Method Article

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele histologische analyse- en celkweeksystemen zijn onvoldoende om in vivo fysiologische en pathologische dynamiek volledig te simuleren. Multiphoton microscopie (MPM) is uitgegroeid tot een van de meest populaire beeldvorming modaliteiten voor biomedische studie op cellulaire niveaus in vivo, voordelen zijn hoge resolutie, diepe weefsel penetratie en minimale fototoxiciteit. We hebben een MPM imaging platform ontworpen met een aangepaste muis ooghouder en een stereotaxic fase voor beeldvorming oculair oppervlak in vivo. Dubbele fluorescerende eiwit reporter muis maakt visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels, en haarvaten binnen het oculaire oppervlak. Naast multifoton fluorescentie signalen, het verwerven van de tweede harmonische generatie (SHG) tegelijkertijd zorgt voor de karakterisering van collageen stromal architectuur. Dit platform kan worden gebruikt voor intravital imaging met nauwkeurige positionering over het gehele oculaire oppervlak, inclusief hoornvlies en bindvlies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oculaire oppervlaktestructuren, waaronder het hoornvlies en het bindvlies, beschermen andere diepere oculaire weefsels tegen externe verstoringen. Het hoornvlies, het transparante voorste deel van het oog, functioneert zowel als een brekingslens voor het richten van licht in het oog als als een beschermende barrière. Corneal epitheel is de buitenste laag van het hoornvlies en bestaat uit verschillende lagen van oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Corneal stroma bestaat uit verfijnd verpakt collageen lamellen ingebed met keratocyten. Hoornvlies endotheel, een enkele laag van platte zeshoekige cellen, heeft een belangrijke rol in het behoud van de t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National Taiwan University en Chang Gung Memorial Hospital.

1. Multiphoton microscopie setup

  1. Bouw een systeem op basis van een rechtopstaande microscoop met wateronderdompeling 20x 1,00 NA doelstelling(figuur 1A).
  2. Gebruik Ti: Sapphire laser (met tunable golflengte) als de excitatiebron. Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nm voor EGFP en 940 nm voor tdTomato (figuur 1A).
  3. Neem twee dichroïsche spiegel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van dit live imaging platform kan het muisoculaire oppervlak op cellulair niveau worden gevisualiseerd. Om individuele enkele cellen in het oculaire oppervlak te visualiseren, gebruikten we de dubbele fluorescerende transgene muizen met EGFP uitgedrukt in de kern en tdTomato uitgedrukt in het celmembraan. De collageen-rijke hoornvlies stroma werd benadrukt door SHG signalen.

In hoornvlieseptheel werden oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen(figuur .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit op maat gemaakte MPM imaging platform met een besturingssoftware werd gebruikt voor intravital imaging van muis epitheelorganen, waaronder huid10,haarzakje10 en oculair oppervlak9,10 (Figuur 1A). Het op maat gemaakte systeem werd gebruikt voor zijn flexibiliteit in het veranderen van de optische componenten voor verschillende experimenten, sinds het begin van ons project. Deze beeld.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) en Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRP3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite softwareThermo Fisher ScientificVersion: 2019.3.0
Bandpass filtersSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrorsSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO control softwareSouthPort CorporationJade BIO
Oxybuprocaine hydrochlorideSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Polyesthylene TubeBECTON DICKINSON427401
Stereotaxic mouse holderStep Technology Co.,Ltd000111
Ti: Sapphire laserSpectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
Upright microscopyOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles