CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Culexmuggen zijn de belangrijkste vectoren van verschillende ziekten die een negatieve invloed hebben op de gezondheid van mens en dier, waaronder het West-Nijlvirus en ziekten veroorzaakt door filariale nematoden zoals hondenhartworm en elephantasis. Onlangs is CRISPR/Cas9 genoombewerking gebruikt om site-gerichte mutaties te induceren door een Cas9-eiwit te injecteren dat is gecomplexeerd met een gids-RNA (gRNA) in vers gelegde embryo's van verschillende insectensoorten, waaronder muggen die behoren tot de geslachten Anopheles en Aedes. Het manipuleren en injecteren van Culex-muggen is iets moeilijker omdat deze muggen hun eieren rechtop in vlotten leggen in plaats van individueel zoals andere soorten muggen. Hier beschrijven we hoe we gRNAs kunnen ontwerpen, complexen met Cas9-eiwit, vrouwelijke muggen van Culex pipiens stimuleren om eieren te leggen en hoe ze nieuw gelegde embryo's kunnen bereiden en injecteren voor micro-injection met Cas9 / gRNA. We beschrijven ook hoe geïnjecteerde muggen kunnen worden achtergelaten en gescreend op de gewenste mutatie. De representatieve resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om site-gerichte mutaties in het genoom van Culex-muggen te induceren en, met kleine aanpassingen, kan worden gebruikt om ook null-mutanten bij andere muggensoorten te genereren.
Inleiding
Culexmuggen worden verspreid over de gematigde en tropische regio's van de wereld en brengen verschillende dodelijke virussen over, waaronder West Nile virus1,St. Louis encefalitis2 en filariale nematoden die hondenhartworm3 en elephantiasis4veroorzaken. Leden van het Culex pipiens complex, waaronder Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens en Cx. pipiens molestus, vertonen opvallende variaties in vele aspecten van hun biologie. Bijvoorbeeld, terwijl Cx. quinquefasciatus en Cx. pipiens molestus niet in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
In de meeste onderzoeksinstellingen moet een goedgekeurd bioveiligheidsprotocol van kracht zijn voordat transgene insecten worden gegenereerd of onderhouden om ervoor te zorgen dat genetisch gemodificeerde organismen niet ontsnappen of uit de laboratoriumfaciliteit worden verwijderd. Er kunnen ook aanvullende overheidsvoorschriften van toepassing zijn. Voordat u met een dergelijke project begint, controleert u alle institutionele beleidslijnen en procedures om te bepalen welke documenten en goedkeuringen vereist zijn.
1. GRNAs ontwerpen en injectiemengsels bereiden
- Ontwerp 2-5 gRNAs voor elk doelgen, omdat sommige....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het beschreven protocol konden we met succes embryo's van Cx. pipiensinjecteren en een hoge overlevingskans waargenomen bij de geïnjecteerde embryo's (~ 55%, figuur 1). Eerdere proeven hadden een lager overlevingspercentage, waarschijnlijk omdat de voorste van de eifollikel aan de medische verbandstrook was bevestigd, waardoor muggenlarven niet uit het koraal konden ontsnappen en met succes in het water konden zwemmen. Ervoor zorgen dat het voorste uiteinde verder rei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol presenteert methoden om specifieke mutaties in het genoom van Culex-muggen te introduceren en kan ook worden gebruikt om het genoom van andere muggen te bewerken. Het protocol is belangrijk omdat het specifieke details biedt over niet alleen hoe de injectiematerialen moeten worden bereid, maar ook een gedetailleerd video-overzicht van hoe muggen eieren kunnen leggen, evenals hoe die eieren te bereiden en te injecteren. We vatten ook samen hoe te profiteren van de biologie van vrouwelijke Cx. pip.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
RH werkt voor de Insect Transformation Facility, die diensten verleent op het gebied van genetische modificatie van insecten.
Dankbetuigingen
We danken Dr. David O'Brochta en alle leden van het Insect Genetic Technologies Coordination Research Network voor de hulp en training die zij ons en anderen bieden over de implementatie van genetische technologieën. We danken channa Aluvihare in het bijzonder voor het optimaliseren van het micromanipulatieprotocol om Culex-embryo's te kunnen injecteren en uit te komen. We danken ook Devante Simmons en Joseph Urso, niet-gegradueerde studenten die in het Meuti-lab werken, voor hun hulp bij het verzorgen en screenen van transgene muggen, en Zora Elmkami van de ITF voor hulp bij het fokken en voorbereiden van muggen voor injectie. Dit werk werd ondersteund door....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Bedrijfslocatie: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Bedrijfslocatie: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicaat glas mirocapillaire buizen, 1 mm buitendiameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Bedrijfslocatie: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Naald Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Bedrijfslocatie: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circulaire filterpapier (12,5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Bedrijfslocatie: St. Louis, MO, USA |
| Conische buis (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand grove filterpapier met snelle stroomsnelheid | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Dekglaas (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Tandartsen dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Bedrijfslocatie: Melville, NY, USA |
| Scotch dubbelzijdig plakband | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i micro-injector | Eppendorf | 5252000021 | Bedrijfslocatie: Hamburg, Germany |
| Glazen flesje (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon olie | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Bedrijfslocatie: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Naald Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Dit is compatibel met het eerdere PC-10 model, dat is stopgezet. Bedrijfslocatie: Amityville, NY, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Naald Puller | Narishige | PC-100 | Dit is compatibel met het eerdere PC-10 model, dat is stopgezet. Bedrijfslocatie: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Kwarts glas mirocapillaire buizen, 1 mm buitendiameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Bedrijfslocatie: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | Deze kit stelt u in staat om te bepalen of gRNAs DNA-sequenties in vitro snijden. Bedrijfslocatie: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Bedrijfslocatie: St. Louis, MO, USA |
| Kleine petrischalen (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Natriumcitraat kippenbloed | Lampire biologicals | 7201406 | Bedrijfslocatie: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Vierkante petrischaal (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Bedrijfslocatie: Melville, NY, USA |
| Tropisch visvoer | Tetramin | N/A | |
| Whatman filterpapier | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Bedrijfslocatie: Waltham, MA, USA |
| Whatman filterpapier, 4,25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Bedrijfslocatie: St. Louis, MO, USA |
Referenties
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
