Methodenartikel

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

10 mei 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

In dit artikel

Samenvatting

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (<50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Samenvatting

De isolatie van ventriculaire cardiale myocyten van dierlijke en menselijke harten is een fundamentele methode in hartonderzoek. Dierlijke cardiomyocyten worden vaak geïsoleerd door coronaire perfusie met spijsverteringsenzymen. Echter, isoleren van menselijke cardiomyocyten is een uitdaging, omdat menselijke myocardiale specimens meestal niet toestaan voor coronaire perfusie, en alternatieve isolatie protocollen resulteren in slechte opbrengsten van levensvatbare cellen. Bovendien zijn menselijke myocardiale specimens zeldzaam en alleen regelmatig verkrijgbaar bij instellingen met een hartoperatie ter plaatse. Dit belemmert de vertaling van bevindingen van dierlijke naar menselijke cardiomyocyten. Hier beschreven is een betrouwbaar protocol dat een efficiënte isolatie van ventriculaire myocyten van menselijke en dierlijke myocardium mogelijk maakt. Om de verhouding tussen oppervlakte en volume te verhogen terwijl celschade wordt geminimaliseerd, worden myocardiale weefselschijfjes van 300 μm dik gegenereerd uit myocardmonsters met een vibratome. Weefsel plakjes worden vervolgens verteerd met protease en collagenase. Rat myocardium werd gebruikt om het protocol vast te stellen en de opbrengsten van levensvatbare, calciumtolerante myocyten te kwantificeren door flow-cytometrische celtelling. Vergelijking met de veelgebruikte weefselbrokmethode toonde aanzienlijk hogere opbrengsten van staafvormige cardiomyocyten (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Het protocol werd vertaald naar falend en niet-falend menselijk myocardium, waar de opbrengsten vergelijkbaar waren met rattenanocardium en, nogmaals, aanzienlijk hoger dan bij de weefselbrokmethode (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 cellen/mg, p < 0,05). Met name met het gepresenteerde protocol is het mogelijk om redelijke aantallen levensvatbare menselijke cardiomyocyten (9-200 cellen/mg) te isoleren van minimale hoeveelheden weefsel (<50 mg). Zo is de methode van toepassing op gezonde en falende myocardium van zowel menselijke als dierlijke harten. Bovendien is het mogelijk om prikkelbare en contractiele myocyten te isoleren van menselijke weefselmonsters die tot 36 uur zijn opgeslagen in koude cardioplegische oplossing, waardoor de methode bijzonder nuttig is voor laboratoria bij instellingen zonder hartchirurgie ter plaatse.

Inleiding

Een rudimentaire techniek die de weg heeft vrijgemaakt voor belangrijke inzichten in cardiomyocyte fysiologie is de isolatie van levende ventriculaire cardiomyocyten uit intacte harten1. Geïsoleerde cardiomyocyten kunnen worden gebruikt om de normale cellulaire structuur en functie te bestuderen, of de gevolgen van in vivo experimenten; bijvoorbeeld om veranderingen in cellulaire elektrofysiologie of excitatie-contractiekoppeling in diermodellen van hartziekten te beoordelen. Bovendien kunnen geïsoleerde cardiomyocyten worden gebruikt voor celkweek, farmacologische interventies, genoverdracht, weefselmanipulatie en vele andere toepassingen. Daarom zijn efficiënte methoden voor cardiomyocytenisolatie van fundamentele waarde voor fundamenteel en translationeel cardiale onderzoek.

Cardiomyocyten van kleine zoogdieren, zoals knaagdieren, en van grotere zoogdieren, zoals varkens of honden, worden vaak geïsoleerd door coronaire perfusie van het hart met oplossingen die ruwe collagenasen en/ of proteasen bevatten. Dit is beschreven als de "gouden standaard" methode voor cardiomyocyte isolatie, wat resulteert in opbrengsten van maximaal 70% van de levensvatbare cellen2. De aanpak is ook gebruikt met menselijke harten, wat resulteert in aanvaardbare cardiomyocyten opbrengsten3,4,5. Echter, omdat coronaire perfusie is alleen haalbaar als het intacte hart of een grote myocard wig met een kransslagader tak beschikbaar is, de meeste menselijke cardiale specimens zijn niet geschikt voor deze aanpak vanwege hun kleine omvang en een gebrek aan geschikte vasculatuur. Daarom is de isolatie van menselijke cardiomyocyten uitdagend.

Menselijke myocardiale specimens bestaan meestal uit weefselbrokken van variabele grootte (ongeveer 0,5 x 0,5 x 0,5 cm tot 2 x 2 x 2 cm), verkregen door endomyoardiale biopten6, septale myectomies7, VAD-implantaties8, of uit uitgeplante harten9. De meest voorkomende procedures voor cardiomyocyte isolatie beginnen met het verminken van het weefsel met behulp van een schaar of een scalpel. Cel-naar-cel contacten worden vervolgens verstoord door onderdompeling in calcium-vrije of laag-calcium buffers. Dit wordt gevolgd door meerdere spijsverteringsstappen met ruwe enzymextracten of gezuiverde enzymen zoals proteasen (bijvoorbeeld trypsine), collagenase, hyaluronidase of elastase, wat resulteert in een desintegratie van de extracellulaire matrix en bevrijding van cardiomyocyten. In een laatste, kritieke stap moet een fysiologische calciumconcentratie zorgvuldig worden hersteld, of kan cellulaire schade optreden als gevolg van de calciumparadox10,11,12. Deze isolatiebenadering is handig, maar meestal inefficiënt. Zo bleek uit een studie dat bijna 1 g myocardiaal weefsel nodig was om een voldoende aantal cardiomyocyten te verkrijgen die geschikt zijn voor latere experimenten13. Een mogelijke reden voor lage opbrengsten is de relatief harde methode van het hakken van het weefsel. Dit kan met name schade cardiomyocyten gelegen aan de brokranden, hoewel deze myocyten zijn het meest waarschijnlijk worden vrijgegeven door enzymatische spijsvertering.

Een ander aspect dat de isolatie-efficiëntie en de kwaliteit van cellen verkregen uit menselijke specimens kan beïnvloeden, is de duur van weefselischemie. De meeste protocollen noemen korte transporttijden naar het laboratorium als een voorwaarde voor goede resultaten. Dit beperkt de studie van menselijke ventriculaire cardiomyocyten tot laboratoria met nabijgelegen faciliteiten voor hartchirurgie. Samen belemmeren deze beperkingen de verificatie van belangrijke bevindingen van diermodellen in menselijke cardiomyocyten. Verbeterde isolatieprotocollen die hoge cardiomyocytenopbrengsten van kleine hoeveelheden weefsel mogelijk maken, bij voorkeur zonder ernstige schade na langere transporttijden, zijn daarom wenselijk.

Hier beschreven is een isolatieprotocol gebaseerd op de enzymatische vertering van dunne myocardweefselplakjes gegenereerd met een vibratome14,15. We tonen aan dat isolatie van weefselschijfjes veel efficiënter is dan die van weefselbrokken die met een schaar zijn gehakt. De beschreven methode zorgt niet alleen voor hoge opbrengsten van levensvatbare menselijke cardiomyocyten uit kleine hoeveelheden myocyaal weefsel, maar is ook van toepassing op monsters die tot 36 uur zijn opgeslagen of vervoerd in koude cardioplegische oplossing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met ratten werden goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en gebruik Mittelfranken, Beieren, Duitsland. De inzameling en het gebruik van menselijke cardiale weefselmonsters werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Universiteit van Erlangen-Nürnberg en de Ruhr-Universiteit Bochum. Studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan het verzamelen van weefsels.

Vrouwelijke Wistar ratten (150-200 g) werden commercieel verkregen, verdoofd door het injecteren van 100 mg/kg thiopental-natrium intraperitoneally, en geëuthanaseerd door cervicale dislocatie gevolgd door thoracotomie en excisie van het hart. Menselijke cardiale weefsel monsters werden verzameld uit de linker-ventriculaire apicale kern tijdens de implantatie van mechanische assist apparaten, van septale myectomie, uit tetralogie van Fallot corrigerende chirurgie, of van de vrije links-ventriculaire wand van geëxplanteerde harten. Het volgende protocol beschrijft de isolatie van menselijk ventriculair weefsel. De isolatie van rat cardiomyocyten werd dienovereenkomstig uitgevoerd, maar met verschillende enzymen (zie Tabel van Materialen). Een schematische werkstroom van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1.

1. Voorbereiding van buffers, oplossingen en enzymen

  1. Buffers en oplossingen opstellen zoals vermeld in tabel 1.
  2. Verwarm oplossingen 1, 2, 3 en de aangepaste Tyrode's oplossing tot 37 °C. Bewaar de snijoplossing op 4 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Voor 1-2 myocards zijn in totaal ongeveer 15 mL, 8 mL en 5 mL aan oplossingen 1, 2 en 3 nodig voor de isolatie in één weefselkweekschotel van 35 mm. Schaal dienovereenkomstig voor gelijktijdige myocyte isolaties in meerdere gerechten. De snijoplossing kan enkele maanden worden ingevroren en op -20 °C worden bewaard.
  3. Weeg 1 mg proteinase XXIV (zie tabel van materialen)in een gepoogde 15 mL centrifugebuis en bewaar op ijs tot gebruik. Dit is voor het verwerken van één monster. Schaal het bedrag dienovereenkomstig. Meng de proteinase en collagenase niet.
  4. Weeg 8 mg collagenase CLSI (zie Tabel van Materialen)in een geposeerde 15 mL centrifugebuis en bewaar op ijs tot gebruik. Dit is voor het verwerken van één monster. Schaal het bedrag dienovereenkomstig. Meng de proteinase en collagenase niet.
    LET OP: Draag een gezichtsmasker of werk onder een rookkap om inademing van enzympoeder te voorkomen.
    OPMERKING: Enzymactiviteit kan in verschillende partijen variëren. Daarom kan de optimale concentratie verschillen en moet worden bepaald met elk nieuw aangeschaft enzym16.

2. Opslag en vervoer van myocardiaal weefsel

  1. Bewaar en transport menselijke hartmonsters in gekoelde, 4 °C snijoplossing(tabel 1).
  2. Gebruik dezelfde oplossing voor verdere weefselverwerking en vibratomesnijden.
    OPMERKING: Biopten en chirurgische hartmonsters moeten onmiddellijk bij 4 °C naar de snijoplossing worden overgebracht en kunnen vervolgens maximaal 36 uur vóór de toepassing van dit protocol bij 4 °C worden opgeslagen of vervoerd.

3. Verwerking en snijden van het weefsel

OPMERKING: Het protocol voor weefselsnijden volgt Fischer et al.15.

  1. Trimmen van het weefselblok
    LET OP: Menselijk hartweefsel is potentieel besmettelijk. Gebruik altijd beschermende kleding en volg de veiligheidsvoorschriften van uw instelling. Zorgvuldig omgaan met gebruikte messen en overboord te gooien in de veiligheid containers.
    1. Plaats het monster in een 100 mm weefselkweekschotel gevuld met 20 mL koude snijoplossing en houd op een gekoelde, 4 °C plaat.
    2. Verwijder overtollig fibrotisch weefsel en epicardiaal vet met een scalpel. In het geval van een transmuraal monster, verwijder trabeculae en weefsellagen in de buurt van het endocardium.
      OPMERKING: Fibrotisch weefsel is stijf en lijkt wit. Vet is meestal zacht en lijkt wit tot geel. Trabeculae en endocardiale weefsellagen kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun losse weefselsamenstelling en een niet-uitgelijnde vezeloriëntatie in vergelijking met myocardium van de epicardial lagen
    3. Voor een optimale vibratomeverwerking worden rechthoekige weefselblokken van ongeveer 8 mm x 8 mm x 8 mm gesneden met een scalpel van een groter weefselmonster. Voor kleinere biopten sla deze stap en verhuizen naar agarose inbedding.
  2. Inbedden van cardiale weefsel in laag-smelten-punt agarose
    1. Kook 400 mg laag smeltpunt agarose in 10 mL snijoplossing in een glazen bekerglas.
      LET OP: Draag handschoenen en veiligheidsbrillen om brandwonden te voorkomen. Behandel warm glaswerk alleen met slijtage van de warmtebescherming.
    2. Vul een 10 mL spuit met de hete, opgeloste agarose gel. Verzegel de spuit en laat de agarose minstens 15 minuten in evenwicht komen in een waterbad van 37 °C.
    3. Gebruik tangen om het bijgesneden hartmonster of biopsie in een schone 35 mm weefselkweekschotel te plaatsen met het epicardium naar beneden gericht en overtollig vocht te verwijderen met een steriel uitstrijkje.
    4. Giet de geëquilibreerde agarose (stap 3.2.2) over het weefsel door de spuit te legen. Zet het weefsel vast tegen beweging met tangen terwijl u de agarose giet. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in agarose.
    5. Leg de schotel onmiddellijk op ijs en laat de agarose 10 minuten stollen.
  3. Het myocarden snijden
    1. Monteer een nieuw scheermesje op de bladhouder van de vibratome en kalibreer het vibratome door de z-afbuiging van het blad zo mogelijk aan te passen.
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een vibratome met een infrarood-ondersteunde kalibratie-apparaat om het blad uit te lijnen in een horizontale positie met minimale z-afbuiging (gemeten afbuiging <0.1 μm).
    2. Gebruik een scalpel om een agarose-weefselblok dat past bij het monster houder van het vibratome accijns. Zorg ervoor dat het weefsel nog voldoende is ondergedompeld in agarose (agarosemarges ≥ 8 mm).
    3. Bevestig het agaroseblok aan de monsterhouder met een dunne laag cyanoacrylaatlijm en zachte druk.
    4. Plaats de monsterhouder met het weefsel in het vibratomebad. Vul het bad met snijoplossing en houd gedurende de hele verwerking op 4-6 °C met gemalen ijs, gevuld in de buitenste koeltank van het vibratome.
    5. Genereer 300 μm dikke plakjes met een voortschrijdende snelheid van ≤0,1 mm/s, een oscillerende frequentie van 80 Hz, een zijdelingse amplitude van 1,5 mm en een bladhoek van 15°. Bij het hanteren van de plakjes, houd de agarose in plaats van het weefsel zelf om weefselschade te voorkomen. Bewaar de plakjes in de snijoplossing maximaal 2 uur op 4 °C, indien nodig.
      LET OP: Cardiomyocyten zijn georiënteerd parallel aan het epicardium. Daarom is het belangrijk om parallel aan het epicardium te snijden om overmatige myocytenschade te voorkomen. Het wordt aanbevolen om de eerste 1-3 plakjes weg te gooien, omdat alleen uniforme plakjes constante dikte mogen worden gebruikt voor de isolatie. Voor kleine weefselbiopten, echter, alleen ontdoen van de eerste plak.
    6. Controleer cardiomyocyte uitlijning onder een standaard lichtmicroscoop met een vergroting van 40-100x.

4. Weefselvertering

  1. Plaats de warmteplaat op de labshaker en verwarm deze tot 37 °C. Start de lab shaker bij 65 rpm.
  2. Los de proteinase (bereid in stap 1.3) op in 2 mL van oplossing 1 (stap 1.1 en 1.2) en broed in bij 37 °C tot gebruik. Meng de proteinase en collagenase niet.
  3. Los de collagenase (bereid in stap 1.4) op in 2 mL van oplossing 1 (stap 1.1 en 1.2) en broed in bij 37 °C tot gebruik. Meng de proteinase en collagenase niet.
    LET OP: Draag beschermende brillen en handschoenen, omdat opgeloste enzymen huid- en oogletsel kunnen veroorzaken.
  4. Voeg calciumchloride (CaCl2) toe aan de collagenasehoudende oplossing (bereid in stap 4.3) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM.
  5. Gebruik tangen om een weefselschijfje van het vibratomebad over te brengen naar een schone 60 mm weefselkweekschaal gevuld met 5 mL geplooussnijoplossing (stap 1.1 en 1.2) en houd op ijs.
  6. Verwijder de agarose voorzichtig uit het myocardiaalweefsel met mes of tang.
    OPMERKING: Vermijd overmatige spanning en schuifspanning op de myocardiale plakjes, omdat ze de cardiomyocyten kunnen beschadigen.
  7. Om de eerste was uit te voeren, plaatst u een schone 35 mm weefselkweekschotel op de warmteplaat en vul deze met 2 mL voorverwarmde (37 °C) oplossing 1. Breng 1-2 myocard plakjes naar de bereide schotel met tangen. Spoel de oplossing aan met een pipet van 1 mL en voer de wasstappen 2x uit om restanten van snijoplossing te verwijderen.
    OPMERKING: De hartschijfjes niet aanzuigen. De oplossingen en de plakjes moeten op een constante temperatuur van 35 °C op de geagiteerde warmteplaat blijven. Pas indien nodig de temperatuur van de warmteplaat aan.
  8. Verwijder oplossing 1 uit de schaal en voeg 2 mL van de proteinase oplossing toe (stap 4.2). Incubeer gedurende 12 minuten op de warmteplaat bij 65 tpm.
  9. Was 2x met 2 mL voorverwarmde oplossing 1 (37 °C).
  10. Verwijder oplossing 1 uit de schaal en voeg 2 mL collagenase oplossing toe (stappen 4.3 en 4.4). Incubeer ten minste 30 min op de warmteplaat bij 65 tpm.
  11. Controleer op gratis individuele myocyten op 30, 35, 40 min, enz., door het plaatsen van de schotel onder een lichte microscoop. Werk snel om significante koeling van de oplossing te voorkomen.
    OPMERKING: De vereiste spijsverteringstijd kan variëren afhankelijk van de weefselgrondentie en de mate van fibrose. Zodra het weefsel zichtbaar zacht wordt en gemakkelijk scheidt wanneer voorzichtig getrokken, is de optimale spijsverteringstijd bereikt. Als er voldoende weefsel beschikbaar is, kunnen verschillende plakjes parallel met verschillende spijsverteringstijden worden verteerd.
  12. Wanneer het weefsel wordt verteerd en individuele myocyten zichtbaar zijn (stap 4.11), was 2x met 2 mL voorverwarmde oplossing 2 (37 °C) en vul opnieuw met 2 mL.

5. Weefseldissociatie

  1. Dissociate de verteerd weefsel plakjes met tangen door zorgvuldig te trekken de vezels uit elkaar.
  2. Voorzichtig pipette meerdere malen met een single-use Pasteur pipet (opening diameter >2 mm).
    OPMERKING: Het gebruik van tangen en pipetten kan mechanische stress veroorzaken en cardiomyocyteschade veroorzaken. Het is echter een cruciale stap voor de scheiding van de cellen. Gebruik fijne tangen om celschade te minimaliseren en de plakjes zorgvuldig te scheiden van kleinere stukken.
  3. Controleer op de bevrijde staafvormige cardiomyocyten onder de lichtmicroscoop.

6. Herintroductie van fysiologische calciumconcentratie

  1. Verhoog de calciumconcentratie langzaam van 5 μM naar 1,5 mM tijdens het roeren bij 35 °C op de warmteplaat. Gebruik 10 mM en 100 mM CaCl2 voorraadoplossingen. Aanbevolen stappen: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Laat de cellen zich aanpassen aan het verhoogde calciumgehalte in 5 min incubatieintervallen tussen elke stap.
  2. Verwijder onverteerd weefselbrokken voorzichtig met tangen of filter de celsuspensie door een nylon gaas met een poriegrootte van 180 μm aan het einde van de calciumverhoging.

7. Verwijdering van mechanische ontkoppelingsmiddel

  1. Stop agitatie en verwijder langzaam een derde van de oplossing (~700 μL) van de top met een pipet van 1.000 μL. Vermijd aspiratie van de cardiomyocyten.
    OPMERKING: Als onverteerd weefsel is verwijderd, zullen de cardiomyocyten zich ophopen in het midden van de schotel, wat de aspiratie van celvrije oplossing vergemakkelijkt. Zo niet, breng de celoplossing over op een centrifugebuis van 15 mL en laat de cellen gedurende 10 minuten sedimenten bij 35 °C, dan 700 μL van het supernatant aanzuigen en weggooien, de cellen opnieuw opschort, ze terugzetten naar een 35 mm weefselkweekschotel en ga verder met stap 7.2.
  2. Voeg 700 μL oplossing 3 toe aan de cellen, hervat de agitatie op de warmteplaat en broed gedurende 10 minuten.
  3. Herhaal stap 7.1 en 7.2.
  4. Breng de oplossing over op een centrifugebuis van 15 mL en laat de cardiomyocyten minimaal 10 minuten en maximaal 30 minuten op kamertemperatuur of spin op 50 x g gedurende 1 min sedimenten. Verwijder de supernatant volledig en resuspend in gewijzigde Tyrode's oplossing of de gewenste experimenteerbuffer.
    LET OP: Cardiomyocyten kunnen worden opgeslagen in de aangepaste Tyrode-oplossing(tabel 1) gedurende enkele uren bij 37 °C en 5% CO2 voor gebruik.
  5. Controleer de celkwaliteit met een standaard lichtmicroscoop bij 40x en 200x vergroting.
    OPMERKING: Ongeveer 30-50% van de cardiomyocyten moet staafvormig zijn, glad zonder membraanstrepten en duidelijke kruisstrepen vertonen. Slechts 5-10% van de levensvatbare cellen zou spontane samentrekkingen moeten vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de isolatie-efficiëntie te verifiëren, werd het protocol gebruikt met rattenancardium en werd het daaruit voortvloeiende aantal levensvatbare myocyten vergeleken met de getallen die via isolatie via coronaire perfusie en door isolatie van kleine weefselbrokken (brokje isolatie, Figuur 2). Brok isolatie en isolatie van weefsel plakjes werden uitgevoerd uit dezelfde harten. Voor de isolatie via coronaire perfusie werd echter het hele hart gebruikt. Coronaire perfusie leverde voornamelijk st...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel het isolement van levende cardiomyocyten meer dan 40 jaar geleden werd vastgesteld en nog steeds een voorwaarde is voor vele experimentele benaderingen in hartonderzoek, blijft het een moeilijke techniek met onvoorspelbare resultaten. Cardiomyocyte isolatie via perfusie van de kransslagaders met enzymoplossing wordt vaak gebruikt voor harten van kleine dieren en levert grote aantallen levensvatbare cellen. Dit vereist echter een relatief complex systeem en expertise. Bovendien zijn de meeste menselijke weefselmons...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Andreas Dendorfer van het Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, bedanken voor hulp bij het snijprotocol. Voor het verstrekken van menselijke myocardiale weefselmonsters willen we Ghazali Minabari en Christian Heim bedanken van de afdeling Hartchirurgie, Universitair Ziekenhuis Erlangen, Hendrik Milting van het Erich & Hanna Klessmann Instituut, Ruhr-Universiteit Bochum en Muhannad Alkassar van de afdeling Kindercardiologen, Universitair Ziekenhuis Erlangen. Voor ondersteuning met flow cytometrie willen we Simon Völkl en collega's van het translationeel onderzoekscentrum (TRC), Universitair Ziekenhuis Erlangen bedanken. We willen ook Lorenz McCargo en Celine Grüninger van het Institute of Cellular and Molecular Physiology Erlangen bedanken voor uitstekende technische ondersteuning.

Dit werk werd ondersteund door het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek), door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van het Universitair Ziekenhuis van de Universiteit van Erlangen-Nürnberg, en de Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals
2,3-butanedionmonoximeCarl Roth3494.1Purity>99%
Bovine serum albuminCarl Roth163.2
CaCl2Carl Roth5239.2
Creatine monohydrateAlfa AesarB250009
GlucoseMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
L-glutamineFluka Biochemica49450
Low melting-point agaroseCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
TaurineSigma AldrichT8691
Dyes
Di-8-ANEPPSThermo Fisher ScientificD3167
Fluo-4 AMThermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzymes
Collagenase CLS type IWorthingtonLS004196Gebruikt voor menselijk weefsel bij 4 mg/mL
(activiteit: 280 U/mg)
Collagenase CLS type IIWorthingtonLS004176Gebruikt voor rattenweefsel bij 1,5 mg/mL
(activiteit 330 U/mg)
Protease XIVSigma AldrichP8038Gebruikt voor rattenweefsel bij 0,5 mg/mL
(activiteit ≥ 3,5 U/mg)
Proteinase XXIVSigma AldrichP5147Gebruikt voor menselijk weefsel bij 0,5 mg/mL
(activiteit: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)BD Bioscience649225
Centrifuge tube, 15 mLCorning430790
Centrifuge tube, 50 mLCorning430829
Compact shakerEdmund BühlerKS-15 B controlAgitatierichting: horizontaal
Disposable plastic pasteur-pipettesCarl RothEA65.1Voor cel trituratie alleen pipetten met een binnenste tipdiameter ≥2 mm
ForcepsFST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
Nylon net filter, 180 µmMerckNY8H04700
TC Dish 100, StandardSarstedt83.3902
TC Dish 35, StandardSarstedt83.3900
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001Inclusief VibroCheck voor infrarood-ondersteunde correctie van z-deflectie

Referenties

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Met vibratoom gesneden plakjesisolatie van weefselplakjesopbrengst van cardiomyocytenflowcytometrieproteasecollagenase verteringstaafvormige myocytencalciumtolerantieelektrofysiologische analysemenselijk myocardium

Gerelateerde artikelen