectie Discussie, verwijzend naar de specifieke ernst van de buitenste oplossing.
    5. Haal de pellet eruit.
      1. Verwijder overtollige olielaag.
      2. Gebruik een bijgesneden pipettip geladen met ongeveer 400 μL buitenoplossing om de pellet te extraheren. Laat de buitenste oplossing los tijdens het passeren van de oliefase om alleen de pellet in de waterige fase te verzamelen.
        1. Veeg de punt na de extractie van de pellet om te voorkomen dat de overdracht van olie resten en breng de pellet naar een schone 1,5 mL buis.
    6. Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g en 4 °C, verwijder de supernatant en hang de pellet opnieuw op in 100 μL voedingsoplossing (1:1 verhouding van binnen:voedings).
      LET OP: Hier kan ook een centrifugerotor met vaste hoek worden gebruikt.
    7. Voor eiwitexpressie, incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C zonder te schudden.
      LET OP: Optimale incubatietijd varieert tussen verschillende eiwitten.
    8. Evalueer de geproduceerde eiwithoeveelheid met behulp van een geschikte methode op basis van de doeleiwiteigenschappen.
  2. Aanbevolen controlegroepen
    1. Innerlijke oplossing en lysate activiteit bevestiging
      1. Bereid een complete innerlijke oplossing voor (met DNA & S30-T7 lysate).
      2. Incubeer de bovenstaande reactie onmiddellijk met behulp van een incubatorshaker op de vloer bij 250 rpm of een thermomixer bij 1200 tpm, bij een constante temperatuur van 37 °C gedurende 2 uur.
        OPMERKING: Pas de incubatietijd aan op de incubatietijd van de synthetische cellen.
    2. Synthetische cellen
      1. Negatieve controlegroep: Bereid het protocol gepresenteerd in 4.1 voor met innerlijke oplossing zonder DNA.
      2. Positieve controle: Bereid het protocol gepresenteerd in 4.1 met innerlijke oplossing met een T7 plasmide codering voor een reporter gen.
        OPMERKING: Voeg naast de testgroepen een positieve controlegroep toe die bestaat uit een meldergen, zoals sfGFP, om de inkapselingsefficiëntiestap te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor de bereiding van synthetische cellen door een S30-T7 CFPS-systeem in te kapselen op basis van BL21 E. coli in lipideblaasjes. Een schematische beschrijving van het voorbereidingsproces met een afbeelding van elke fase wordt weergegeven in figuur 2. Het succes van het synthetische celvoorbereidingsproces is afhankelijk van de juiste prestaties van elke fase en wordt uitgevoerd door verschillende parameters. Het protocol moet worden aangepast aan de pr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol introduceert een eenvoudige en betaalbare methode voor de productie van grote hoeveelheden eiwitproducerende synthetische cellen. De opbrengst van actieve cellen is afhankelijk van een zorgvuldige en nauwkeurige uitvoering van het protocol met de nadruk op verschillende kritische stappen. In het lysaatpreparaat gedeelte van deze methode, is het essentieel om de juiste bacteriëndichtheid vóór cellyse te bereiken om een voldoende hoeveelheid proteïnen in het bacteriële lysaat te bereiken. Ten tweede moet het l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door ERC-STG-2015-680242.

De auteurs erkennen ook de steun van het Technion Integrated Cancer Center (TICC); het Russell Berrie Nanotechnology Institute; het Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; het Israëlische ministerie van Economie voor een Kamin-subsidie (52752); het Ministerie van Israël van De Technologie en de Ruimte van de wetenschap van Israël - Bureau van de Belangrijkste Wetenschapper (3-11878); de Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); de Israel Cancer Association (2015-0116); de Duits-Israëlische Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek en Ontwikkeling voor een GIF Young-subsidie (I-2328-1139.10/2012); het FP-7 IRG-programma van de Europese Unie voor een loopbaanintegratiebeurs (908049); het Phosfolipide Research Center Grant; een Rosenblatt Foundation for cancer research, een Mallat Family Foundation Grant; en de Unger Family Foundation. A. Schröder erkent Alon en Taub Fellowships. O. Adir erkent de Sherman en Gutwirth beurzen. G. Chen erkent de Sherman Fellowship. N. Krinsky erkent de barones Ariane de Rothschild Women Doctoral Program van de Rothschild Caesarea Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A. Reagenten vereist voor stap 1 (voorbereiding S30-T7 lysate)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076TargeTron vector voor transformatie.
Voorraad oplossing van 50 mg/mL AmpicillineSigmaA9518Bewaard bij -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptoneBD Bioscience 211705Voor bereiding van Luria Bertani (LB) agar (1,5%) plaat.
10 g/L Natriumchloride (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Bacto-Gist extractBD Bioscience 212750
15 g/L Gezuiverde agar agarMerck1.01614.5007
50 µg/mL AmpicillineSigmaA9518
10 g/L Bacto-tryptoneBD Bioscience 211705Voor bereiding van Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Natriumchloride (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Bacto-Gist extractBD Bioscience 212750
50 µg/mL AmpicillineSigmaA9518
12 g/L Bacto-tryptoneBD Bioscience 211705Voor bereiding van Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Gist extractBD Bioscience 212750
4% (v/v) Glycerol anhydrousBio-Lab7120501
2,32 g/L K2HPO4Spectrum chemicalP1383
12,54 g/L KH2PO4Spectrum chemicalP1380
 50 µg/mL AmpicillineSigmaA9518
Voorraad oplossing van 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) INALCOINA-1758-1400Gefilterd met behulp van 0,2 µm hydrofiele PVDF spuitfilter.
Voorraad oplossing van 0,1 M dithiothreitol (DTT) TCID1071Gefilterd met behulp van 0,2 µm hydrofiele PVDF spuitfilter.
10 mM Tris-acetaat bij pH = 7,4SigmaT1503S30 lysate buffer (1,5 L)
14 mM magnesiumacetaatMerck1.05819.0250
60 mM kaliumacetaatCarlo Erba470147
1 mM DTTTCID1071
0,5 mL/L 2-mercaptoethanolSigmaM6250
Apparatuur vereist voor stap 1
100 mL gesteriliseerde Erlenmeyer kolvenThermo Scientific50-154-28462 kolven
2 L gesteriliseerde Erlenmeyer kolven met roerwerkKIMAX-KIMBLE256302 kolven
Vloerincubator shakerMRCTOU-120-2Laboratorium shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
CentrifugeThermo Scientific75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor.
Moet minimaal 13.000 x g mogelijk maken.     * Voorgekoeld tot 4 °C.
Hogedruk homogenisatorAVESTINEmulsiFlex-C3Voorgekoeld tot 4 °C.
-80oC vriezerSO-LOWU85-18
Gesteriliseerde 1,5 mL plastic buisjesEppendorf30120086Bij voorkeur voorgekoeld tot -20 °C.
SpectrofotometerTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
96-well doorzichtige plaatThermo Scientific167008
Gesteriliseerde graduleerde cilinderCorning
Gesteriliseerde centrifuge buisjesEppendorf30120086Bij voorkeur voorgekoeld tot -20 °C.
Gesteriliseerde pipettentipsCorningBij voorkeur voorgekoeld tot -20 °C.
Gebroken ijs emmerBel-ArtM18848-4001
Kleine vloeibare stikstof tankNALGENE4150-4000
B. Reagenten vereist voor stap 3 (voorbereiding lipiden in olie oplossing):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC)Lipoid556400Poeder
CholesterolSigmaC8667Poeder
ChloroformBio-Lab3082301
Mineraal olieSigmaM5904Lichte olie
Apparatuur vereist voor stap 2
Vortex mixerScientific industriesSI-0256
VerwarmingsblokTECHNEFDB03ADVoorgewarmd tot 80 °C.
Moet een gecontroleerde temperatuur mogelijk maken. 
2 mL glazen schroefhals flesjesCSI Analytical InnovationsVT009M-1232Voor een grotere schaal, gebruik 50 mL falcons en verdampen het chloroform met behulp van een rotatie verdamper.
9mm SchroefdopCSI Analytical InnovationsC395R-09LC
C. Reagenten vereist

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celvrije extracteneiwitproductieliposoomincapsulatieemulsieoverdrachtmethodebereiding van bacterieel lysaatflowcytometrie analyseWestern blot detectiefluorescentiemicroscopiecholesterolrijke liposomen

Gerelateerde artikelen