Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Summary

Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.

Abstract

Anesthetica beïnvloeden het bewustzijn deels via hun acties op thalamocorticale circuits. De mate waarin vluchtige anesthetica verschillende cellulaire en netwerkcomponenten van deze circuits beïnvloeden, blijft echter onduidelijk. Ex vivo hersensegmenten bieden een middel waarmee onderzoekers discrete componenten van complexe netwerken kunnen onderzoeken en potentiële mechanismen kunnen ontwarren die ten grondslag liggen aan de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties. Om potentiële celtype- en pathway-specifieke medicijneffecten in hersensegmenten te isoleren, moeten onderzoekers in staat zijn om onafhankelijk afferente vezelroutes te activeren, niet-overlappende populaties van cellen te identificeren en vluchtige anesthetica toe te passen op het weefsel in een waterige oplossing. In dit protocol worden methoden beschreven om optogenetisch opgewekte reacties op twee onafhankelijke afferente paden naar neocortex in ex vivo hersenplakken te meten. Extracellulaire responsen worden geregistreerd op assay-netwerkactiviteit en gerichte whole-cell patch clamp-opnames worden uitgevoerd in somatostatine- en parvalbumine-positieve interneuronen. Levering van fysiologisch relevante concentraties isofluraan via kunstmatige cerebrale spinale vloeistof om cellulaire en netwerkresponsen te moduleren wordt beschreven.

Introduction

Vluchtige anesthetica worden al meer dan een eeuw alomtegenwoordig gebruikt in verschillende klinische en academische omgevingen. Verschillende klassen van anesthetica hebben unieke, vaak niet-overlappende moleculaire doelwitten ^1,2,3, maar bijna allemaal produceren ze bewusteloosheid. Hoewel hun gedragseffecten vrij voorspelbaar zijn, zijn de mechanismen waarmee anesthetica bewustzijnsverlies veroorzaken grotendeels onbekend. Anesthetica kunnen uiteindelijk zowel het niveau als de inhoud van het bewustzijn beïnvloeden via acties op corticothalamische circuits, waardoor de integratie van informatie in de corticale hiërarchie wordt verstoord ^4,5,6,7,8,9. Meer in het algemeen kan modulatie van corticothalamische circuits een rol spelen bij experimenteel¹⁰ of farmacologisch¹¹ veranderde bewustzijnstoestanden, en kan ook betrokken zijn bij slaap¹² en bij pathofysiologische bewustzijnsstoornissen^13,14.

De ongrijpbaarheid van de mechanismen die ten grondslag liggen aan verlies en terugkeer van bewustzijn tijdens anesthesie kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan niet-lineaire, synergetische acties van anesthetica op cellulair, netwerk- en systeemniveau¹⁵. Isofluraan onderdrukt bijvoorbeeld de activiteit in de geselecteerde hersengebieden ^16,17,18, schaadt de connectiviteit tussen verre hersengebieden 19,20,21,22,23 en vermindert synaptische reacties op een pathway-specifieke manier ^24,25 . Welke effecten van anesthetica, van moleculair tot systeemniveau, noodzakelijk of voldoende zijn om bewustzijnsverlies te bewerkstelligen, blijft onduidelijk. Naast inhoudelijke klinische onderzoeken van bewustzijn met behulp van niet-invasieve technieken 19,20,26, is het belangrijk dat experimentalisten proberen de verschillende cellulaire en netwerkinteracties te ontwarren die de bewuste ervaring dienen.

Door de complexe interacties in de intacte hersenen te vereenvoudigen, maken ex vivo hersensegmenten de studie van geïsoleerde componenten van de dynamische systemen van de hersenen mogelijk⁹. Een gereduceerde plakbereiding combineert de voordelen van relatief intacte anatomische structuren van lokale neurale circuits met de veelzijdigheid van in vitro manipulaties. Tot voor kort hebben methodologische beperkingen echter de studie van synaptische en circuiteigenschappen van langeafstandsinputs in hersensegmenten^27,28 uitgesloten; het kronkelige pad van corticothalamische vezelkanalen maakte activering van onafhankelijke afferente paden vrijwel onmogelijk door elektrische stimulatie.

Het onderzoeken van de effecten van anesthetica op de hersenschijfpreparaten brengt extra uitdagingen met zich mee. Bij afwezigheid van een intacte ademhalings- en bloedsomloop moeten anesthetica worden aangebracht en moeten concentraties zorgvuldig worden afgestemd op de geschatte concentraties op de effectplaats. Voor veel intraveneuze anesthetica maakt de langzame snelheid van equilibratie in het weefsel traditionele farmacologische onderzoeken bewerkelijk^29,30. Het onderzoeken van de effecten van vluchtige gasanesthetica in ex vivo preparaten is beter handelbaar, maar brengt ook uitdagingen met zich mee. Deze omvatten het omzetten van geïnhaleerde partiële drukdoses naar waterige concentraties en de noodzaak van een aangepast afgiftesysteem van het geneesmiddel aan het weefsel via kunstmatige cerebrale spinale vloeistof³¹.

Hier worden methoden beschreven waarmee onderzoekers kunnen profiteren van de goed gedocumenteerde fysisch-chemische eigenschappen van het vluchtige anestheticum isofluraan voor medicijnafgifte aan ex vivo hersenplakken, pathway- en laagspecifieke inputs activeren naar een corticale interessegebied met een hoge spatiotemporale resolutie, en gelijktijdige laminaire opnames en gerichte patchklemopnamen van geselecteerde populaties van neuronen kunnen uitvoeren. Gecombineerd stellen deze procedures onderzoekers in staat om vluchtige anestheticum-geïnduceerde veranderingen in verschillende waarneembare elektrofysiologische responseigenschappen te meten, van synaptisch tot lokaal netwerkniveau.

Protocol

Alle procedures met dieren die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health Animal Care and Use Committee.

1. Muizen fokken om fluorescerend reportereiwit tot expressie te brengen in interneuronsubpopulaties

1. Koppel homozyogische, Cre-afhankelijke tdTomato mannelijke muis met homozygote SOM-Cre vrouwelijke of homozygote PV-Cre vrouwelijke muis.
   OPMERKING: Andere specifieke neuronale populaties kunnen worden getarget met behulp van de juiste Cre-lijnen.
2. Laat heterozygote nakomelingen rijpen tot ten minste 3 weken oud voordat u verder gaat. Voor experimenten die hier worden beschreven, is genotypering niet nodig, omdat homozygote ouders nakomelingen produceren die allemaal heterozygoot zijn voor zowel celtypespecifieke Cre-recombinase als Cre-afhankelijke reporter-allelen.

2. Het uitvoeren van unilaterale stereotaxische injectie van virale construct

1. Pas de instellingen van de micropipettetrekker voor injectiepipetten aan zoals aangegeven in de gebruikershandleiding van het instrument (zie tabel 1 voor aanbevolen instellingen). Trek aan de glazen micropipette.
2. Breek de punt van het scherpe uiteinde van de pipet zodanig dat de tipdiameter ongeveer 30 μm is met minimale taps toelopen over enkele millimeters.
3. Bepaal met behulp van eerder gedocumenteerde procedures de juiste titer en het juiste volume van het virus dat moet worden geïnjecteerd. In de hier beschreven experimenten leverde 1,0 μL (titer: 3,1-5,7 TU/ml) eenzijdig geïnjecteerde resultaten op.
4. Vul het volledige volume van de pipet op met minerale olie. Laad de pipet op de microsyringe en laat een kleine hoeveelheid minerale olie door de punt stromen om ervoor te zorgen dat de punt niet verstopt raakt.
5. Voorvulling ten minste 1,0 μL virale construct. De recombinante adeno-geassocieerde virale vector die in deze experimenten werd gebruikt, was AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Schik steriele drape in een chirurgische ruimte. Steriliseer hulpmiddelen voor stereotaxische procedure en plaats het op het gordijn.
7. Verdoof SOM-tdTomato of PV-tdTomato heterozygoot dier met isofluraan (3% voor inductie, 1,5-2% voor onderhoud) en zuurstofmengsel. Bevestig periodiek het chirurgische niveau van anesthesie met teenknijpen tijdens de operatie. Zorg ervoor dat het dier niet verder gaat dan het chirurgische plan van anesthesie door de ademhaling elke 10-15 minuten te controleren.
8. Scheer de bovenkant van het hoofd van het dier. Breng 70% isopropylalcohol en op jodium gebaseerde oplossing royaal aan op het chirurgische gebied en oogzalf op oogkassen om uitdroging van het membraan te voorkomen. Dien bupivacaïne/lidocaïne (verhouding 1:1, 1,0 mg/kg) subcutaan toe aan de operatieplaats voor lokale verdoving.
9. Plaats het dier in stereotaxisch frame.
10. Gebruik scalpel om incisie te maken langs de sagittale as van de huid boven het dorsale oppervlak van de schedel. Trek de huid in met behulp van een tang. Hydrateer de schedel met 0,9% zoutoplossing indien nodig.
11. Markeer op het oppervlak van de schedel lichtjes het snijpunt van voorste en laterale coördinaten met een kruis in potlood. Boor een gat op de juiste coördinaten in het dwarsvlak (in mm ten opzichte van Bregma, voor cingulate cortex (Cg) injectie: anterieur 0,2, lateraal 0,3; voor posterieure thalamus (Po) injectie: posterieur 2,25, laterale 3,4).
    OPMERKING: Markeringen moeten verder reiken dan de grenzen van het braamgat om richtlijnen te bieden voor een nauwkeurige plaatsing van de pipet.
12. Zet de luchttafel aan en balanceer deze in balans.
13. Herpositioneer de elektrodemanipulator van het stereotaxische frame op 0° voor injecties in Cg, of 45° in het coronale vlak voor injecties in Po.
14. Bevestig de spuitpomp aan de elektrodemanipulator. Bevestig de microsyringe pompregelaar aan de spuitpomp.
15. Navigeer door de pipetpunt in de buurt van (maar raak niet aan) het oppervlak van de hersenen, op het snijpunt van markeringen die zijn gemaakt in stap 2.11. Plaats de pipet met ongeveer 1 mm/s langs de lengteas in de hersenen, hetzij 0,9 mm (injectie in Cg) of 3,1 mm (injectie in Po). Wacht 10 minuten voordat u verder gaat.
16. Injecteer 1,0 μL virale construct gedurende een periode van 10 min (100 nL/min). Als welling van het virus van de pipetinbrengplaats wordt waargenomen, vertraagt u de injectiesnelheid tot 50 nL / min.
17. Wacht na de injectie 10 minuten voordat u de injectiepipet langzaam intrekt.
18. Hecht om de hoofdhuidincisie te sluiten en 2-5 mg / kg meloxicam subcutaan toe te dienen.
19. Stop met isofluraan en controleer het dier tijdens het verschijnen uit de anesthesie. Laat herstellen volgens de procedures die zijn beschreven door het Animal Care and Use Committee van de instelling, inclusief verdere toediening van pijnstillers.

3. Bereiding van acute hersenplakken

1. Wacht ten minste 3 weken voor de expressie van virale constructie voordat u weefsel oogst.
2. Bereid 1 L kunstmatig hersenvocht voor de snijprocedure (snijden van kunstmatige cerebrale spinale vloeistof, sACSF). Zie tabel 2 voor ingrediënten.
3. Voer sACSF tijdens de snijprocedure aan met een opgelost 95% O₂/5% CO_2-mengsel , afgegeven via een gasdispersiebuis.
4. Bereid een ijskoud bad voor op trillende blade microtoom. Monteer ijskoud monsterstadium op microtoom en bevestig het saffierblad op zijn plaats voor weefselsectie.
5. Verdoof de muis met 3% isofluraan en zuurstof tot verlies van de rechtzettingsreflex.
6. Onthoofd de muis met guillotine en dompel de kop onmiddellijk onder in 4°C sACSF. Om de gezondheid van het weefsel te behouden, voltooit u de volgende stappen zo snel mogelijk.
7. Open schedelholte door een kleine incisie aan de basis van de schedel te maken en elke schedelplaat voorzichtig te verwijderen. Verwijder voorzichtig de onderliggende dura mater.
8. Terwijl de hersenen zich nog in de schedelholte bevinden, gebruikt u het scheermesje om het cerebellum te verwijderen. Maak een tweede verticale snede langs het sagittale vlak in de linkerhersenhelft, net lateraal naar de middellijn.
9. Bereid weefselblok voor op secties.
   1. Til de hersenen voorzichtig op uit de schedelholte. Plaats de hersenen op het filterpapier met het platte, sagittale vlak naar beneden. Leid het filterpapier over de blokkerende sjabloon en lijn de hersenen uit op het onderliggende sjabloonoverzicht (aanvullende figuur 1).
   2. Maak twee parallelle sneden in het coronale vlak zoals aangegeven door de lijnen op de sjabloon. Voeg indien nodig een kleine druppel sACSF toe om filterpapier nat te houden.
   3. Plaats het weefselblok kort in 4°C sACSF terwijl stap 3.8.4 wordt uitgevoerd.
   4. Breng een kleine hoeveelheid superlijm aan op het ijskoude monsterstadium.
   5. Til het weefselblok op van koude sACSF. Gebruik de hoek van een absorberende handdoek om overtollige sACSF af te voeren. Lijm het achterste coronale vlak van het weefselblok op het specimenstadium, met het dorsale oppervlak van de hersenen naar het saffierblad gericht.
10. Verzamel 500 μm dikke coronale hersenplakken. Plaats de plakjes van belang op nylon gaas (aanvullende figuur 2) in 34 °C sACSF en laat de container op kamertemperatuur komen.
    OPMERKING: Voor experimenten die hier worden beschreven, werden elektrofysiologische opnames verzameld van een coronale sectie gecentreerd op ongeveer 2,25 mm posterieur tot bregma om een niet-primair sensorisch gebied, mediale secundaire visuele cortex (V2MM) te bestuderen.

4. Bereiding van experimentele zakken voor kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (eACSF) die opgelost vluchtig anestheticum isofluraan bevatten

1. Bereid 300 ml van een voorraadmengsel van 3,0% isofluraan.
   1. Voeg in een afgesloten polytetrafluorethyleengaszak ~ 100 ml 95% O₂/5% CO 2-gasmengsel toe aan 20-30 ml vloeibaar isofluraan en een kleine hoeveelheid 0,9% zoutoplossing. Wacht ten minste 30 minuten om evenwicht tussen isofluraan tussen vloeistof- en gasfasen mogelijk te maken.
   2. Bepaal de hoeveelheid verzadigd isofluraangas, V_sat, toe te voegen aan de voorraadzak met behulp van de volgende vergelijking:
      
      waarbij P%_-voorraad de doelsamenstelling van het voorraadgas is (3% in dit geval),_V-voorraad het eindvolume van de voorraadgaszak is,_P-isofluraan de partiële druk van isofluraan bij kamertemperatuur (~ 240 mmHg) en_P-totaal de atmosferische druk (~ 760 mmHg).
   3. Voeg de berekende hoeveelheid verzadigd gas toe aan een lege gaszak en vul de zak met een volume van 95% O₂/5% CO_2-gasmengsel om het totale volume voorraadzak op 300 ml te brengen.
2. Bereid 2 L kunstmatig hersenvocht voor perfusie van het plakje tijdens het experiment (experimentele ACSF, eACSF). Zie tabel 2 voor ingrediënten. Los 95% O₂/5% CO₂ gasmengsel op in oplossing.
3. Bereid twee afzonderlijke zakken met Control- en Isofluraan-oplossingen.
   1. Voeg aan een lege polytetrafluorethyleengaszak 600 ml eACSF en 600 ml 95% O₂/5% CO_2-gasmengsel toe. Label deze zak als Control.
   2. Voeg aan een andere lege polytetrafluorethyleengaszak 300 ml eACSF toe. Label deze zak als Isofluraan.
   3. Kies een fysiologisch relevante gebalanceerde gasfaseconcentratie van isofluraan. Experimenten werden uitgevoerd met gasconcentraties gelijk aan 1,3% isofluraan. Muizen verliezen de rechtzettingsreflex, en vermoedelijk het bewustzijn, bij 0,9% geïnhaleerd isofluraan.
   4. Gebruik de volgende vergelijking om de equivalente gasfaseconcentratie bij kamertemperatuur te berekenen, P%(_T-ruimte)³¹:
      
      waarbij P%(_T-lichaam) de fysiologisch relevante gasfaseconcentratie is die in stap 4.3.3 is gekozen, de_T-ruimte 25 °C en het_T-lichaam 37 °C.
   5. Gebruik de volgende vergelijking om het volume gas uit de voorraadgaszak,_V-voorraad, te bepalen om toe te voegen aan de Isofluraanoplossing.
      
      waarbij_V-oplossing het volume eACSF in ISOFLURAANZAK (300 ml) is, P% (_T-ruimte) wordt ingevoerd uit vergelijking (2), λ de zout/gas Ostwald-verdelingscoëfficiënt van isofluraan (λ = 1,2³²) en P%_-voorraad de gasfaseconcentratie van de voorraadgaszak is (P%_voorraad = 3,0%).
   6. Voeg aan de isofluraanoplossingszak het volume gas uit de voorraadgaszak,_V-voorraad, berekend in stap 4.3.5 toe.
   7. Voeg aan de isofluraanoplossingszak een volume van 95% O₂/5% CO_2-gasmengsel toe om het totale volume gas in de isofluraanoplossingszak op 300 ml te brengen.
4. Schud zowel control- als isofluraanzakjes gedurende ten minste 1 uur op de shaker om isofluraanfase-equilibratie mogelijk te maken.
5. Nadat alle gegevens zijn verzameld, kan de juiste concentratie worden geverifieerd met behulp van een anesthetische gasmonitor om de equilibrated gasconcentratie van isofluraan boven de resterende oplossing in zak te meten.
6. Rapporteer experimentele concentraties van vluchtige gassen in waterige eenheden, omdat millimolaire concentraties robuuster zijn voor temperatuurveranderingen. Gebruik de volgende vergelijking om de gasfaseconcentratie bij kamertemperatuur, P%(_T-ruimte), om te zetten in een equivalente waterige concentratie (C_waterig, in mM)³¹:
   
   waarbij α de bunsenverdelingscoëfficiënt zout/gas voor isofluraan bij 25°C³² is.

5. Voorbereiding van hardware en software voor meerkanaalsopnamen

1. Stel een 16-kanaals data-acquisitiesysteem in volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Verschillende in de handel verkrijgbare versterkers en data-acquisitiesystemen kunnen worden gebruikt om meerkanaalsopnamen te verzamelen. In de hier beschreven experimenten worden analoge signalen via een elektrodereferentiepaneel aan twee versterkers geleverd, waar ze worden versterkt (2000x) en gefilterd (0,1-10kHz). Analoge ingangen naar het data-acquisitiesysteem worden gedigitaliseerd op 40kHz.
2. Bevestig de juiste 16-kanaals hoofdstage-adapter aan een microscoopmicromanipulator. Richt de adapter zo dat de vrouwelijke connectorpoorten naar beneden zijn gericht.
3. Pas de werkingshoek van deze micromanipulator zodanig aan dat deze naar beneden is gericht op de opnamekamer, onder een hoek van ongeveer 70° ten opzichte van horizontaal.
4. Sluit de headstage-ingang aan op een 16 x 1 sonde voor in vitro elektrofysiologie via de headstage-adapter die aan de micromanipulator is verankerd.
5. Sluit de headstage-uitgang aan op het data-acquisitiesysteem.
6. Installeer de juiste software voor gegevensverzameling. Configureer 15 ingangskanalen om overeen te komen met ingangssignalen van de eerste 15 meerkanaals sondecontacten. Configureer het resterende kanaal om input van de intracellulaire elektrode te ontvangen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u elektrode- en adapterkaarten in overweging neemt bij het verzamelen en analyseren van gegevens, om ervoor te zorgen dat het juiste signaal overeenkomt met het elektrodecontact waaruit het is verzameld.

6. Configuratie van lichtstimulatieprotocollen

1. Stel een lichtafgiftesysteem in en installeer de bijbehorende software.
2. Open de software. Kies hardwarebedradingsconfiguratie waarbij een Trigger Source (Digital/TTL Out) trigger in-signaal levert aan het lichtafgiftesysteem en het lichtleveringssysteem trigger-out-signaal levert aan een 470 nm LED.
3. Mount high-power objectief lens. Kalibreer met behulp van een digitale camera het krachtige objectief voor gebruik met een lichtafgiftesysteem.
4. Maak een nieuwe profielvolgorde van lichtstimulatieprofielen.
   1. Maak een patroon naar keuze. In de hier beschreven experimenten wordt een cirkel met een diameter van 150 μm gebruikt om laagspecifieke activering van axonterminals mogelijk te maken.
   2. Als u een profielreeks wilt samenstellen, kopieert en plakt u dit profiel voor elk van een willekeurig aantal onderzoeken.
   3. Maak een golfvormlijst met golfvormen van elke lichtintensiteit, pulsduur of pulsgetal.
   4. Wijs willekeurig golfvormen toe aan elk profiel. Elk profiel met de toegewezen golfvorm komt overeen met één triggerpuls van een digitale TTL-ingang of één proef.
   5. Sla de profielreeks op.
5. Maak in de software voor gegevensverzameling een nieuw protocol.
   1. Stel het aantal proefversies in op het aantal profielen in de zojuist gemaakte profielreeks.
   2. Kies signaalingangen die overeenkomen met de ingangen die zijn geconfigureerd in stap 5.6. Configureer een protocol dat een enkele digitale TTL-uitgang biedt, waarbij gedurende een geschikte tijd voor en na de digitale trigger wordt opgenomen vanuit deze 16 ingangskanalen.

7. Het plaatsen van een meerkanaalssonde in ex vivo hersenweefselschijf

1. Perfuseer bubbeld eACSF (niet in verzegelde zakken) op 3-6 ml / min.
2. Breng het hersenschijfje met het interessegebied over op het mesh-raster in de microscoopperfusiekamer. Anker met platina harp (zie aanvullende figuur 3).
3. Draai het mesh-raster zodanig dat de lijn van elektrodecontacten aan het distale uiteinde van de meerkanaalsonde ongeveer loodrecht op het piale oppervlak staat.
4. Laat onder broadfield-verlichting en onder fijne controle van de micromanipulator de meerkanaalsonde naar het oppervlak van de plak zakken.
5. Draai de filterkubuskoepel om de juiste filterkubus in te schakelen voor visualisatie van het fluorescerende reportereiwit uitgedrukt in axonterminals van corticale afferente stoffen. Draai indien nodig de plak om de sonde nauwkeuriger uit te lijnen met het pialoppervlak.
6. Plaats de sonde net boven het vlak van de plak, ~ 200 μm kort van de uiteindelijke doelpositie langs de x-as, waardoor ten minste één kanaal buiten de grens van het weefselgebied dat wordt geregistreerd
7. Steek de sonde langzaam in het segment door de manipulator langs de lengteas te bewegen. Om schade aan het weefsel te minimaliseren, moet u de sonde alleen zo ver naar voren brengen dat de scherpe uiteinden net zichtbaar zijn onder het weefseloppervlak. Dit minimaliseert schade aan het weefsel en zorgt er tegelijkertijd voor dat de elektrodecontacten in contact komen met het weefsel.

8. Patch clamping gerichte neuronen en het verkrijgen van hele-cel configuratie

1. Schakel de eACSF-bron over naar de besturingsoplossing in zakken.
2. Identificeer fluorescerend gelabelde cel voor gerichte patchklemopname.
   1. Beperk het diafragma irismembraan tot de kleinste diameter. Schakel een objectieflens met een laag vermogen in en breng het weefsel in beeld.
   2. Centreer het licht over een gebied van weefsel dat grenst aan (maar niet overlapt) de meerkanaals sonde.
   3. Schakel het krachtige (40x of 60x) waterdompelingsobjectief in en wees voorzichtig om contact tussen de meerkanaals sonde en de objectieflens te vermijden.
   4. Draai de filterkubuskoepel om de juiste filterset in te schakelen om beeldvorming mogelijk te maken van cellen die Cre-afhankelijke fluorescerende marker tot expressie brengen.
   5. Identificeer een fluorescerend gelabelde cel als een doelwit voor patchklemregistratie. Verhoog de objectieflens om voldoende ruimte te creëren om een patchpipet te laten zakken.
3. Laad een patchpipet (zie tabel 1) met interne oplossing (tabel 2) en monteer de pipet in de elektrodehouder. Gebruik een spuit van 1 ml om overdruk uit te oefenen die overeenkomt met ~ 0,1 ml lucht.
4. Pipet van de onderste patch in de oplossing. Breng de pipetpunt onder visuele begeleiding in beeld.
5. Verkrijg volledige celopname van de beoogde cel met behulp van de eerder gedemonstreerde stappen³³.
6. Als u van plan bent om veranderingen in de intrinsieke eigenschappen van de cel te beoordelen (bijv. Ingangsweerstand, actiepotentiaal vuursnelheid in reactie op de huidige stappen), voer deze opnames uit. Ga anders naar het axonstimulatieprotocol hieronder.

9. Laagspecifieke optogenetische activering van axonklemmen

1. Manipuleer het gezichtsveld in het x-y-vlak om het lichtstimulatieprofiel uit te lijnen met de gewenste locatie op het segment.
2. Laad lichtstimuleringsprotocol en bereid het lichtafgiftesysteem voor op het ontvangen van een digitale TTL-puls.
3. Activeer axonterminals op optogenetisch en registreer tegelijkertijd extracellulaire veldpotentialen en intracellulaire membraanfluctuaties.
4. Schakel de eACSF-bron over naar isofluraanoplossing en was het medicijn gedurende 15 minuten in. Verzamel indien nodig spontane opnames tijdens de wash-in.
5. Herhaal stap 9.2-9.3.
6. Schakel de eACSF-bron over naar de besturingsoplossing en was het medicijn gedurende 20 minuten uit. Verzamel indien nodig spontane opnames tijdens het uitwassen.
7. Herhaal stap 9.2-9.3.

Results

Een tijdlijn van stappen die in het protocol worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1. Corticale inputs afkomstig van corticale gebieden van hogere orde of van niet-primaire thalamische kernen hebben gedeeltelijk overlappende terminale velden in laag 1 van niet-primaire visuele cortex²⁴. Om onafhankelijke thalamocorticale of corticocorticale afferente routes te isoleren, werd een virale vector met ChR2 en een eYFP fluorescerende reporter geïnjecteerd in Po of ...

Discussion

In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het evalueren van intra- en extracellulaire responsen op selectief geactiveerde afferente routes in ex vivo hersenplakken.

Het gebruik van optogenetische hulpmiddelen en parallelle opnameschema's stelt onderzoekers in staat om reacties van lokale populaties op afferente inputs uit verre hersengebieden te onderzoeken, terwijl ze tegelijkertijd registreren van gerichte populaties van interneuronen. Het gebruik van optogenetische technologie ma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5x broadfield objective lens	Olympus	MPLFLN2.5X
40x water immersion objective lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 mixture	Airgas	Z02OX95R2003045
A16 probe	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16-kanaals sonde
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Anesthetic gas monitor (POET II)	Criticare	602-3A
ATP, Magnesium Salt	Sigma Aldrich	A9187	intracellulaire oplossing
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Laboratory	007914	Cre-afhankelijke tdTomato-muis
B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre-muis
Belly Dancer Shaker	Thomas Scientific	1210H86-TS	voor het gelijkwaardig maken van afgesloten gaszakken
Betadine-oplossing	Generiek merk
Bleekvloeistof	Generiek merk		voor zilverchloride klembeugelelektrode
Bupivicaine
Calcium Chloride (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Capillair glas (patch clamp-opnames)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Boorsilicaat, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, lengte: 90,0 mm
Capillair glas (virale injecties)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5"
Controle van junior micromanipulator	Luigs and Neumann	SM8	voor de controle van de junior micromanipulator
Controle van manipulatoren en verschuifbare tafel	Luigs and Neumann	SM7	voor de controle van de multikanaals elektrode en de verschuifbare tafel
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitizer en software
E-3603 slang	Fisher Scientific	14171208	voor de afgifte van 95% O2/5% CO2 gasmengsel naar de incubatiekamer + toepassing van druk tijdens patch clamping
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	intracellulaire oplossing
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel	Neuralynx	Gepensioneerd
Vullende naald	World Precision Instruments	50821912	voor het vullen van patch clamp-pijpen
Filter kubus voor beeldvorming EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Filterpapier	Fisher Scientific	09801E	leggen over snedesjabloon tijdens de voorbereiding van weefselblok
Flaming/Brown micropipet trekker	Sutter Instrument	P-1000	2.5x2.5 Box filament
Gas verspreiding buis	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Glas spuit (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	voor het vullen van gas-afgesloten zakken
Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate)	Dot Scientific	DSG37020	intracellulaire oplossing
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Sodium Salt	Sigma Aldrich	G8877	intracellulaire oplossing
Headstage-sonde adapter	NeuroNexus	A16-OM16	adapter om 16-kanaals sonde aan te sluiten op headstage-ingang
Hemostatische pincet	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, intracellulaire oplossing
HS-16 Headstage	Neuralynx	Gepensioneerd
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Isopropyl alcohol (70%)	VWR International	101223-746
Junior micromanipulator	Luigs and Neumann	210-100 000 0090-R	voor manipulatie van patch clamp-elektrode
LED Lichtbron Controle Module	Mightex	BLS-PL02_US	optogenetische lichtbron controle
Lidocaine
Lynx-8 Versterker	Neuralynx	Gepensioneerd
Lynx-8 Voeding	Neuralynx	Gepensioneerd
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Red filter kubus	Chroma	49008	voor beeldvorming van tdTomato fluorescente reporter
Meloxicam
Micropipet houder	Fisher Scientific	NC9044962
Microsyringe pomp	World Precision Instruments	UMP3-4
Mineralolie	Generiek merk
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Versterker
Stikstof (voor luchttafel)	Airgas	NI200
Nylon gaas	Fisher Scientific	501460083	uitgerekt over de hoefijzer van vervlakte platinadraad, snede rust op dit tijdens opnames
Nylon, gesneden van panty's	Generiek merk		klein stukje om platform voor sneden in incubatiekamer te maken, enkele vezels om platina harp te maken
Ophtalmisch zalfje	Fisher Scientific	NC1697520
Pipet	Dot Scientific	307	Voor het overbrengen van weefsel naar de rig
Platinedraad	VWR International	BT124000	2 cm, vervlakt, om platina harp te maken
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	optogenetisch lichtbezorgsysteem, wordt geleverd met PolyScan2-software
Potassium Chloride (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Potassium Phosphate (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP