Method Article

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele histologische analyse- en celkweeksystemen zijn onvoldoende om in vivo fysiologische en pathologische dynamiek volledig te simuleren. Multiphoton microscopie (MPM) is uitgegroeid tot een van de meest populaire beeldvorming modaliteiten voor biomedische studie op cellulaire niveaus in vivo, voordelen zijn hoge resolutie, diepe weefsel penetratie en minimale fototoxiciteit. We hebben een MPM imaging platform ontworpen met een aangepaste muis ooghouder en een stereotaxic fase voor beeldvorming oculair oppervlak in vivo. Dubbele fluorescerende eiwit reporter muis maakt visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels, en haarvaten binnen het oculaire oppervlak. Naast multifoton fluorescentie signalen, het verwerven van de tweede harmonische generatie (SHG) tegelijkertijd zorgt voor de karakterisering van collageen stromal architectuur. Dit platform kan worden gebruikt voor intravital imaging met nauwkeurige positionering over het gehele oculaire oppervlak, inclusief hoornvlies en bindvlies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oculaire oppervlaktestructuren, waaronder het hoornvlies en het bindvlies, beschermen andere diepere oculaire weefsels tegen externe verstoringen. Het hoornvlies, het transparante voorste deel van het oog, functioneert zowel als een brekingslens voor het richten van licht in het oog als als een beschermende barrière. Corneal epitheel is de buitenste laag van het hoornvlies en bestaat uit verschillende lagen van oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Corneal stroma bestaat uit verfijnd verpakt collageen lamellen ingebed met keratocyten. Hoornvlies endotheel, een enkele laag van platte zeshoekige cellen, heeft een belangrijke rol in het behoud van de transparantie van het hoornvlies door het houden van hoornvlies stroma in een relatief uitgedroogde toestand door middel van haar pompen functies1. Limbus vormt de grens tussen het hoornvlies en het bindvlies, en is het reservoir van hoornvlies epitheelstamcellen2. Het sterk vasculaire bindvlies helpt om de ogen te smeren door slijm en tranen te produceren3.

Celdynamica van de hoornvliesoppervlaktestructuren worden conventioneel bestudeerd door histologische analyse of in vitrocelcultuur, die de in vivo celdynamiek mogelijk niet voldoende simuleert. Een niet-invasieve live imaging benadering kan dus de kloof overbruggen. Door de voordelen, waaronder hoge resolutie, minimale fotoschade en diepere beeldvormingsdiepte, is MPM een krachtige modaliteit geworden op diverse gebieden van biologisch onderzoek4,5,6,7,8. Voor hoornvliesbeeldvorming biedt MPM cellulaire informatie uit intrinsieke autofluorescentie afkomstig van de intracellulaire NAD(P)H. Tweede harmonische generatie (SHG) signalen afgeleid van de niet-centrosymmetrische type I collageen vezels onder femtosecond laser scanning biedt collageen stromal structuren zonder extra kleuring procedures9. Voorheen hebben wij en andere groepen MPM uitgebuit voor beeldvorming van dier- en menselijke hoornvliezen9,10,11,12,13,14,15.

Transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten vertonen in specifieke celpopulaties zijn op grote schaal gebruikt voor verschillende studies in de celbiologie, waaronder ontwikkeling, weefselhomeostase, weefselregeneratie en carcinogenese. We gebruikten transgene muizenstammen gelabeld met fluorescerende eiwitten voor in vivo beeldvorming van hoornvliezen9,10, haarzakjes10 en opperhuid10 door MPM. De dubbele fluorescerende muisstam met celmembraan gelabeld met tdTomato en celkern gelabeld met EGFP is gefokt uit twee muisstammen: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 en mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muis lijn bevat een dubbele fluorescerende eiwit reporter constructies, met inbegrip van een H2B-EGFP fusie gen en mCherry-GPI anker signaal fusie gen, ingevoegd in de GT (ROSA)26Sor locus. De mT-mG transgene stam is een celmembraan-gerichte tdTomato en EGFP fluorescerende Cre-reporter muizen. Voorafgaand aan Cre recombinatie, celmembraan eiwit met tdTomato fluorescentie expressie is op grote schaal aanwezig in verschillende cellen. Deze transgene muisstam stelt ons in staat om kernen-EGFP en membraan te visualiseren met tdTomato zonder Cre excitatie. Twee vrouwtjes (R26R-GR+/+) en één mannelijke (mT-mG+/+) transgene muis werden samen gekweekt om voldoende muizen te produceren voor experimenten. Hun nakomelingen met R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, een dubbele fluorescerende muizensoort, werden in deze studie gebruikt. Vergeleken met een fluorescerende reporter muis lijn zoals eerder beschreven9,10, deze dubbele fluorescerende reporter muis stam biedt ons een 50% verminderde verwerving van beeldvorming tijd.

In dit werk beschrijven we een gedetailleerd technisch protocol voor in vivo beeldvorming van het oculaire oppervlak stapsgewijze wijze met behulp van ons imagingplatform en dubbele fluorescerende transgene muizen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National Taiwan University en Chang Gung Memorial Hospital.

1. Multiphoton microscopie setup

  1. Bouw een systeem op basis van een rechtopstaande microscoop met wateronderdompeling 20x 1,00 NA doelstelling(figuur 1A).
  2. Gebruik Ti: Sapphire laser (met tunable golflengte) als de excitatiebron. Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nm voor EGFP en 940 nm voor tdTomato (figuur 1A).
  3. Neem twee dichroïsche spiegels (495 nm en 580 nm) op voor de scheiding van SHG/EGFP en EGFP/tdTomato (figuur 1A). Spectrally scheiden de SHG signalen, EGFP en tdTomato door bandpass filters 434/17nm, 510/84nm en 585/40nm (Figuur 1A).
  4. Om de beeldkwaliteit te optimaliseren en fotobleaching en weefselschade te voorkomen, stelt u de laserkracht in op ongeveer 35 mW voor beeldvormingsmalies en 50 mW voor limbus. Meet de laserkracht voordat de laser het optische systeem passeert. De exacte laser kracht op monsters is ongeveer 8-9 mW. Het volledige microscopische ontwerp is te zien in figuur 1A.
    OPMERKING: De bovengrens van laservermogen is ingesteld op 70 mW om fotobleken en weefselschade te voorkomen.

2. Voorbereiding van dieren op levende beeldvorming

  1. Gebruik 8-12 weken oude muizen voor het experiment. Intramusculair injecteren 50-80 mg/kg tiletamine HCl en zolazepam HCl voor algemene anesthesie. Controleer op het gebrek aan reactie op terugtrekking reflex door knijpen een teen. Voldoende verdovendering is belangrijk om een stabiele ademhalingsfrequentie monitoring mogelijk te maken.
    OPMERKING: Muizen op de leeftijd van 8 weken of ouder worden aanbevolen omdat hun oogbollen gerijpt zijn.
  2. Plaats de muis onder anesthesie op een verwarmd podium en steek de temperatuur monitoring sonde in de anus.
    LET OP: De sonde moet volledig in de anale holte worden geplaatst zonder blootstelling aan de lucht, om oververhitting van de kachel en inductie van een zonnesteek te voorkomen.

3. Ooghouden voor live beeldvorming van het oculaire oppervlak

  1. Voor live beeldvorming van het oculaire oppervlak, gebruik maken van de op maat ontworpen stereotaxic muishouder bestaande uit twee delen: een hoofdhouder om het hoofd te stabiliseren en een ooghouder om de oogleden in te trekken en bloot het gehele oculaire oppervlak (Figuur 1B-D).
  2. Steek de oorbalken in de externe auditieve meatus en houd de driepuntsfixatie van de hoofdhouder aan(figuur 1B,D).
  3. Breng lokaal een oplossing van 0,4% oxybuprocaine hydrochloride in zout en laat het gedurende 3 minuten om het oculaire oppervlak te verdoven.
  4. Zorg ervoor dat de oogbol wordt uitgestoken door de juiste handmatige ooglid intrekking. Anders kunnen ischemie en bloedingen van de oogbol optreden.
  5. Plaats voorzichtig een lus van de polyethyleenbuis van ooghouder langs de ooglidmarge om het oculaire oppervlak bloot te leggen. Stabiliseer de oogbol met de ooghouder samengesteld uit een No. 5 Dumont tang met zijn tips bedekt met de lus van polyethyleen buis (Figuur 1C, D).
  6. Schroef tangen met behulp van een knop in distale tangen van ooghouder om de oogbol stabiel te houden(Figuur 1D).
  7. Breng een ooggel aan met de brekingsindex van 1.338 op het hoornvliesoppervlak als onderdompelingsmedium om het vocht van het oculaire oppervlak elk uur te behouden. Bovendien, regelmatige toepassing van de ooggel elk uur voorkomen vertroebeling in het hoornvlies tijdens de beeldvorming.
  8. Draai de oogbol met de houder die vergrendeld op de stepper-gemotoriseerde podium voor beeldvorming over het gehele hoornvlies oppervlak van het centrale hoornvlies naar de perifere regio (Figuur 1C, D).
    LET OP: Zowel overtollige als onvoldoende hoeveelheden ooggel kunnen de kwaliteit van beelden tijdens de beeldvorming beïnvloeden. Daarom is het belangrijk om het oppervlak elk uur aan te vullen om het oppervlak regelmatig vochtig te houden voor beeldvorming.

4. Z-serieel beeldacquisitie

OPMERKING: Stel de eerste en laatste dia in elke stapel in om de bewegende artefacten te verminderen.

  1. Voordat u de foto's maakt, maakt u het doelveld met een kwiklichtbron in beeld.
  2. Klik op het symbool van de microscoopsoftware om de software in te schakelen.
  3. Selecteer de juiste PMT-versterking en digitale versterking om de cellulaire structuur in het oculaire oppervlak te visualiseren.
  4. Stel de eerste dia en de laatste dia in om een stapel te verwerven.
  5. Voer numerieke waarden in voor beeldresolutie en z-step, bijvoorbeeld 512 x 512 en 1 μm als z-stap.
  6. Klik op de startknop om z-serieafbeeldingen te verzamelen.
  7. Verzamel twee maal live beelden in hetzelfde gebied, eerst bij 880 nm excitatie voor SHG/EGFP-signalenverzameling en tweede bij 940 nm excitatie voor EGFP/tdTomato-signalenverzameling.
    OPMERKING: De combinatie van twee stapels biedt 3 kanalen beelden. De beeldresolutie en scanformaat waren respectievelijk 512 x 512 pixels en 157 μm x157 μm.

5. Beeldverwerking en 3D-reconstructie

  1. Laad de z-seriële afbeeldingen in Fiji software18.
  2. Selecteer het Plug-Median 3D-filter in Fiji om achtergrondgeluiden te verminderen.
  3. Selecteer het filter Onscherp masker voor pakketten in Fiji om de afbeeldingen te verscherpen.
  4. Klik op' Automatisch'in helderheid/contrast om automatisch de kwaliteit van afbeeldingen te optimaliseren.
  5. Sla de afbeeldingen op als beeldsequenties om de z-seriële afbeeldingen te kunnen exporteren.
  6. Laad z-seriële afbeeldingen in commerciële software (bijvoorbeeld Avizo lite) voor 3D-reconstructie met behulp van volumeweergave.
  7. In alle MPM-afbeeldingen worden respectievelijk EGFP-, tdTomato- en SHG-signalen in pseudo-groene, rode en cyaankleur aanwezig.
  8. Leg 3D-structuurfoto's vast aan de momentopname.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van dit live imaging platform kan het muisoculaire oppervlak op cellulair niveau worden gevisualiseerd. Om individuele enkele cellen in het oculaire oppervlak te visualiseren, gebruikten we de dubbele fluorescerende transgene muizen met EGFP uitgedrukt in de kern en tdTomato uitgedrukt in het celmembraan. De collageen-rijke hoornvlies stroma werd benadrukt door SHG signalen.

In hoornvlieseptheel werden oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen(figuur ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit op maat gemaakte MPM imaging platform met een besturingssoftware werd gebruikt voor intravital imaging van muis epitheelorganen, waaronder huid10,haarzakje10 en oculair oppervlak9,10 (Figuur 1A). Het op maat gemaakte systeem werd gebruikt voor zijn flexibiliteit in het veranderen van de optische componenten voor verschillende experimenten, sinds het begin van ons project. Deze beeld...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) en Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRP3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite softwareThermo Fisher ScientificVersie: 2019.3.0
Bandpass filtersSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrorsSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO control softwareSouthPort CorporationJade BIO
Oxybuprocaine hydrochlorideSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Polyesthylene TubeBECTON DICKINSON427401
Stereotaxic mouse holderStep Technology Co.,Ltd000111
Ti: Sapphire laserSpectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
Upright microscopyOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171(2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles