Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61155

⸱

15 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiobiology, Faculty of Military Health Sciences in Hradec Kralove, University of Defence, 2Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics, University Hospital, 3Department of Oncology, Thomayer Hospital, Charles University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, Faculty of Medicine, Charles University

In dit artikel

Samenvatting

Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.

Samenvatting

Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen van de celcyclus, die opnieuw worden bedhuisig vóór mitose. Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd met zeer geavanceerde methoden, waaronder transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of met behulp van software voor de automatische detectie van primaire trilharen. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is echter nodig om deze methoden uit te voeren. Deze publicatie beschrijft een protocol voor de eenvoudige detectie van primaire trilharen in vitro door het beitsen van geacetyleerde alfa tubuline (axoneme) en gamma tubuline (basaal lichaam). Dit immunofluorescente kleuringsprotocol is relatief eenvoudig en resulteert in beelden van hoge kwaliteit. Het huidige protocol beschrijft hoe vier cellijnen (C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) die primaire trilharen uitdrukken, werden vastgesteld, immunostained en afgebeeld met een fluorescerende of confocale microscoop.

Inleiding

Primaire trilharen zijn zintuiglijke, solitaire, membraangebonden, niet-moge structuren geassocieerd met de moeder van de cel centriole. Primaire trilharen worden gevonden op de meeste gewervelde cellen, met uitzondering van rode bloedcellen, adipocyten1, en hepatocyten2. Primaire trilharen worden gevormd als een langwerpig axoneme samengesteld door microtubuli, waarvan de belangrijkste component α-tubuline is. De axoneme groeit uit het basale lichaam, dat is gestructureerd uit γ-tubuline. De lengte van de primaire trilharen varieert tussen 2-10 μm; de afmetingen kunnen echter veranderen tijdens glycyleratie, honger, hypoxie, cytotoxische stress of na blootstelling aan ioniserende straling3,4,5,6,7. Meestal hebben cellen slechts één primair cilium, dat betrokken is bij morfogenese en celsignaleringstrajecten die belangrijk zijn voor celproliferatie en differentiatie8,9.

Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen, en resorbed voordat ze mitose ingaan in een proces dat gepaard gaat met tubuline-deacetylatie bemiddeld door HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Het exacte moment van primaire cilia resorptie is afhankelijk van het celtype en de expressie van genen die direct betrokken zijn bij dit proces, zoals Aurora A, Plk1, TcTex-11111,12,13. Afhankelijk van het celtype, de primaire trilharen uitdrukken verschillende soorten receptoren, ionkanalen, en actieve signalering trajecten. Deze omvatten de belangrijkste signaleringreceptoren die proliferatie en overleving beïnvloeden, EGFR, PDGFR en FGFR. Ook inbegrepen zijn enkele van de signalering trajecten die de functie van een of meer organen kunnen beïnvloeden, met inbegrip van Hedgehog, Notch, en Wnt. Dankzij deze receptoren en signalering trajecten, de primaire trilharen ook een chemosensorische functie uit te voeren. Deze functie maakt het mogelijk primaire trilharen om specifieke liganden voor Notch, hormonen, en biologisch actieve stoffen zoals serotonine of somatostatine detecteren. Andere specifieke functies tentoongesteld door primaire trilharen van verschillende lengtes zijn reactie op veranderingen in temperatuur, zwaartekracht en osmolaliteit14.

Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd door middel van verschillende methoden, zoals live visualisatie, transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of door software voor de automatische detectie van primaire trilharen5,,15,,16,17. Echter, deze methoden zijn zeer gespecialiseerd en voortdurend onderzoek moet fundamentele, snelle en eenvoudige methoden voor het beitsen van primaire trilharen in elke fase van het onderzoek. Beschreven is een eenvoudige en nuttige methode voor de detectie van primaire trilharen in gekweekte cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van cultuurmedia, oplossingen en gerechten

  1. Autoclave de coverslips (22 x 22 mm). Bereid 6 goed platen. Dooi foetaal runderserum (FBS) en antibiotica penicilline/streptomycine en verwarmen het kweekmedium tot kamertemperatuur (RT). Gebruik trypsin-EDTA (0,25%) en 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium) om de cellen door te geven.
  2. Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) voor in dH2O (800 mg PFA in 20 mL dH2O). De PFA moet voor elk experiment vers worden bereid. Roer en verwarm de oplossing op 55 °C gedurende 30 minuten in de kap. Koel af bij RT. Voeg 1 M natriumhydroxide toe totdat de oplossing duidelijk wordt (pH = 7.2–7.4). Bewaar tot 1 week bij 4 °C.
    Opmerking: PFA is giftig; draag altijd voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen en bereid u voor in de chemische kap.
  3. Bereid 500 mL cultuurmedia, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 2% glutamine.
  4. Bereid 13 mL van 1% gelatineoplossing in steriele dH2O (130 mg gelatine in 13 mL dH2O). Gebruik 2 mL van 1% gelatine voor elke put in een 6 put plaat. Blijf steriel.
  5. Reinig de laminaire stroomkap met 70% ethanol. Plaats het benodigde materiaal in de laminaire stroomkap voordat u met het experiment begint.

2. Celkweek voor immunocytochemie kleuring

  1. Ontdooi de cellen (in deze studie C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) met behulp van standaardtechnieken en plaat ze in een T75 kolf aangevuld met ~ 10-12 mL van de voorbereide media. Incubeer bij 37 °C/5% CO2/90% relatieve vochtigheid (RH) tot de cellen 70% samenvloeiing bereiken.
  2. Verwijder de cellen uit de couveuse en plaats ze in de laminaire stroomkap. Verwijder de kweekmedia en spoel de cellen kort 2x met 1x PBS. Voeg ~2 mL van 0,25% trypsin-EDTA toe aan de T75-kolf en incubeer bij 37 °C voor ~5 min. Controleer periodiek op de omgekeerde microscoop om celloslating te controleren.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de cellijn en moet daarom empirisch worden bepaald.
  3. Voorzichtig resuspend de cellen in 10 mL van de cultuur media, pipetting zorgvuldig om een enkele cel suspensie te creëren. Spoel de kolf indien nodig opnieuw af.
  4. Plaats de celsuspensie in een conische buis van 50 mL en centrifuge gedurende 5 minuten op ~200 x g. Decanteer de supernatant, voeg 10 mL cultuurmedia toe en verbouw de pellet voorzichtig. Neem 20 μL van de celsuspensie en meng in een 1:1-verhouding met trypanblauw en tel in een cytometer volgens de standaardmethode.
  5. Plaats een coverslip in elke put van een 6 goed plaat met behulp van een pincet. Coat de coverslips met gelatine door het gieten ~2 mL in de putten. Dit zal helpen de cellen hechten aan de coverslips. Verwijder de gelatineoplossing en laat de lucht enkele minuten drogen. De coverslips zijn nu klaar voor de teelt van de cellen. Start de teelt onmiddellijk.
  6. Zaad 100.000 fibroblasten in elke put en voeg 2 mL van cultuur media. De cellen 24 uur uitbroeden bij 37 °C/5% CO2/90% RH. Op dit punt kunnen de cellen worden behandeld op basis van de behoeften van de gebruiker. Behandelingen om ciliatie te veroorzaken zijn eerder beschreven4,5.
    OPMERKING: Het initiële zaainummer is afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellen en moet dienovereenkomstig worden bepaald.

3. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen in vitro

  1. Verwarm de 4% paraformaldehyde tot RT. Bereid Pasteur pipetten, 1x PBS (RT), afvalcontainer, 15 mL conische buizen, micropipettes (0,5–10 μL, 20-200 μL en 100-1.000 μL) en tips. Neem de cellen uit de couveuse en leg ze in de bank.
    OPMERKING: De kleuringsprocedure hoeft niet in steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Alle oplossingen moeten bij RT zijn.
  2. Verwijder media uit elke put. Laat de hoezen in de put. Was de cellen 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Voeg met behulp van een Pasteur pipet 2 mL van 4% PFA toe in elke put om de cellen te fixeren. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de PFA en was 3x met 1x PBS.
    LET OP: Gebruik altijd een voldoende volume om het volledige dekvlak tijdens de incubatieperioden te dekken. Laat de cellen nooit drogen. Giet nooit een van de oplossingen direct op de coverslip.
  3. Bereid 0,5% Triton X-100 voor in 13 mL van 1x PBS 10 min voor gebruik. Voeg 2 mL in elke put. Incubeer gedurende 15 minuten. Was voorzichtig 4x met 1x PBS.
    OPMERKING: Triton X-100 is onoplosbaar in PBS bij RT. Verwarm de 0,5% Triton X-100 oplossing tot 37 °C in een waterbad om het op te lossen.
  4. Dooi geitenserum 5 min voor gebruik. Verdun het geitenserum in 1x PBS in een 1:20 verhouding als blokkerende oplossing. Voeg 150 μL toe aan elke coverslip en incubbate gedurende 20 minuten bij RT.
    LET OP: Verleng de blokkeringsperiode indien nodig tot 60 min. Was de cellen niet na het blokkeren met geitenserum.
  5. Ontdooi de primaire antilichamen (d.w.z. anti-acetylated alfa tubuline en anti-gamma tubuline) 5 min voor gebruik. Verdun de antilichamen afzonderlijk in 1x PBS als volgt: muis anti-acetylated alpha tubulin in een 1:800 verhouding en konijn anti-gamma tubuline in een verhouding van 1:300. Verwijder de blokkeringsoplossing. Niet wassen. Voeg 150 μL van beide antilichaamverdunningen toe aan de coverslips en incubeer gedurende 60 minuten bij RT.
    OPMERKING: Als het uitbroeden 's nachts 500-1.000 μL van de primaire antilichaamoplossingen gebruikt, sluit u de 6 putplaat af met paraffinefolie en bewaar u bij 4 °C. U ook 150 μL antilichaam gebruiken en incubeer in een vochtigheidskamer.
  6. Verwijder de primaire antilichamen. Was de covers 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Bereid de secundaire antilichamen in 1x PBS door afzonderlijk verdunnen Cy3 schapen anti-muis en Alexa Fluor488 geit anti-konijn in een 1:300 verhouding. Voeg 150 μL van beide secundaire antilichaamverdunningen toe aan de coverslips. Incubeer voor 45 minuten op RT in het donker.
    OPMERKING: Incubeer in het donker om fotobleaching te voorkomen. Andere combinaties van secundaire antilichamen kunnen naar behoefte worden gebruikt.
  7. Bereid een DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het overtollige aliquots op -20 °C. Verdun 10 μL uit een voorraad aliquot (1:5.000) in 50 mL van 1x PBS. Voeg 2 mL van deze verdunning toe aan de coverslips. Incubeer voor 5 minuten op RT in het donker.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de cellen in het donker uit te broeden om fotobleekt te voorkomen. De DAPI verdunning kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
  8. Bereid 2 naalden, dia's, pincet en montagemedia. Label de dia's.
  9. Verwijder de DAPI-oplossing uit de putten. Was 3x met 1x PBS. Zet een druppel montagemedia op elke dia. Gebruik de naald om de coverslip voorzichtig van de bodem van de put te tillen. Draai de coverslip met behulp van de pincet en plaats het voorzichtig over de druppel montagemedia. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels.
  10. Bescherm de dia's tegen licht en bewaar ze 's nachts op 4 °C.
  11. Gebruik een fluorescerende of confocale microscoop met hoge vergroting om de primaire trilharen te visualiseren.
    LET OP: De dia's kunnen maximaal 2 maanden in het donker bij 4 °C worden bewaard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van hoge kwaliteit. In deze experimenten werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, in een fluorescerende of confocale microscoop in beeld gebracht volgens het hierboven beschreven protocol. Het primaire cilium werd gedetecteerd met behulp van acetylated α-tubuline en γ-tubuline. De evaluatie van primaire trilharen kan op verschillende niveaus worden uitgevoerd en elke verandering in dit verban...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende auteurs hebben diverse methoden beschreven voor de detectie van primaire trilharen, soms ook het beschrijven van verschillende fixatiemethoden die hun detectie kunnen beïnvloeden6,20,21,22. Hoe dan ook, het is moeilijk om een compleet en eenvoudig protocol voor detectie te vinden. De beschikbaarheid van een dergelijke methode zou ongetwijfeld van grote hulp zijn voor de studie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie van de Tsjechische Republiek - Langetermijnorganisatie ontwikkelingsplan Medische aspecten van massavernietigingswapens van de faculteit Militaire Gezondheidswetenschappen, Universiteit van Defensie; het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport, Tsjechië (Specifiek Onderzoeksproject nr: SV/ FVZ201703) en PROGRES Q40/06. Dank ook aan Daniel Diaz voor zijn vriendelijke hulp in het Engels taalrevisie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6-well plateTPP92406Afmetingen 128x86x22 mm
Alexa Fluor488Jackson ImmunoResearch111-546-047AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γSigma-AldrichT5192Polyklonaal Konijn anti-Muis IgG2a
C2C12ATCCCRL-1772Myoblast (muis)
Cy3Sigma-AldrichC2181Anti-Muis IgG (heel molecuul) F(ab′)2 fragment–Cy3 antilichaam geproduceerd in schapen
Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride)Sigma-AldrichD9542
Dulbecco´s Gemodificeerd Eagle-mediumThermo Scientific11960044Hoge glucose, Geen glutamine, Gibco
Dulbecco’s Fosfaat Gebufferde SalineSigma-AldrichD8662Met MgCl2 en CaCl2, Sterile-gefilterd, Geschikt voor celcultuur
Fetaal RundserumThermo Scientific16000044Sterile-gefilterd, Gibco
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
MEFATCCSCRC-1039Muis embryonale fibroblast
Monoklonaal Anti-Acetylerd TubulineSigma-AldrichT7451Monoklonaal Anti-Acetylerd Tubuline antilichaam geproduceerd in muis
NHLFLonzaCC-2512Primaire longfibroblasten (mens)
Normaal GeitenserumJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500GPoeder
Penicilline-StreptomycineSigma-AldrichP078110.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine per mL in 0,9% NaCl, Sterile-gefilterd
ProLong Diamond Antifade MountantThermo ScientificP36961
HuidfibroblastenVriendelijk geschonken van Charles University, Faculteit Geneeskunde in Hradec Králové.
Vierkante DekglasjesThermo Scientific22X22-1.5Borosilicaat glas, 22x22mm, Vierkant
Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
Trypsine-EDTA (0,25%)Thermo Scientific25200072Sterile-gefilterd, Gibco

Referenties

  1. Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
  2. Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
  3. Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
  4. Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
  5. Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
  6. Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
  7. Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
  8. Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
  9. Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
  10. Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
  11. Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
  12. Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
  13. Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
  14. Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
  15. Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
  16. Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
  17. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
  18. Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
  20. Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
  21. Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
  22. Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
  23. Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
  24. Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
  25. DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ImmunofluorescentiekleuringGeacetyleerd alfa tubulineGamma tubulineCelfixatieFluorescentiemicroscopieConfocale microscopieCelkweekAntilichamenkleuringMontage medium
Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.