Method Article

Het ontcijferen van de structurele effecten van het activeren van EGFR-somatische mutaties met moleculaire dynamicasimulatie

DOI:

10.3791/61125

⸱

May 20th, 2020

 ,  ,  , 
1Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering, Åbo Akademi University, 2Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine, University of Turku, 3Turku Bioscience Centre, University of Turku and Åbo Akademi University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, University of Turku and Turku University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om moleculaire dynamica simulaties te gebruiken om de dynamische structurele veranderingen die optreden als gevolg van activerende mutaties van het EGFR kinase eiwit te onderzoeken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Talrijke somatische mutaties die zich voordoen in de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) familie (ErbB) van receptor tyrosine kinases (RTK) zijn gemeld bij kankerpatiënten, hoewel er relatief weinig zijn getest en aangetoond dat ze functionele veranderingen in ErbB's veroorzaken. De ErbB-receptoren worden verdookt en geactiveerd bij ligandbinding, en dynamische conformatieveranderingen van de receptoren zijn inherent aan inductie van downstream signalering. Voor twee mutaties die experimenteel worden getoond om de EGFR-functie, A702V en de Δ746ELREA 750-schrappingsmutatie te veranderen, illustreren we in het volgende protocol hoe moleculaire dynamica (MD) simulaties de (1) conformatiestabiliteit van de mutante tyrosine kinasestructuur kunnen onderzoeken in vergelijking met wild-type EGFR;750 2. structurele gevolgen en conformatieovergangen en hun relatie tot waargenomen functionele veranderingen; 3. effecten van mutaties op de sterkte van de bindende ATP en voor de binding tussen de kinasedomeinen in het geactiveerde asymmetrische dimer; en (4) effecten van de mutaties op belangrijke interacties binnen de EGFR-bindingsplaats die verband houden met het geactiveerde enzym. Het protocol biedt een gedetailleerde stap-voor-stap procedure, evenals begeleiding die meer in het algemeen nuttig kan zijn voor het onderzoek van eiwitstructuren met behulp van MD simulaties als een middel om structurele dynamiek en de relatie met de biologische functie sonde.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke epidermale groeifactorreceptor (EGFR) familie (ErbB) van receptor tyrosine kinases (RTKs) bestaat uit vier leden - EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 en ErbB4/HER4. De ErbB-receptoren reguleren fundamentele cellulaire processen zoals celgroei en proliferatie, differentiatie, migratie en overleving1,2, en zijn dus krachtige proto-oncogenen. Afwijkende activiteit van de ErbB-receptoren, met name EGFR en ErbB2, is vaak geassocieerd met menselijke kankers waardoor ErbB-receptoren belangrijke doelen voor kankertherapeuten2,3.

Verschillende somatische veranderingen van ERBB-genen zijn gemeld uit menselijke maligniteiten3,4,5. De best gekarakteriseerde voorbeelden zijn de terugkerende, activerende puntmutaties en korte in-frame deleties in het EGFR kinase domein bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC). Deze EGFR-mutaties vormen belangrijke drijfveren voor de groei van kanker en voorspellen de gevoeligheid voor EGFR gericht op geneesmiddelen tegen kanker6,7,8. Echter, bij de meeste vormen van kanker, somatische mutaties in EGFR optreden buiten deze terugkerende "hotspots" en worden verdeeld over de gehele 1210-residu spanwijdte van de receptor. De meeste residuen langs de primaire egefr-sequentie bleken te zijn gemuteerd bij menselijke kanker9. Afgezien van de weinige hotspots blijft de functionele betekenis van de overgrote meerderheid van de aan kanker geassocieerde EGFR-mutaties echter onbekend.

De monomerische structuur van ErbBs bestaat uit een groot aminoterminal extracellulair domein, gevolgd door een enkele transmembrane helix die leidt naar het intracellulaire tyrosine kinase-domein en C-terminal staartgebied dat dockingsites bevat voor intracellulaire signaleringseiwitten. Ligand binding leidt tot een dramatische conformatieverandering in het extracellulaire domein, die de vorming van receptorverkleiners vergemakkelijkt door de dimerisatiearmen bloot te stellen die symmetrisch over elkaar kruisen en interageren met hun aromatische / hydrofobe oppervlakken. Bij de vorming van receptorverkleiners komen de tyrosine kinasedomeinen asymmetrisch in contact (figuur 1), wat resulteert in de activering van de kinasen die de C-terminale staarten van de receptormonmeren fosforylaceren, en vervolgens bij activering van downstreamsignalering10,11.

figure-introduction-1
Figuur 1: Structuur van de EGFR dimer. EGFR dimeriseert wanneer de extracellulaire domeinen de groeifactor (EGF, epidermale groeifactor) binden. De ontvanger kinase domein wordt vervolgens geactiveerd door middel van asymmetrische interactie met de activator kinase domein, en de C-terminal staarten zijn autophosphorylated op tyrosine residuen (Gewijzigd van Tamirat et al.12). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Vanwege de dynamische structurele herschikkingen die optreden tijdens de monomeer figure-introduction-2 dimer overgangen, samen met kinase activering die wordt geassocieerd met de vorming van een asymmetrische dimer, mutaties langs de volledige lengte van de receptorstructuur kan mogelijk een effect hebben op de receptorfunctie. Hier beschrijven we enkele voorbeelden uit onze eerdere studies waarin het modelleren van de mutatie en visualisatie voldoende waren om de gevolgen voor de functie te verklaren.

Voorbeeld 1: Een gemelde mutatie, D595V in ErbB413, leidde tot verhoogde ErbB4 dimerisatie en fosforylatie14. Visualisatie van de locatie van de mutatie was een kritische factor bij het begrijpen van de waargenomen functionele effecten: D595V vond plaats bij de symmetrische crossover van de dimerische armen van het ectodomain (Figuur 2A). De armen zijn grotendeels aromatisch en hydrofoob, en de vervanging van polaire aspartic zuur door valine zou naar verwachting de "kleverige" hydrofobe interacties te verhogen, het stabiliseren van de dimer en dus verhoging van de lengte van de tijd wanneer fosforylatie plaatsvindt14. Het was een verrassing in eerste instantie te vinden aspartate in elke arm, maar achteraf zou men kunnen denken als een timing mechanisme voor activiteit, waar de polaire zuur zijketens verminderen de affiniteit en levensduur van de intacte dimer en dus beperken kinase-gemedieerde fosforylatie en signalering. Vervanging door valine zou dan deze beveiliging verwijderen door de ErbB4 dimer verder te stabiliseren.

figure-introduction-3
Figuur 2: Locatie van een ErbB4 activerende mutatie en mutaties die kinase-dode ErbB4 produceren. aA) De D595 (activerende D595V-mutatie) bevindt zich op de aromatische/hydrofobe dimerische armen van het Ectodomain-model ErbB4; de wapeninassociatie op het binden van de groeifactor; (nabijgelegen resten worden weergegeven als stokken). (B) In ErbB4 vormt de G802 (inactiverende G802dup-mutatie) de bindingszak rond de adeninering van ATP en katalytische D861 (inactiverende D861Y-mutatie) zowel Mg2+ (niet getoond) als de γ-fosfaatgroep ATP. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voorbeeld 2: Men zou kunnen verwachten dat somatische mutaties die zich richten op de ATP-bindende site van het kinase-domein enzymatische activiteit zouden veranderen of elimineren die leidt tot een verminderde of kinase-dode receptor die niet in staat is om te signaleren. Van de negen gerapporteerde mutaties van patiënten met borst, maag, colorectale of NSCLC15hadden twee van de negen geteste mutaties een sterk verminderde fosforylatieactiviteit16: G802dup (G → GG) en D861Y. Beide inactiverende somatische mutaties werden gevonden op de ATP-bindingsplaats van de tyrosine kinasedomeinstructuur (Figuur 2B):flexibele glycine, gedupliceerd, zou de adenineringsite veranderen en klein aspartisch zuur vervangen door de omvangrijke tyrosine in de buurt van de terminale fosfaten zou mg2+-ATP fysiek verhinderen dat de binding. Echter, aangezien ErbB4 een heterodimer met ErbB2 kan vormen - ErbB2 bindt geen groeifactor en hangt af van associatie met een ErbB die heterodimerize doet - de ErbB2 (actief)--ErbB4(kinase-dead) heterodimer zou stimuleren cel proliferatie via de Erk / Akt signalering traject nog cellen zouden niet onderscheiden als gevolg van kinase-dode ErbB4 en het ontbreken van STAT5 route activering16.

In recentere studies werd duidelijk dat de dynamische bewegingen van ErbB's relevant waren voor het begrijpen van de effecten van sommige mutanten op de ErbB-functie, met name mutaties die zich voordoen binnen het tyrosine kinase-domein. Het tyrosine kinase domein bestaat uit een N-kwab (voornamelijk β-sheets) en C-kwab (grotendeels alfa-spiraalvormige), die worden gescheiden door de katalytische site waar ATP bindt. De N-lobe omvat de αC helix en P-loop, terwijl de activering (A-loop) en katalytische lussen aanwezig zijn in de C-lob17,18,19. Kristalstructuren van het tyrosine kinase domein onthulden twee inactieve conformaties, de meerderheid van de structuren hebben de Src-achtige inactieve staat. In de actieve bevleesdheid wijst het katalytische aspartaat van de A-lus naar de ATP-bindingsplaats en de αC-helix is gericht op de ATP-bindingszak ("αC-in" conformatie), die een sterke glutamaat-lysine ion-pair interactie vormt.

Omdat ErbBs en het component kinase-domein zeer dynamische entiteiten zijn, en vooral voor gevallen waarin de effecten van mutaties op functie en biologische activiteit waarschijnlijk nauw verbonden zijn met de conformatietoestanden van de ErbB's, is het belangrijk om mutaties te beoordelen met betrekking tot het bereik van dynamische veranderingen die ze zouden ervaren. Röntgenkristalstructuren van ErbBs bieden statische momentopnamen van de 3D-structuur, die al dan niet relevant zijn voor het begrijpen van de dynamische gevolgen van een mutatie. Om het bereik van dynamische veranderingen die overeenkomen met het "energielandschap" dat beschikbaar is voor een driedimensionale (3D) structuur te onderzoeken, worden moleculaire dynamica (MD) simulaties op grote schaal gebruikt20. In het geval van mutaties die zouden leiden tot lokale conformatieveranderingen binnen het tyrosine kinase-domein of stabilisatie van een complex, kunnen simulaties in de orde van 100 ns voldoende zijn. Grotere conformatiewijzigingen (bijvoorbeeld overgangen tussen de actieve en inactieve conformaties van het kinase-domein) vereisen echter een langere simulatietijd - in de volgorde van microseconden21.

Met betrekking tot het onderstaande protocol houden we rekening met twee activerende mutaties binnen het tyrosine kinase-domein(figuur 3). Beide mutaties bevinden zich binnen het kinase-domein op locaties die lokale conformatiewijzigingen ervaren die bepalen of de kinase actief is of niet, en dus werden in beide gevallen MD-simulaties toegepast. In het eerste geval houden we rekening met wijzigingen die rechtstreeks van invloed zijn op de ATP-bindingslocatie en katalytische machines van het EGFR-ontvangerkinasedomein, waarbij specifiek wordt gekeken naar de gevolgen van een exon 19-schrappingsmutatie die op grote schaal betrokken is bij NSCLC4,7. De Δ746ELREA750 mutatie, die de lengte van de β3-αC-lus voorafgaand aan de αC-helix vermindert - de helix die naar de binding/actieve site op kinase-activering beweegt en deelneemt aan het vormen van de kritische elektrostatische interactie tussen E762 van de helix en K745 door de lysine te positioneren voor interactie met ATP - stelt het domein voor op activering1. In het tweede geval beschouwen we de A702V-mutatie van EGFR, waarvan is aangetoond dat het een nieuwe functieversterkingsmutatie is die door het iScream-platform9 is onthuld en geïdentificeerd in een NSCLC-patiënt22. Alanine-702 op de ontvanger kinase domein bevindt zich op juxtamembrane segment B op de interface van de ontvanger en de activator kinase domeinen, waarin deze asymmetrische kinase dimer complex en kinase conformatie veranderingen nodig zijn voor activering9.

figure-introduction-4
Figuur 3: De asymmetrische kinase domein dimer van EGFR. De A702V mutatie zou zich bevinden op de kritieke interface van de activator en ontvanger kinase domeinen, grenzend aan de αC helix en dicht bij isoleucine 941 van de activator kinase. Conformatieveranderingen veroorzaakt door de vorming van de asymmetrische dimer leiden tot kinaseactivering. De β3-αC-lus met de ELREA-reeks gaat direct vooraf aan de αC-helix; tijdens de activering beweegt de αC-helix naar binnen naar de ATP-bindingssite. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De gedetailleerde stappen die zijn genomen om de effecten van de ΔELREA- en A702V-mutatie op de EGFR-structuur te onderzoeken met behulp van MD-simulaties worden als volgt besproken:

1. Voorbereiding van de structuur

OPMERKING: Om de structurele effecten van de ΔELREA mutatie te bestuderen, worden wild-type en mutant vormen van apo actieve, ATP-gebonden actieve en apo inactieve EGFR monomeerstructuren als volgt voorbereid.

  1. Open het Chimera23 visualisatieprogramma (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) om de wild-type apo actieve EGFR kinase structuur voor te bereiden. Klik in het menu Bestand op de optie Ophalen op id en selecteer de database eiwitgegevensbank (PDB24)en geef PDB-code 2GS225 (resolutie van 2,8 Å) op. De PDB is een opslagplaats voor 3D-structuren opgelost door verschillende experimentele technieken, waaronder röntgenkristallografie, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie, cryo-elektronenmicroscopie en neutronendiffractie.
  2. Bouw de ontbrekende structurele elementen van 2GS2 door deze segmenten uit de EGFR PDB-structuren 1M1426 (2.6 Å) en 3W2S27 (1.9 Å) te halen. Open hiervoor 1M14 en 3W2S en plaats ze op 2GS2 met de optie MatchMaker in het vergelijkingsmenu Tools → Structure.
    1. Snijd de segmenten uit die moeten worden toegevoegd van 1M14 en 3W2S. Selecteer de terminalatomen van het residu vóór de hiaten in 2GS2 en de atomen die moeten worden toegevoegd uit 1M14 en 3W2S (zie tabel 1voor gedetailleerde informatie over de toegevoegde segmenten ). Typ op de opdrachtregel bond sel en druk op enter. Deze structuur is de sjabloonstructuur.
  3. Gebruik de sjabloonstructuur van stap 1.2 om de ΔELREA-verwijderingsmutatievorm van het EGFR-kinase-domein te construeren. Produceer de FASTA-indelingsvolgorde van ΔELREA EGFR door de volgorde van de sjabloonstructuur op te slaan (Favoriete →-reeks → Bestand → opslaan als)en verwijder vervolgens de ELREA-reeks bij residunummers 746-750.
    1. Open de EGFR-reeks ΔELREA in Chimera en stem deze uit met de volgorde van de 2GS2-sjabloonstructuur met behulp van het menu Volgorde. Selecteer in het uitlijningsvenster de optie Structuur → Modeller (homologie)28.
    2. Geef in het pop-upvenster de samengestelde structuur 2GS2 op als de sjabloon en de mutantensequentie als de query die moet worden gemodelleerd. Druk dan op OK. Selecteer een mutantmodel uit de resulterende modellen, op basis van de zDOPE-score (meestal de laagste score) en visuele inspectie.
  4. Gebruik PDB-structuur 2ITX29 (2.98 Å) als hoofdstructuur om de ATP-gebonden EGFR-kinase-structuur voor te bereiden. Ontbrekende segmenten bouwen (zie tabel 1) met behulp van de structuren 2GS625 (2.6 Å) en 3W2S volgens de procedure in stap 1.2. Zet de ligand ANP in de resulterende structuur om in ATP door het PDB-bestand te openen in een teksteditor en het N3B-stikstofatoom van ANP te veranderen in een zuurstofatoom.
  5. Open de structuur in stap 1.4 in Chimera zoals vermeld in stap 1.1. Voeg een magnesiumion toe aan deze structuur van PDB-structuur 2ITN29 (2.47 Å) om een vergelijkbare positionering voor de Mg2+ ion te bereiken.
  6. Met de structuur als gevolg van stap 1.5, model de ΔELREA mutant vorm na de stap 1.3.
Apo actieve EGFRApo inactieve EGFRATP-gebonden actieve EGFR
Hoofdstructuur2GS22GS72ITX
Structuren die worden gebruikt om ontbrekende lussen te bouwen1M14 (723-725)3W2S (958-984)2GS6 (862-865)
3W2S (967-981)4HJO (848-850)3W2S (990-1001)

Tabel 1: Structuren die worden gebruikt om composietmodellen van apo-actieve, apo-inactieve en ATP-gebonden actieve structuren te bouwen. Ontbrekende gebieden (aminozuurbereik tussen haakjes) in de hoofdstructuur werden opgebouwd uit de genoemde structuren.

  1. Open PDB-structuur 2GS725 (2.6 Å) als in stap 1.1 om de in actieve EGFR-kinasestructuur van het wildtype voor te bereiden en de gebonden liganden en kristallografische wateren te verwijderen. Voeg de ontbrekende segmenten in 2GS7 (zie tabel 1)van structuren 3W2S en 4HJO30 (2.75 Å) toe volgens de procedure in stap 1.2. Bereid het mutantmodel op basis van de uiteindelijke inactieve EGFR-structuur volgens de procedure in stap 1.3.
    OPMERKING: Voor de A702V mutatiestudie wordt de EGFR asymmetrische dimerstructuur bestudeerd omdat de mutatie zich bevindt in het juxtamembrane B-segment van het kinase-domein dat een groot deel van de dimer-interface vormt. De wild-type en A702V mutant EGFR structuren zijn bereid als volgt:
  2. De wild-type asymmetrische dimer structuur is opgebouwd uit PDB structuur 2GS2, die in eerste instantie wordt weergegeven in de monomerische vorm. Als u wilt converteren naar de biologische assemblage die de activator en ontvanger kinases bevat in de asymmetrische opstelling, opent u 2GS2 in Chimera als in (1.1) en voert u symmetrieberekeningen uit door te klikken op het menu Tools → Structuur van hogere orde → Unit Cell. Selecteer de 2GS2-structuur en voer Kopieën makenin. Selecteer en sla ten slotte één asymmetrische dimer op uit de meerdere kopieën van de dimer als gevolg van de symmetriebewerkingen.
  3. Met behulp van de wild-type asymmetrische EGFR structuur van stap 1.8, bouwen van de A702V mutant door het vervangen van Alanine 702 met valine met behulp van de Tools → Structure editing → Rotamers optie in Chimera.
    OPMERKING: Gezamenlijk worden zes monomeere en twee dimerische EGFR-structuren voorbereid voor respectievelijk de ΔELREA- en A702V-mutatiestudies. Elke structuur wordt vervolgens verwerkt voor simulatie met behulp van de eiwitpreparaat wizard in de Maestro programma31 en MD simulaties worden gemaakt met de Amber programma32.
  4. Open de structuur in Maestro met de optie Bestand → importstructuur. Klik vervolgens op de wizard-knop voor eiwitbereiding en selecteer het volgende: voeg waterstofatomen toe, bouw ontbrekende zijketenatomen, bepaal protonatietoestanden van ionizable residuen bij pH 7.0 met propka, optimaliseer de oriëntatie van asperine, glutamine en histidineresiduen voor waterstofbinding en minimaliseer uiteindelijk de structuur.

2. Systeeminstelling

  1. Open het sprongprogramma dat is opgenomen in het Amber-softwarepakket. Importeer de ff14SB krachtveld33 (source leaprc.protein.ff14SB) en TIP3P watermoleculen34 (bron leaprc.water.tip3p). Voor de ATP-gebonden systemen ook importeren parameters voor ATP35 (loadamberparams frcmod.fosfaat, loadamberprep ATP.prep). Laad vervolgens de structuur(mol = loadpdb structure.pdb).
  2. Solvate de structuur in een octahedrale doos met expliciete TIP3P watermoleculen die 10 Å in alle richtingen uitbreidt van de oppervlakteatomen van het eiwit(solvateoct mol TIP3PBOX 10.0).
  3. Controleer het ingebouwde systeem (Check mol)en neutraliseer het door het toevoegen van noodzakelijke ionen(addions mol Na + 0). Om biomoleculaire systemen voldoende te modelleren, voeg extra Na+/Cl- atomen toe aan de simulatiebox om de zoutconcentratie van het systeem op 0,15 M te brengen(addions mol Na+ X, addions mol Cl- X), waarbij X wordt vervangen door het resultaat van: gewenste zoutconcentratie * aantal watermoleculen * volume per watermolecuul * Avogadro's nummer.
  4. Het genereren en opslaan van de topologie en coördineren van bestanden van het systeem, die dienen als input voor de daaropvolgende productie simulatie(saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).

3. Moleculaire dynamicasimulatie

  1. Met behulp van Amber, in eerste instantie onderwerpen het simulatiesysteem tot 5000 cycli van steilste afdaling en vervoegen gradiënt energie minimalisering om ongunstige configuraties te omzeilen. Voer de minimalisering in meerdere stappen uit en verlaag geleidelijk de bevestiging die op oplosatomen wordt toegepast van 25 kcal mol-1 Å-2 tot 0 kcal mol-1 Å-2.
    1. Pas in het minimalisatie-invoerbestand min.inde maximale variabele aan voor de totale minimalisatiecyclus (maxcyc = 5000) en ncyc om het aantal cycli voor het steilste afdalingsalgoritme te statuseren. Gebruik de restraint_wt variabele om de beveiligingskracht toe te passen op oplostomen die zijn gespecificeerd door de parameter restraintmask. Voer vervolgens de minimalisatie als volgt uit:
      $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd
      OPMERKING: De gebruikte strategie en werkelijke parameters kunnen variëren afhankelijk van de eigen voorkeuren. Details en begeleiding zijn te vinden in de Amber handleiding en website (https://ambermd.org/index.php)
  2. Verwarm het systeem voor 100 pk van 0 K tot 300 K instelling een 10 kcal mol-1 Å-2 terughoudendheid op solute atomen. Stel hiervoor tempi = 0,0, temp0 = 300,0, dt = 0,002 ps, nstlim = 50000 en restraint_wt = 10 in het heat.in invoerbestand in. Voer de verwarming uit met de volgende opdracht:
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
  3. Equilibrate het systeem voor 900 ps onder een NPT ensemble; constant aantal atomen, temperatuur (temp0 = 300,0) en druk (ntp = 1), het regelen met de Berendsen methode (ntt = 1). Stel een 9 Å afstand cutoff(cut = 9.0) voor lange afstand elektrostatische interacties. Verlaag geleidelijk de beperking van het atoom oplosmiddel tot 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Voer het equivalentsedangbestand uit equil.in dat de bovenstaande parameters als volgt beschrijft:
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
  4. Rond het evenwicht af met een ongebreidelde 5 ns simulatie (set dt = 0,002 ps, ntslim = 2500000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
  5. Controleer of het systeem in evenwicht is door de temperatuur, druk, dichtheid en energiewaarden te onderzoeken.
    $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out
    xmgrace samenvatting. TEMP/DENSITY/ETOT/EPTOT/EKTOT
  6. Voer de productiesimulatie uit voor 100 ns (set dt = 0,002 ps, ntslim = 50000000 in prod.in)en bewaar conformaties om de 10 ps (ntwx = 5000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst

4. Analyse

  1. Visuele inspectie
    1. Visualiseer de conformaties die worden bemonsterd tijdens de wild-type en mutant EGFR kinase simulaties door het openen van de X.prmtop amber topology bestanden en de bijbehorende prod.mdcrd traject bestanden in VMD36. Met behulp van handige secundaire structuur representaties, analyseren van de algehele structurele dynamiek van de eiwitten uit het opgenomen traject. Bekijk specifieke interacties tussen atomen/resten van belang, zoals de katalytisch essentiële K745 - E762 zoutbrug.
    2. U ook meerdere conformaties opslaan die tijdens de simulatie in PDB-indeling zijn bemonsterd en deze openen met het Chimera-programma. Plaats de structuren op de oorspronkelijke of mediane structuur met behulp van de optie MatchMaker. Geef de initiële/mediaanstructuur weer in vaste en de rest van de uitgelijnde structuren in vervaagd wit. Deze aanpak maakt het mogelijk om de opgenomen structurele bewegingen met meer helderheid te visualiseren.
      OPMERKING: Suggesties voor effectieve representaties en verwerking van conformatieensembles van MDS zijn te vinden in Melvin et al.37.
  2. RMSD- en RMSF-analyse
    1. Reken met de berekeningen van het Cpptraj-programma 38 om de globale stabiliteit van de eiwitten te analyseren en de flexibiliteit van de verschillende structurele eenheden te analyseren. Geef in de rmsd.in en rmsf.in invoerbestanden de backboneatomen (voor RMSD) en Cα-atomen (voor RMSF) van de oorspronkelijke structuur aan als referentie voor RMS-fitting. In de rmsd/rmsf.in bestanden importeren de amber topologie bestanden(parm X.promtop) en de bijbehorende trajectbestanden(trajin prod.mdcrd). Voer vervolgens het commando Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Plot de uitvoergegevens voor analyse.
    2. U ook conformatieensembles uitlijnen en elk residu kleuren op basis van het Cα-atoom RMSD. Open hiervoor de conformaties in Chimera en stem deze uit met de optie Matchmaker.
      1. Ga naar Gereedschappen → afbeelding → renderen op attribuut. Selecteer Resten van het conformatieensemble en Cα RMSD als de kenmerken en klik op OK. Het kettingspoor van de conformaties wordt dan gekleurd van blauw → witte → rood, respectievelijk als gevolg van gebieden met een hoge, gemiddelde en lage structurele stabiliteit.
  3. Waterstofobligatie-analyse
    1. Analyseer de waterstofbindingsinteractie tussen ATP en wild-type/ΔELREA EFR's. Bereid een Cpptraj script, hbond.in, om deze taak uit te voeren. Definieer een waterstofbinding met een donor-acceptor afstand van minder dan of gelijk aan 3,5 Å en een bindingshoek van meer dan of gelijk aan 135°. Specificeer alleen de analyse voor intermoleculaire waterstofbindingen met de nointramol variabele d.w.z. waterstofbindingen tussen ATP en EGFR(hbond All nointramol dist 3.5 out nhb.agr avghb.dat). Voer het script als Cpptraj -i hbond.in.
    2. Gebruik dit script om intramoleculaire interacties te beoordelen, bijvoorbeeld tussen residuen K745 en E762, die belangrijke residuen zijn voor EGFR kinase-activiteit. Om dit te doen, specificeren K745 als de waterstof obligatie donor en E762 als de waterstof obligatie acceptor in hbond.in en voer het script dienovereenkomstig.
  4. Het bewaken van de afstand tussen atomen
    1. Meet de afstand tussen K745 en E762 door de trajecten van wildtype en ΔELREA apo-EFER's in VMDte openen . Selecteer de Cδ van Glu762 en Nz van Lys745 door te klikken op Muis → label → binding. Monitor de afstand tijdens de simulatie door een grafiek samen te plotten met grafische → labels → binding → grafiek.
  5. Gratis energieberekeningen
    1. Voor het berekenen van de geschatte bindende vrije energieën tussen ATP en wild-type /ΔELREA EFR's, en tussen de activator en ontvanger kinases van wild-type/A702V EFV's, gebruik maken van de moleculaire mechanica gegeneraliseerde Born oppervlakte (MM-GBSA) module39 beschikbaar in het AMBER-pakket. Stel ATP in als ligand en EGFR als de receptor in de ΔELREA-studie. Geef in de A702V-studie de ontvanger kinase op als de ligand en de activator kinase als de receptor.
    2. Bereid eerst de ligand,receptor en ligand-receptor complexe PDB-bestanden afzonderlijk in het sprongprogramma voor dat de PBRadii-waarde op mbondi2 instelt. Bewaar voor de PDB-bestanden de ambertopologie van de gasfase (.prmtop) en coördineer (.inpcrd) bestanden.
    3. Vervolgens,in het mmgbsa-invoerbestand, mmgbsa.in , igb = 2, saltcon = 0.1. Voer bindende energieberekeningen uit met behulp van de trajecten van de simulaties, de voorbereide receptor/ligand amberbestanden en de parameters in de mmgbsa.in met het MMPBSA.py script dat beschikbaar is in Amber als volgt:
      $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
    4. Analyseer de uitvoergegevens, output.csv, door grafieken uit te plotten.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol werd gebruikt om de structurele effecten van de ΔELREA- en A702V-mutaties op de EGFR-kinasestructuur te bestuderen. Een toepassing van het protocol was het onderzoeken van het effect van de mutaties op de lokale structurele /conformatiestabiliteit door het berekenen van RMSD- en RMSF-waarden uit de MD-simulaties. Aangezien de A702V-mutatie zich bevindt in het juxtamemembrane B-segment, werd de RMSD van dit segment van de ontvanger kinase ten opzichte van de startstructuur berekend voor zowel de wild-type als A702V EGFRs. Het resultaat (figuur 4A) bleek dat het juxtramembrane B-segment van de mutant de conformatiestabiliteit heeft verhoogd tijdens de 100 ns-simulatie (gemiddelde RMSD 0,7 Å - 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 0,009) in vergelijking met het wildtype EGFR kinase-domein (gemiddelde RMSD 1,1 Å - 95% CI 0,01). Dit is zeer waarschijnlijk het gevolg van de strakkere hydrofobe interacties aan de dimer interface als gevolg van vervanging van alanine 702 (methylgroep zijketen) aan een omvangrijker hydrofobe residu, valine (isopropyl groep zijketen), wat leidt tot verhoogde hydrofobe interacties van V702 op de ontvanger kinase domein met isoleucine 941 van de activator kinase domein.

De ΔELREA-mutatie bevindt zich in de β3-αC-lus, grenzend aan de functioneel kritische αC-helix; de bevleesdheid van de αC-helix is de sleutel tot verschuivingen tussen de actieve en inactieve toestanden van de EGFR kinase. De conformatiestabiliteit van de αC-helix in de actieve toestand werd beoordeeld door het RMSF te onderzoeken over de Cα-atomen van residuen in de helix tijdens MD-simulaties (figuur 4B):in het algemeen, er zijn lagere schommelingen in de mutant (gemiddelde RMSF 1.1 Å - 95% CI 0.4) in vergelijking met het wilde type (gemiddelde RMSF 1.5 Å - 95% CI 0.57); met het hoogste verschil in schommelingen voor de N-terminal residuen. De bemonsterde conformaties die respectievelijk zijn geplaatst op de mediane structuur van het kinasedomein van het wildtype en van het ΔELREA kinase-domein ondersteunen ook deze resultaten (figuur 4C):zowel de wildtype- als de ΔELREA-kinasedomeinen hebben over het algemeen dezelfde stabiliteit voor de boven elkaar geplaatste conformaties, met uitzondering van de β3-αC-lus en de αC-helix, die duidelijk stabieler zijn in ΔELREA EGFR. Deze bevindingen wijzen erop dat het verwijderen van de ELREA-sequentie de beweging van de actieve toestand αC-helix beperkt, waardoor de actieve bevleesdheid wordt beperkt en dus wordt gestabiliseerd. Aangezien de αC-helix deel uitmaakt van de asymmetrische dimerinterface, zouden de beperkingen op de αC-helix in de mutant bovendien zeer waarschijnlijk het asymmetrische dimer stabiliseren, waardoor de duur van de geactiveerde toestand wordt verlengd.

Een andere toepassing van het protocol is het onderzoeken van het gedrag van belangrijke intra- en intermoleculaire interacties die plaatsvinden tijdens de simulatie. De interactie tussen K745 en E762, die van fundamenteel belang is voor de enzymatische activiteit van EGFR, werd geanalyseerd voor zowel de actieve vorm wild-type en ΔELREA EGFR kinase door het meten van de procentuele bezetting van waterstof bindingen gevormd tussen de zijketen polaire atomen van de twee residuen tijdens de MD simulaties (Figuur 15A): deze belangrijke elektrostatische interactie werd vaker gevormd in het ΔELREA kinase domein in vergelijking met het wild-type kinase domein, als gevolg van de meer stabiele αC helix die geschikt is voor E762. De interacties tussen Mg2+-ATP en de wild-type en ΔELREA EGFR kinase domeinen (figuur 5B) tijdens de simulatie werden ook beoordeeld (Figuur 5C): het aantal waterstofbindingen waren groter voor 1ΔELREA (gemiddelde waarde 4,0 - 95% BI 0,03) dan voor de wild-type EGFR (gemiddelde waarde 3,2 - 95% BI 0,04). Verdere analyse van de waterstofbindingen toonde aan dat K745 vaker interageert met de fosfaatgroepen van ATP in ΔELREA EGFR, die gekoppeld is aan de stabielere K745-E762-interactie die wordt opgemerkt in de simulatie van het ΔELREA gemuteerde EGFR kinase-domein.

MD simulaties zoals beschreven in het protocol zijn ook nuttig bij het beoordelen van de relatieve vrije energie van binding voor eiwit-eiwit en eiwit-ligand interacties. De bindende energieën tussen de activator- en ontvangerkinasedomeinen van wildtype en A702V EFV's, en tussen ATP en het wildtype en de ΔELREA gemuteerde EGFR kinase-domeinen; werden berekend op grond van moleculaire mechanica gegeneraliseerde Born oppervlakte (MMGBSA) berekeningen (Figuur 6A): de A702V mutant produceerde een lagere gemiddelde ΔGbindwaarde (gemiddelde ΔGbinding = -76 kcal/mol - 95% CI 0,47), wat gunstiger dubbeltje interacties, in tegenstelling tot de wilde-type EGFR domein (gemiddelde ΔGbinding = -61 kcal/mol - 95% CI 0,61). Deze observatie komt overeen met het stabielere juxtamembrane B-segment en de strakkere dimer-interface als gevolg van verhoogde hydrofobe interacties waargenomen voor het A702V EGFR kinase-domein. In het geval van ATP-binding aan de wild-type en ΔELREA EGFR kinase domeinen (Figuur 6B), MMGBSA berekeningen voorspellen sterkere ATP binding met de ΔELREA mutant (gemiddelde ΔG bind -0 57 kcal/mol - 95% BI 0,43) in vergelijking met wild-type EGFR (gemiddelde ΔGbind -48 kcal/mol - 95% CI 0.33).bind Dit resultaat is in overeenstemming met het grotere aantal waterstofbindingen tussen ATP en ΔELREA EGFR (figuur 5C) in vergelijking met het wild-type domein.

Het protocol kan ook worden gebruikt om conformatieveranderingen te onderzoeken die tijdens een simulatie worden waargenomen. In het huidige onderzoek werden de effecten van de ΔELREA-mutatie op de inactieve EGFR-conformatie bestudeerd door visuele inspectie en superpositionering van de bemonsterde conformaties van de simulatie. De analyse bracht een innerlijke beweging van de αC-helix aan het licht in het ΔELREA EGFR kinase-domein (figuur 7A), een structurele verandering die wordt verwacht tijdens de overgang naar de actieve toestand. De αC-helix van het wilde type inactieve EGFR behield daarentegen zijn aanvankelijke conformatie (figuur 7B). Zo ondersteunen de MD-simulaties het voorstel dat de schrappingsmutatie, die experimenteel wordt getoond om kinaseactiviteit40,41,te verhogen, een conformatieverschuiving bevordert van de inactieve kinase naar de actieve toestand.

figure-results-1
Figuur 4: Wild-type en mutant conformatie stabiliteit van de actieve EGFR kinase domein tijdens MD simulaties. (A) RMSD (backbone atomen) over het juxtamembrane B-segment van het wildtype (blauw) en A702V (rood) ontvanger kinase-domein. (B) RMSF (Cα-atomen) over residuen van de αC-helix: wildtype (blauw) en ΔELREA (goud). c) bemonsterde bemonsterde conformaties van wildtype (links) en ΔELREA (rechts) EGFR kinase-domein; kettingsporen gekleurd op basis van RMSD (Cα atomen) van elk residu met betrekking tot de mediaanstructuur. Kleuren varieert van blauw tot wit tot rood, wat neerkomt op gebieden met een hoge tot lage conformatiestabiliteit. Houd er rekening mee dat de "gratis" N-terminal-gebieden van het geïsoleerde kinase-domein, rood gekleurd, dit niveau van mobiliteit niet zouden vertonen in de intacte EGFR-structuur. Cijfers aangepast aan Chakroborty et al.9 (Figuur 4A gereproduceerd met toestemming van het Journal of Biological Chemistry) en Tamirat et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 5: Belangrijkste kenmerken van de actieve ontvanger kinase tijdens MD simulaties: de K745-E762 zoutbrug, de αC helix en interacties met ATP. (A) Percentage bezetting van de K745-E762 interactie tijdens de simulatie van de wild-type (blauw) en ΔELREA (goud) EGFR kinase domeinen. (B) Residuen van het wilde type en ΔELREA mutant interactie met ATP (stokken). Mg2+ (groen) coördineert met ATP en D855. (C) Het aantal waterstofbindingen gevormd door ATP met zowel de wild-type en ΔELREA EGFR kinase domeinen tijdens MD simulaties. Figuur uit Tamirat et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 6: Lagere relatieve vrije energieën van binding worden waargenomen voor de gemuteerde kinasedomeinen tijdens de simulaties. aA) Bindende energieën berekend voor de interactie tussen de activator en ontvanger kinase domeinen van het wildtype (blauw) en A702V (rode) EFR's. (B) ΔG-binding van ATP aan wildtype (blauw) en ΔELREA (goud) EGFR kinase-domeinen.bind Cijfers aangepast aan Chakroborty et al.9 (Figuur 6A gereproduceerd met toestemming van het Journal of Biological Chemistry) en Tamirat et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 7: Over elkaar geplaatste conformaties van het wildtype en het inactieve EGFR-kinase-domein ΔELREA. Conformatie van de αC helix en A-loop helix van (A) wild-type (mediane structuur in blauw) en (B) ΔELREA EGFRs (goud). Andere bemonsterde conformaties, vervaagd wit; eerste structuren voorafgaand aan de MD simulaties, roze. Figuur uit Tamirat et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschreven in deze studie richt zich op het gebruik van moleculaire dynamica simulaties om lokale en wereldwijde structurele veranderingen die voortvloeien uit het activeren van somatische mutaties van de EGFR kinase domein te onderzoeken. Hoewel röntgenkristalstructuren van wilde en gemuteerde EFR's van onschatbare waarde structureel inzicht bieden, geven ze een of enkele statische voorstellingen weer. Inherent aan de biologische functie van ErbB's is echter de noodzakelijke overgangen tussen de enzymatisch inactieve en actieve tyrosine kinase, waarbij dynamische veranderingen in zowel de structuur als de intramoleculaire interacties tussen kinasemonmeren worden aangezet. MD-simulaties werden dus uitgevoerd om de dynamische aard van het EGFR tyrosine kinase-domein te onderzoeken, inclusief de wild-type structuur, de geïntroduceerde ΔELREA-verwijderingsmutatie en de A702V-mutatie. Deze simulaties waren succesvol in het ophelderen van de waarschijnlijke rol van deze mutaties in de structuren en hoe hun effecten op de bevleesdheid van het tyrosine kinase-domein zouden leiden tot de experimenteel waargenomen toename van de EGFR-kinaseactiviteit.

Een cruciale stap in dit protocol is het gebruik van een relevante structuur om de impact van de mutatie te beoordelen. Een manier om een relevante simulatie-invoerstructuur te selecteren, is door de locatie van de mutatie in de statische 3D-structuur te visualiseren en de mogelijke impact ervan te onderzoeken met betrekking tot de naburige aminozuren en structurele eenheden. In deze studie, bijvoorbeeld, aangezien de A702V EGFR mutatie zich bevindt in het juxtamembrane B-segment dat de asymmetrische dimerinterface vormt, is het gebruik van de dimerstructuur voor de simulatie van cruciaal belang. Het gebruik van een monomerische structuur zou het neven- en orthokoega B-segment van de ontvanger kinase aan het oplosmiddel hebben blootgesteld, waardoor het de stabiliserende interacties, versterkt door de mutatie tot een groter hydrofoob residu en interacties met isoleucine 941, van de C-lobe-residuen van de activator kinase wordt ontnemen. Bovendien is het opmerkelijk dat de 3D-structuur die wordt vertegenwoordigd door de coördinaten in een PDB-bestand niet noodzakelijkerwijs overeenkomt met de biologisch relevante structuur die voor studie moet worden gebruikt. Bijvoorbeeld, met de structuur van ErbB4, PDB-code 3BCE, de PDB coördinaten overeenkomen met een trimer, maar dit is te wijten aan kristal contacten (weinig contacten tussen de monomeren worden gezien bij het visualiseren van deze structuur). Matrices in het PDB-bestand kunnen worden gebruikt (bijvoorbeeld binnen Chimera) om de kristallografisch gerelateerde structuren te reconstrueren, die kunnen worden gevisualiseerd om ketens te identificeren die overeenkomen met de biologisch relevante 3D-structuur zoals gerapporteerd in de oorspronkelijke publicatie42. Een andere essentiële stap van het protocol is het goed voorbereiden van de simulatie-inputstructuur, zoals het bouwen van ontbrekende aminozuren in verschillende lusgebieden, en vooral waar gelegen in de buurt van de mutatie. Hoewel er in het VOB talrijke egfr-structuren van het wildtype bestaan, zijn er slechts een beperkt aantal gemuteerde EGFR-structuren beschikbaar. Daarom moeten ook de gemuteerde structuren worden gemodelleerd; voor één residumutatie zoals A702V werd Chimera gebruikt om het residu te muteren; overwegende dat voor de ΔELREA-schrappingsmutatie Modeller werd gebruikt.

De verschillende parameters die in de simulatie-invoerbestanden worden gebruikt - bijvoorbeeld het aantal minimalisatiecycli, het verwarmen van het systeem tot de gewenste temperatuur in één keer of in plaats daarvan langzaam verwarmen door verschillende tussentemperaturen, de tijdsperiode voor de evenwicht en voor de productiesimulaties - kunnen worden gewijzigd op basis van het molecuul van de studie, het doel van het werk en de eigen voorkeuren. Tijdens het uitvoeren van MD simulaties, is het ook gebruikelijk om te komen over fouten die kunnen voortvloeien uit de invoerbestanden, problemen met betrekking tot de simulatie software in gebruik of zelfs een gebruiker fout. Daarom is het zeer belangrijk om de bron van de fouten te begrijpen door eventuele foutmeldingen zorgvuldig te onderzoeken. De meeste simulatieprogramma's hebben een mailinglijst waar gebruikers vragen kunnen stellen aan de softwareontwikkelaars en aan andere gebruikers waarmee de meeste problemen kunnen worden opgelost. Daarnaast bieden gebruikershandleidingen aanzienlijke hulp bij het begrijpen van de details van het simulatieprotocol, inclusief aannames en beperkingen. Hoewel MD-simulatie een belangrijk hulpmiddel is om de dynamische eigenschappen van moleculen te verkennen, moet u niet vergeten dat de rekenresultaten zorgvuldig moeten worden geëvalueerd in combinatie met andere informatiebronnen om de geldigheid ervan te beoordelen. Werk waar mogelijk samen met onderzoekers die experts zijn op de onderzochte eiwitten, vooral waar relevante experimenteel onderzoek in wet-lab wordt uitgevoerd, die dienen om resultaten te leveren voor structurele interpretatie en om experimenten voor te stellen die kunnen worden gemaakt op basis van structurele waarnemingen om hypothesen te testen.

In deze studie was het protocol effectief in het onderzoeken van de dynamische structurele effecten van de ΔELREA- en A702V-mutaties op de EGFR-kinasestructuren. De simulaties toonden aan dat ΔELREA de functioneel essentiële αC-helix beperkt en een conformatieverschuiving bevordert van de inactieve kinase naar een gestabiliseerde actieve kinase. De simulatieresultaten worden onafhankelijk ondersteund door gegevens over de respons van geneesmiddelen die de effecten van tyrosinekinaseremmers op longkankercellijnen met de ΔELREA-schrappingsmutatie en egfr van het wilde type, waarbij een grotere remming door geneesmiddelen die de actieve kinaseconten werden erkend, werd gemeld voor ΔELREA dan voor wildtype EGFR12. Met de A702V-mutatie geven de MD-simulaties, in vergelijking met het wilde type, een verhoogde stabilisatie van de activator-ontvanger kinase-interface en een hogere affiniteit van de activator en ontvanger kinase voor elkaar aan, samen ter ondersteuning van het onderhoud van de geactiveerde conformatie van de EGFR kinase. De A702V-mutatie, gelegen op het juxtamembrane B-segment van de ontvanger kinase, zou hydrofobe interacties met de activator kinase verhogen, functionerend om de duur van de geactiveerde toestand te verlengen. De A702V mutatie ondersteunt celoverleving bij afwezigheid van groeifactor en werd geïdentificeerd in een in vitro screening op EGFR-mutaties9.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek wordt gefinancierd door subsidies aan M.S.J van de Academie van Finland (308317, 320005), Sigrid Juselius Foundation en Tor, Joe en Pentti Borg memorial fund, en aan K.E. van de Academie van Finland (274728, 316796), de Cancer Foundation van Finland, en het Turku University Central Hospital. M.Z.T. wordt gefinancierd door het Åbo Akademi Doctoral Network of Informational and Structural Biology. Wij danken het CSC IT Center for Science voor de computerbronnen en Dr. Jukka Lehtonen voor de IT-ondersteuning in het kader van het Biocenter Finland bioinformaticanetwerk; en Biocenter Finland structurele biologie infrastructuur netwerk.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amber softwareUniversity of California, San FranciscoVersie 2018Uitvoerbaar
Chimera programmaResource voor Biocomputing, Visualisatie en Informatica aan de University of California, San FranciscoVersie 1.13.1Uitvoerbaar
EGFR structuurbestandenThe Protein Data Bank3D coördinaten van EGFR-structuren
MaestroSchrödinger LLCVersie 2018-3Uitvoerbaar
Modeller programmaThe Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences en Pharmaceutical Chemistry, University of California San FranciscoOpgenomen in het Chimera programma
VMD softwareTheoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-ChampaignVersie 1.9.3Uitvoerbaar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).
  2. Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768(2014).
  3. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).
  4. Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).
  5. Cerami, E., et al. cBioPortal for Cancer Genomics. , https://www.cbioportal.org (2020).
  6. Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).
  7. Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
  8. Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
  9. Chakroborty, D., et al. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).
  10. Leahy, D. J. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).
  11. Roskoski, R. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).
  12. Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814(2019).
  13. Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).
  14. Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).
  15. Soung, Y. H., et al. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).
  16. Tvorogov, D., et al. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).
  17. Hubbard, S. R., Till, J. H. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).
  18. Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).
  19. Jura, N., et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).
  20. Karplus, M., Kuriyan, M., J, Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).
  21. Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).
  22. Reckamp, K. L., et al. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  25. Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).
  26. Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).
  27. Sogabe, S., et al. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).
  28. Sali, A., Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).
  29. Yun, C. H., et al. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).
  30. Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).
  31. Schrödinger LLC. Release 2018-3: Maestro. , https://www.schrodinger.com/maestro (2018).
  32. Case, D. A., et al. AMBER 2018. , University of California. San Francisco. (2018).
  33. Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
  34. Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).
  35. Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).
  36. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
  37. Melvin, R. L., Salsbury, F. R. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).
  38. Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
  39. Miller, B. R., et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).
  40. Guha, U., et al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).
  41. Furuyama, K., et al. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).
  42. Qiu, C., et al. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Molecular Dynamics SimulationEGFR MutationsProtein Structure AnalysisConformational StabilityATP BindingAsymmetric DimerHydrogen Bond AnalysisBinding Free EnergyRoot Mean Square DeviationVisual Molecular Dynamics

Related Articles