Methodenartikel

High-throughput en deep-proteoom profilering door 16-plex Tandem Mass Tag Labeling in combinatie met tweedimensionale chromatografie en massaspectrometrie

DOI:

10.3791/61684

⸱

18 augustus 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een geoptimaliseerd high-throughput-protocol gepresenteerd dat is ontwikkeld met 16-plex tandem mass tag-reagentia, waardoor kwantitatieve proteoomprofilering van biologische monsters mogelijk is. Uitgebreide basisfractionering van de pH-waarde en LC-MS/MS met hoge resolutie verminderen de compressieverhouding en zorgen voor een diepe proteoomdekking.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isobare tandem mass tag (TMT) labeling wordt veel gebruikt in proteomics vanwege de hoge multiplexcapaciteit en diepe proteoomdekking. Onlangs is een uitgebreide 16-plex TMT-methode geïntroduceerd, die de doorvoer van proteomische studies verder verhoogt. In dit manuscript presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor 16-plex TMT-gebaseerde diepproteoomprofilering, inclusief voorbereiding van eiwitmonsters, enzymatische vertering, TMT-labelingsreactie, tweedimensionale reverse-phase vloeistofchromatografie (LC/LC) fractionering, tandem massaspectrometrie (MS/MS) en computationele gegevensverwerking. De cruciale kwaliteitscontrolestappen en verbeteringen in het proces die specifiek zijn voor de 16-plex TMT-analyse worden belicht. Dit gemultiplexte proces biedt een krachtig hulpmiddel voor het profileren van een verscheidenheid aan complexe monsters, zoals cellen, weefsels en klinische monsters. Meer dan 10.000 eiwitten en posttranslationele modificaties zoals fosforylering, methylering, acetylering en ubiquitinatie in zeer complexe biologische monsters van maximaal 16 verschillende monsters kunnen in een enkel experiment worden gekwantificeerd, wat een krachtig hulpmiddel biedt voor fundamenteel en klinisch onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Snelle ontwikkelingen in de massaspectrometrietechnologie hebben het mogelijk gemaakt om een hoge gevoeligheid en diepe proteoomdekking te bereiken in proteomics-toepassingen 1,2. Ondanks deze ontwikkelingen blijft samplemultiplexing het knelpunt voor onderzoekers die zich bezighouden met de analyse van een groot steekproefcohort.

Gemultiplexte isobare labeltechnieken worden op grote schaal gebruikt voor proteoombrede relatieve kwantificering van grote batches monsters 3,4,5,6. Kwantificering op basis van tandemmassatags (TMT) is een populaire keuze vanwege de hoge multiplexingcapaciteit 7,8. TMT-reagentia werden aanvankelijk gelanceerd als een 6-plex-kit die in staat was om tot 6 monsters tegelijk te kwantificeren9. Deze technologie werd verder uitgebreid om 10-11 monsters te kwantificeren10,11. Recent ontwikkelde 16-plex TMTpro-reagentia (hierna TMT16 genoemd) hebben de multiplexingcapaciteit verder verhoogd tot 16 monsters in een enkel experiment12,13. De TMT16-reagentia gebruiken een op proline gebaseerde reportergroep, terwijl 11-plex TMT een van dimethylpiperidine afgeleide reportergroep toepast. Zowel TMT11 als TMT16 gebruiken dezelfde aminereactieve groep, maar de massabalansgroep van TMT16 is groter dan die van TMT11, waardoor de combinatie van 8 stabiele C13- en N15-isotopen in de reporterionen 16 reporters kan bereiken (Figuur 1).

De toename van de multiplexingcapaciteit biedt een platform voor het ontwerpen van experimenten met voldoende replica's om statistische uitdagingen te overwinnen14. Bovendien helpen de extra kanalen in de 16-plex TMT de totale hoeveelheid uitgangsmateriaal per kanaal te verminderen, wat kan helpen bij de ontwikkeling van opkomende eencellige proteomics15. De hoge multiplexcapaciteit zal ook waardevol zijn bij het kwantificeren van posttranslationele modificaties, waarvoor doorgaans grote hoeveelheden uitgangsmateriaal nodig zijn16,17.

Proteomische workflows die gebruik maken van TMT-technologie zijn gestroomlijnd 18,19,20, en ze zijn de afgelopen tien jaar aanzienlijk geëvolueerd op het gebied van monstervoorbereiding, vloeistofchromatografiescheiding, massaspectrometrische gegevensverzameling en computationele analyse 21,22,23,24,25,26 . Ons vorige artikel geeft een diepgaand overzicht van het 10-plex TMT-platform27. Het hier beschreven protocol introduceert een gedetailleerde, geoptimaliseerde methode voor TMT16, inclusief eiwitextractie en -vertering, TMT16-etikettering, pooling en ontzouting van monsters, basische pH en zure pH omgekeerde fase (RP) LC, MS met hoge resolutie en gegevensverwerking (Figuur 2). Het protocol belicht ook de belangrijkste kwaliteitscontrolestappen die zijn opgenomen voor het succesvol afronden van een kwantitatief proteomics-experiment. Dit protocol kan routinematig worden gebruikt om meer dan 10.000 eiwitten met een hoge reproduceerbaarheid te identificeren en te kwantificeren, om biologische routes, cellulaire processen en ziekteprogressie te bestuderen 20,28,29,30.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke weefsels voor de studie werden verkregen met goedkeuringen van het Brain and Body Donation Program van het Banner Sun Health Research Institute.

1. Eiwitextractie uit weefsel en kwaliteitscontrole

OPMERKING: Om de impact van het oogsten van monsters op het proteoom te verminderen, is het van cruciaal belang om monsters te verzamelen in een minimale tijd bij lage temperatuur, indien mogelijk31. Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van posttranslationele modificaties, omdat ze doorgaans labiel zijn, sommige fosforyleringsgebeurtenissen hebben bijvoorbeeld slechts enkele seconden halfwaardetijd32,33.

  1. Accijns- en weegweefselmonsters
    1. Tarreer een microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een analytische balans en koel de buis voor op droogijs.
    2. Snijd een bevroren weefsel (bijv. menselijk hersenweefsel, ~10 mg) uit een bepaald gebied in kleine stukjes en breng de stukjes weefsel onmiddellijk over in de voorgekoelde buis.
      OPMERKING: Om de heterogeniteit van de steekproef te verminderen, is het belangrijk om homogene groottes en anatomische regio's te gebruiken voor alle 16 monsters. De hoeveelheid eiwit die uit het weefsel wordt verkregen, is doorgaans 5-10% van het weefselgewicht.
    3. Weeg de tube samen met de tissue en leg de tube direct op droogijs. Verwerk de overige 15 monsters volgens dezelfde procedure. Bewaar de monsters onmiddellijk na dissectie in droogijs en bewaar ze bij 80 °C.
  2. Lyse-weefselmonsters
    1. Bereid verse lysisbuffer (50 mM HEPES pH 8,5, 8 M ureum en 0,5% natriumdeoxycholaat) op de dag van het experiment. Fosfataseremmers moeten aan de lysisbuffer worden toegevoegd om de fosforyleringstoestand van eiwitten te behouden.
      OPMERKING: Zet de lysisbuffer op kamertemperatuur voordat u deze gebruikt, aangezien 8 M ureum op ijs zal neerslaan, wat kan resulteren in onvolledige eiwitdenaturatie tijdens de lysis van het monster en de efficiëntie van de eiwitvertering kan verminderen.
    2. Voeg de lysisbuffer toe (voeg 100 μL lysisbuffer per 10 mg weefsel toe om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 5 tot 10 μg/μL te bereiken) en glasparels (~20% van het lysaatvolume, 0,5 mm diameter) aan elk monster.
    3. Lyseer het weefsel in een blender bij 4 °C met een snelheidsinstelling 8 gedurende 30 s, rust gedurende 5 s, herhaal dit totdat de monsters zijn gehomogeniseerd (~ 5 cycli).
  3. Bereid aliquots van de lysaten.
    1. Bereid ten minste twee aliquots voor elk monster. Een klein aliquoot (~10 μL) wordt gebruikt voor de analyse van de eiwitconcentratie en de evaluatie van de eiwitkwaliteit (bijv. validatie van positieve controle-eiwitten door western blotting). Een groter aliquoot (~50 μL) wordt gebruikt voor proteoomanalyse.
    2. Vries de aliquots onmiddellijk in op droogijs en bewaar ze bij -80 °C tot verder gebruik.
  4. Meet de eiwitconcentratie
    OPMERKING: De eiwitconcentratie kan worden gemeten met de BCA-test of korte SDS-gelkleuringsmethode34 (Figuur 3A). Omdat de niet-eiwitreducerende componenten in het weefsellysaat de meting in de BCA-test kunnen beïnvloeden, kunnen gebruikers de eiwitconcentratie valideren met behulp van de korte SDS-gelkleuringsmethode. De korte SDS-gelkleuringsmethode wordt hier gepresenteerd.
    1. Verdun 16 verdeelde monsters met een factor 10 en bereid de BSA-standaard voor (bijv. BSA-titraties van 0,15, 0,5, 1,5 en 3 μg).
    2. Voer de monsters en de BSA-standaard uit op een 10% SDS-PAGE-gel (26 putjes) met een stapelgel totdat alle eiwitten ongeveer 3 mm in de gel zijn gemigreerd.
    3. Kleur de gel 1 uur lang met Coomassie blue en verwijder de kleur van de gel totdat de achtergrond in het lege gebied helder is.
    4. Scan de gel om de intensiteit van Coomassie-gekleurde eiwitbanden te meten met ImageJ en maak een BSA-standaardcurve op basis van de metingen.
    5. Bereken de absolute eiwitconcentratie aan de hand van de standaardcurve.
      OPMERKING: De uiteindelijke eiwitconcentratie voor elk monster in dit experiment was ~5-10 μg/μL. Voor op TMT16 gebaseerde proteomics-analyse is 50 μg eiwit per monster (totaal 0,8 mg eiwit voor analyse van het hele proteoom) voldoende.
  5. Kwaliteitscontrole van monsters
    OPMERKING: Deze kwaliteitscontrolestap is van cruciaal belang om monsters van lage kwaliteit te identificeren voordat de TMT-analyse wordt uitgevoerd. Voor monsters met een bekende eiwitverandering wordt voorgesteld om de verandering te valideren door middel van western blotting. Standaard SDS-PAGE-analyse wordt ook aanbevolen om eiwitpatronen te onderzoeken en monsters met een hoge mate van afbraak uit te sluiten (Figuur 3B).
    1. Neem ~10 μg van elk monster uit de kleine hoeveelheid en voer monsters uit op een gradiënt SDS-PAGE-gel totdat de broomfenolblauwe kleurstof de bodem van de gel bereikt.
    2. Kleur de gel met Coomassie blue en verwijder de kleur. Inspecteer de eiwitkwaliteit om sterk afgebroken eiwitmonsters te verwijderen.
      OPMERKING: Gedegradeerde monsters kunnen worden geïdentificeerd als monsters met zeer weinig eiwitbanden in het gebied met een hoog moleculair gewicht en geïntensiveerde banden in het gebied met een laag molecuulgewicht (Figuur 3B).

2. In-solution eiwitvertering, peptidereductie en alkylering, spijsverteringsefficiëntietest en peptideontzouting

  1. Eiwitvertering door Lys-C en trypsine
    1. Neem ~50 μg eiwit uit het grote gewicht van elk monster en voeg lysisbuffer toe aan 50 μL.
    2. Voeg 100% acetonitril (ACN) toe om een uiteindelijke concentratie van 10% te bereiken.
    3. Voer de Lys-C-vertering uit door Lys-C toe te voegen in een eiwit:Lys-C-verhouding van 100:1 (w/w) en gedurende 3 uur bij kamertemperatuur te incuberen.
    4. De monsters worden verdund tot een eindconcentratie van 2 M ureum bij 50 mM HEPES (pH 8,5).
    5. Voeg trypsine toe aan elk monster in een eiwit:trypsineverhouding van 50:1 (w/m) en voer de digestie uit bij kamertemperatuur gedurende 3 uur of een nacht.
  2. Peptidereductie en alkylering
    1. Voeg vers bereide dithiothreitol (1 M DTT) oplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de disulfidebindingen te verminderen.
    2. Voeg vers bereide jodoacetamide (1 M IAZ)-oplossing toe aan een eindconcentratie van 10 mM gedurende 30 minuten in het donker om cysteïneresiduen te alkyleren.
    3. Blus de niet-gereageerde IAZ door 1M DTT toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 30 mM en incubeer nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Onderzoek de efficiëntie van de spijsvertering
    1. Neem ~1 μg van elk monster en ontzout met behulp van met C18-hars beklede pipetpunten volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Analyseer elk monster door een korte gradiënt LC-MS/MS-uitvoering (zie meer details in stap 5).
    3. Voer een databasezoekopdracht uit voor onbewerkte MS-gegevens (zie meer details in stap 6). Bereken het percentage geïdentificeerde peptiden met ten minste één trypsine-splitsingsplaats. Het percentage ligt meestal onder de 15%.
    4. Als het percentage groter is dan 15%, voeg dan extra trypsine toe aan de monsters om de vertering te herhalen.
    5. Verzuur de monsters na de vertering door TFA toe te voegen aan 0,5% (v/v). Controleer de pH met een pH-strip om er zeker van te zijn dat de pH lager is dan 3.
  4. Peptide ontzouten
    1. Centrifugeer de aangezuurde peptiden op 21.000 x g gedurende 10 min. Breng de bovenstaande middelen over in een nieuwe buis.
    2. Was C18 ontziltingskolommen (~25 μL hars) tweemaal met 250 μL 100% methanol door te centrifugeren op 500 x g gedurende 30 s.
      OPMERKING: Om het verlies van peptiden tijdens het ontzoutingsproces te verminderen, kiest u ontzoutingskolommen met een bindingscapaciteit die past bij de hoeveelheid input.
    3. Was de kolommen twee keer met 250 μL elutiebuffer (60% ACN, 0,1% TFA) door gedurende 30 s te centrifugeren op 500 x g .
    4. Breng de kolommen tweemaal in evenwicht met 250 μL equilibratie en wasbuffer (0,1% TFA) door gedurende 30 s te centrifugeren op 500 x g .
    5. Laad monsters op de voorgebalanceerde kolommen. Laat de monsters 6 minuten lang op 100 x g aan kolommen binden. Zorg ervoor dat alle oplossing door de kolom is gegaan.
    6. Was de kolommen driemaal met 250 μL evenwicht en wasbuffer door te centrifugeren op 500 x g gedurende 30 s.
    7. Elueer de peptiden door 125 μL elutiebuffer aan elke kolom toe te voegen en gedurende 3 minuten op 100 x g te draaien. Controleer of de kolom geen resten van de oplossing bevat.
    8. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator en bewaar de peptiden bij -80 °C voor toekomstige TMT-labeling.

3. TMT16-etikettering van peptiden, etiketteringsefficiëntietest, pooling van monsters en gelabeld peptide-ontzouten

  1. TMT16 labeling van peptiden
    1. Resuspendeer elk ontzilt peptidemonster in 50 μL 50 mM HEPES (pH 8,5) door meerdere keren te vortexen of ultrasoon op te lossen, gevolgd door het gebruik van een pH-strip om de pH te controleren.
      OPMERKING: Het monster kan zuur zijn als het niet volledig wordt gedroogd voordat het wordt geëtiketteerd, wat een negatieve invloed heeft op de efficiëntie van de etikettering. Zorg ervoor dat de pH tussen 7 en 8 ligt.
    2. Neem ~1 μg niet-gelabelde peptiden uit elk monster als negatieve controles voor de TMT-labelefficiëntietest.
    3. Los TMT16-reagentia op in watervrij ACN. Voer de etiketteringsreactie uit door de reagentia toe te voegen in een TMT:eiwitverhouding van 1,5:1 (w/w) en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
      OPMERKING: De TMT:eiwitverhouding die voor TMT16 wordt gebruikt, is 50% hoger dan de verhouding die voor TMT11 wordt gebruikt. Deze kleine discrepantie kan te wijten zijn aan het feit dat de molecuulmassa van TMT16 groter (1,2-voudig) is dan die van TMT11-reagentia. De eiwithoeveelheid wordt geschat op basis van de monsters zonder rekening te houden met het verlies tijdens het ontzouten.
  2. Efficiëntietest voor etikettering
    1. Neem ~1 μg gelabelde peptiden uit elk monster voor de etiketteringsefficiëntietest. Breng de resterende monsters op -80 °C zonder de reactie te doven.
    2. Ontzout ~1 μg van elk TMT16-gelabelde en niet-geëtiketteerde monsters met C18-harsgecoate pipetpunten volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Analyseer de monsters met LC-MS/MS (zie hoofdstuk 5, met uitzondering van de gradiënt van 10 min).
    4. Schat de labelefficiëntie door de MS1-intensiteitsreductie van niet-gelabelde peptiden tussen niet-gelabelde en gelabelde monsters te analyseren. Selecteer 6 tot 10 verschillende peptiden om de etiketteringsefficiëntie te verifiëren om ervoor te zorgen dat alle peptiden worden geëtiketteerd.  Voor volledige etikettering worden niet-gelabelde peptiden niet waargenomen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om te zorgen voor de volledige etikettering van alle monsters voor stroomafwaarts nauwkeurige eiwitidentificatie en kwantificering.
    5. Als de etikettering niet volledig is, voeg dan extra TMT-reagentia toe om de resterende peptiden te labelen en controleer de etiketteringsefficiëntie opnieuw voordat u deze afschrikt. Nadat het monster volledig is geëtiketteerd, dooft u de reactie bij kamertemperatuur door hydroxylamine toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en incubeert u gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Monster poolen en ontzouten
    1. Verzamel de helft van elk TMT-gelabeld monster om een mengsel te maken.
    2. Neem 1 μg uit het mengsel en ontzout met C18-harsgecoate pipetpunten en analyseer vervolgens met LC-MS/MS met een korte gradiënt (~30 min).
    3. Bereken de relatieve concentratie aan de hand van de gemiddelde intensiteit van elke TMT16-reporter en vergelijk de verschillen tussen de 16 kanalen. Om een gelijkmatige menging van elk kanaal te bereiken, voegt u de rest van de TMT-gelabelde monsters toe aan het mengsel volgens de berekende gemiddelde intensiteit. Herhaal de aanpassing totdat alle monsters gelijkmatig zijn gemengd. Representatieve gegevens die het proces van het poolen van monsters laten zien, worden weergegeven in tabel 1.
      OPMERKING: Omdat pipetteerfouten van invloed kunnen zijn op de nauwkeurigheid van de concentraties en de kwantificering van het eiwit, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid wordt gepoold. De verschillen in intensiteit tussen 16 monsters moeten minder dan 5% zijn.
  4. Gelabeld peptide ontzouten
    OPMERKING: Omdat de achtergrondderivaten in de TMT16-labelingsreactie (bijv. TMTpro-NHOH van de hydroxylamine-afschrikreactie en TMTpro-OH van TMT-hydroxylering) hydrofoob zijn, wordt een uitgebreide wasconditie gebruikt voor TMT16-gelabelde monsters om de derivaten effectief te verwijderen. Er wordt gebruik gemaakt van de toevoeging van 5% ACN in de reguliere wasbuffer (0,1% TFA) en 10x bedvolume wasbuffer.
    1. Verzuur het gepoolde monster door 10% TFA toe te voegen aan pH < 3.
    2. Centrifugeer het gepoolde monster gedurende 10 minuten bij 21.000 x g en doe het bovenstaande in een nieuwe buis.
    3. Droog het monster met behulp van een vacuümconcentrator om ACN te verwijderen.
    4. Conditioneer een vastefase-extractiepatroon met een sorptiekolom van 50 mg door de kolom te wassen met 2 ml 100% methanol, gevolgd door 2 ml elutiebuffer (60% ACN plus 0,1% TFA) en ten slotte 2 ml wasbuffer (0,1% TFA).
    5. Laad het monster op de kolom. Pas het debiet aan op ~100 μL/min om de volledige omvang van de peptidebinding te garanderen. Sla de doorstroom op.
    6. Was de kolom drie keer met 1 ml wasbuffer.
    7. Elute peptiden met 1 ml elutiebuffer.
    8. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator en bewaar de peptiden bij -80 °C voor verdere fractionering.

4. Offline basis pH LC pre-fractionering

  1. Voorbereiding van het fractioneringssysteem
    1. Bereid buffer A (10 mM ammoniumformiaat, pH 8,0) en buffer B (10 mM ammoniumformiaat, 90% ACN, pH 8,0) voor op een krachtig LC-systeem met microliterstroom.
    2. Opstelling van een HPLC-kolom met overbrugde ethyleenhybride deeltjes (deeltjesgrootte van 3,5 μm, 4,6 mm × 25 cm) in een hoogwaardig LC-systeem met microliterstroom voor fractionering.
    3. Installeer een monsterlus van 100 μl en was de lus achtereenvolgens met 300 μl methanol, water en buffer A.
    4. Gebruik 100 μL van 1:1:1:1 verhouding isopropanol : methanol : acetonitril : water om de kolom te wassen. Breng vervolgens de kolom verder in evenwicht gedurende 0,5 uur in 95% van buffer A.
  2. Voorbereiding van het monster
    1. Los het gepoolde en ontzoute TMT16-monster op in 70 μL buffer A. Controleer of de pH van het monster ~ 8,0 is. Als het nog steeds zuur is, pas dan de pH aan op 8,0 met 28% ammoniumhydroxide (NH4OH).
      OPMERKING: Om sampleverlies te voorkomen, moet het samplevolume minder dan 70% van het lusvolume zijn.
    2. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 21.000 x g om neerslag te verwijderen.
  3. Fractionering en aaneenschakeling
    OPMERKING: Vóór echte monsterfractionering wordt een pilotexperiment ten zeerste aanbevolen om er zeker van te zijn dat het LC-systeem in goede staat verkeert. Dit kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid van uw werkelijke monster (~5%) of met een niet-TMT-gelabeld mengsel van peptiden.
    1. Injecteer het monster en fractioneer het volgens de volgende gradiënt: 5% buffer B gedurende 10 min, 5-15% buffer B gedurende 2 min, 15-45% buffer B gedurende 148 minuten en 45-95% buffer B gedurende 5 min. Gebruik een debiet van 0,4 ml/min.
    2. Stel de breukenverzamelaar in om elke 1 minuut breuken te verzamelen en 160 breuken in 4 cycli terug te voegen naar 40 breuken.
      OPMERKING: De aaneenschakeling wordt uitgevoerd door vroege, middelste en late LC-fracties die uit dezelfde interne tijd zijn geëlueerd, te combineren tot een aaneengeschakelde breuk. De aaneengeschakelde breuken hebben weinig overlap in de eerste dimensie van LC, waardoor het efficiënte gebruik van het elutievenster in de tweede dimensie LC wordt verhoogd. Bovendien kunnen de peptiden door middel van verschillende aaneenschakelingsrondes gelijkmatig worden verdeeld over alle aaneengeschakelde fracties. Het is aangetoond dat deze aanpak de proteoomdekking verhoogt in vergelijking met de analyse van individuele fracties35,36.
    3. Droog alle aaneengeschakelde fracties in een vacuümconcentrator en bewaar de gedroogde monsters bij -80 °C voor verdere LC-MS/MS-analyse.

5. Zure pH RPLC-MS/MS-analyse

  1. Zure pH RPLC-MS/MS systeemvoorbereiding
    1. Vul een lege kolom (75 μm ID met een tipopening van 15 μm) met 1,9 μm C18-hars tot een lengte van 10-15 cm.
    2. Verwarm de kolom op 65 °C met behulp van een vlinderverwarmer om de tegendruk te verminderen.
    3. Was de kolom grondig met 95% buffer B (3% dimethylsulfoxide, 0,2% mierenzuur en 67% ACN). Breng vervolgens de kolom volledig in evenwicht in 95% buffer A (3% dimethylsulfoxide en 0,2% mierenzuur).
    4. Controleer de prestaties van het LC-MS/MS-systeem door 100 ng hersenpeptiden of BSA-peptiden van ratten uit te voeren voordat de experimentele monsters worden geanalyseerd.
  2. LC-MS/MS-analyse van aaneengeschakelde breuken
    1. Reconstitueer de gedroogde peptiden uit de basische pH-fracties in 5% FA en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 21.000 × g. Breng het bovenstaande van elk monster over in een HPLC-injectieflacon.
    2. Laad ~1 μg peptiden van elke fractie op de kolom. De peptiden worden geëlueerd met een stroomsnelheid van 0,25 μL/min met een gradiënt van 60 minuten van 18-45% buffer B.
      OPMERKING: Om hoge identificatienummers te verkrijgen, voert u één breuk uit en past u de helling voor de resterende breuken aan op basis van de eerste run. De beste gradiënt moet gelijkmatig verdeelde peptiden hebben over de hele gradiënt (Figuur 4A).
    3. Gebruik de massaspectrometer met de volgende parameters voor de analyse van TMT16-gelabelde monsters: MS1-scans (volledig MS-scanbereik: 450-1600 m/z; Orbitrap-resolutie: 60.000; Automatisch versterkingsregeldoel: 1 x 106; maximale ionentijd: 50 ms) en 20 data-afhankelijke MS2-scans (Orbitrap-resolutie: 60.000; AGC-doelstelling: 1 x 105; maximale ionentijd: 110 ms; HCD genormaliseerde botsingsenergie: 32%; isolatievenster: 1,0 m/z; Isolatie offset: 0,2 m/z; dynamische uitsluiting: 10 s).
      OPMERKING: De parameters die hier worden gebruikt, zijn geoptimaliseerd voor één type massaspectrometer (zie materiaaltabel). Voor verschillende MS-instrumenten moeten gebruikers de instrumentparameters afstemmen om resultaten van hoge kwaliteit te bereiken. Een van de instellingen is het bewaken van genormaliseerde HCD-botsingsenergie, aangezien de optimale energie kan variëren tussen instrumenten en tussen TMT11 en TMT16.

6. Gegevensverwerking

OPMERKING: De gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van een JUMP-softwaresuite 37,38,39 inclusief een hybride database-zoekmachine (op basis van patronen en tags), filtersoftware die controleert op de false-discovery rate (FDR) van geïdentificeerde peptiden/eiwitten, en kwantificeringssoftware voor TMT-datasets. Afhankelijk van de situatie van een gebruiker kan data-analyse worden gedaan met behulp van andere commerciële of vrij beschikbare programma's.

  1. Database zoeken
    1. Converteer de .raw-bestanden van het MS-instrument naar .mzXML-bestanden en zoek MS2-spectra tegen een niet-redundante doel-lokdatabase40 gegenereerd op basis van UniProt-sequenties van menselijke eiwitten (of een andere geschikte soortspecifieke database) om de FDR van geïdentificeerde eiwitten te berekenen.
      OPMERKING: Genereer de niet-redundante database door eiwitsequenties uit Swiss-Prot- en TrEMBL-databases te combineren. Men kan ook aangepaste eiwitsequenties toevoegen die niet in die referentiedatabases zijn opgenomen, waaronder protease-gesplitste eiwitten, eiwitten met single nucleotide polymorfismen en gemeenschappelijke contaminanten.
    2. Voer zoekopdrachten uit met behulp van de volgende parameters. Massatolerantie voor precursor: 10 ppm; massatolerantie voor productionen: 15 ppm; Maximale gemiste splitsingen: 2; maximale wijzigingsplaatsen: 3; statische modificaties: 304.20715 Da voor TMT16-tags op Lys-residuen en N-termini, 57.02146 Da voor carbamidomethylering op Cys-residuen; dynamische wijziging: 15.99492 Da voor oxidatie op Met.
  2. Filter de zoekresultaten
    1. Filter de resulterende peptidespectrumovereenkomsten (PSM's) op peptidelengte (>6 aminozuren), massanauwkeurigheid van voorloperionen en op JUMP gebaseerde matchingscores (Jscore en ΔJn). Peptiden worden vervolgens gegroepeerd op peptidelengte, tryptische uiteinden, modificaties, gemiste splitsingsplaatsen en laadtoestand.
    2. Filter de gegevens verder met de overeenkomende scores om een FDR van minder dan 1% te bereiken op eiwit- (volledige-proteoomanalyse) of peptide- (fosfoproteoomanalyse) niveau.
      OPMERKING: Als peptiden/eiwitten met positieve controle ontbreken bij de filterstappen, kan de FDR worden verhoogd tot een redelijk niveau, zodat die peptiden/eiwitten kunnen worden gered.
    3. Voor de peptiden die door meer dan één lid van een eiwitfamilie worden gedeeld, clustert u de gematchte leden in één groep.
      OPMERKING: Met de regel van spaarzaamheid wordt de groep vertegenwoordigd door het homologe eiwit met het hoogste aantal gedeelde peptiden en andere eiwitten die overeenkomen met unieke peptiden.
  3. Kwantificering van eiwitten
    1. Kwantificeer eiwitten met behulp van een ingebouwd programma van een statistische softwaresuite om de ionenintensiteiten van TMT-reporters over alle gematchte PSM's samen te vatten.
    2. Extraheer TMT-reporterionintensiteiten uit elke geaccepteerde PSM en corrigeer de ruwe intensiteiten volgens de isotopenverdeling van elke labelreagentia (bijv. TMT16-126 genereert respectievelijk 92,6%, 7,2% en 0,2% van 126, 127C en 128C m/z-ionen) en filter PSM's met een lage intensiteit en/of veel ruis op basis van door de gebruiker gedefinieerde drempels. Normaliseer de kwantificeringsgegevens met behulp van bijgesneden gemiddelde (of mediaan) intensiteiten van monsters om belastingsbias te corrigeren.
    3. Bereken voor elk geïdentificeerd eiwit de gemiddelde gecentreerde intensiteiten over de monsters (d.w.z. relatieve intensiteiten) van gematchte PSM's en vat de relatieve intensiteiten van de PSM's samen door het steekproefsgewijze gemiddelde te nemen. Zet de relatieve signalen om in absolute signalen door de totale gemiddelde intensiteit van de drie meest voorkomende gematchte PSM's te vermenigvuldigen.
    4. Corrigeer kwantificeringsinterferentie met behulp van een eerder gerapporteerde y1-ionencorrectiebenadering37 die ervan uitgaat dat de y1-ionintensiteit gecorreleerd is met de ionenintensiteit van de reporter. Door de lineaire relatie tussen y1 en reporter-ionintensiteiten te schatten op basis van schone scans, wordt het interferentieniveau van de vervuilde y1-ionintensiteit in luidruchtige scans afgeleid en gecorrigeerd.
      OPMERKING: Voor TMT-gelabelde tryptische peptiden zijn K-TMT- en R-residuen twee representatieve y1-ionen (respectievelijk 376,27574 Da en 175,11895 Da) in een MS2-spectrum. Als slechts één y1-ion wordt gedetecteerd en consistent is met het geïdentificeerde peptide, wordt de MS2 beschouwd als een schone scan. Als beide y1-ionen worden gedetecteerd, wordt de MS2 beschouwd als een luidruchtige scan.
    5. Breng de eiwitkwantificeringswaarden over naar een spreadsheet voor verdere analyse. Gebruik methoden voor gegevensanalyse zonder toezicht, zoals PCA of clusteranalyse, om de verdeling van monsters te onderzoeken. Om differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te identificeren, gebruikt u statistische methoden zoals t-testing en variantieanalyse (ANOVA).

7. Validatie van MS-gegevens

OPMERKING: Voordat u tijdrovende biologische experimenten uitvoert, moet u ten minste één validatiemethode gebruiken om de kwaliteit van MS-gegevens te evalueren.

  1. Inspecteer handmatig de MS/MS-spectra van interessante eiwitten om de peptidesequentie en de ionenintensiteiten van de TMT-reporter te valideren.
  2. Gebruik op antilichamen gebaseerde benaderingen (bijv. Western blotting of immunohistochemie-analyse) om veranderingen in eiwitniveaus te verifiëren. Om de aanwezigheid van natuurlijke peptiden te bevestigen, gebruikt u synthetische peptiden als interne standaarden. De MS/MS-spectra en retentietijd van de peptiden tijdens LC-MS/MS moeten onder dezelfde omstandigheden identiek zijn.
  3. Gebruik een gerichte MS-aanpak om eiwitveranderingen te verifiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor de nieuw ontwikkelde TMT16, inclusief labelreactie, ontzouting en LC-MS-condities, is systematisch geoptimaliseerd41. Bovendien hebben we de 11-plex- en 16-plex-methoden rechtstreeks vergeleken door ze te gebruiken om dezelfde menselijke AD-monsters te analyseren41. Na optimalisatie van de belangrijkste parameters voor TMT16 leveren zowel TMT11- als TMT16-methoden een vergelijkbare proteoomdekking, identificatie en kwantif...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geoptimaliseerd protocol voor op TMT16 gebaseerde diepe proteoomprofilering is met succes geïmplementeerd in eerdere publicaties 12,13,41. Met dit huidige protocol kunnen meer dan 10.000 unieke eiwitten uit maximaal 16 verschillende monsters routinematig en met hoge precisie worden gekwantificeerd in een enkel experiment.

Om resultaten van hoge kwaliteit te verkri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 en U54NS110435) en ALSAC (American Libanese Syrian Associated Charities). De MS-analyse werd uitgevoerd in het Center of Proteomics and Metabolomics van het St. Jude Children's Research Hospital, dat gedeeltelijk wordt ondersteund door de NIH Cancer Center Support Grant (P30CA021765). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) BufferBioRad161-0772
4–20% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HydroxylamineThermo Scientific90115
6 X SDS Sample Loading BufferBoston Bioproducts IncBP-111R
Ammonium Formate (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Ammonium Hydroxide, 28%Sigma338818-100ml
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeaterPhoenix S&TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard Apparatus74-4607Gebruikt voor desalting
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formic AcidSigma94318
Fraction CollectorGilsonFC203B
Gel Code Blue Stain ReagentThermo24592
Glass BeadsNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Grade AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Grade WaterBurdick & JacksonAH365-4
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Mass SpectrometerThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Digestion StandardWaters186002329
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self-Pack ColumnsNew ObjectivePF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960Gebruikt voor desalting
Sodium DeoxycholateSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Label Reagent SetThermo ScientificA44520
Trifluoroacetic Acid (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsinPromegaV511C
Ultra-micro Spin Column,C18Harvard apparatus74-7206Gebruikt voor desalting
UreaSigmaU5378
Xbridge Column C18 columnWaters186003943Gebruikt voor basic pH LC

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  3. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  4. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  5. Moulder, R., Bhosale, S. D., Goodlett, D. R., Lahesmaa, R. Analysis of the plasma proteome using iTRAQ and TMT-based Isobaric labeling. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 583-606 (2018).
  6. Wang, H., et al. Deep multiomics profiling of brain tumors identifies signaling networks downstream of cancer driver genes. Nature Communications. 10 (1), 3718(2019).
  7. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  8. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  9. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical Chemistry. 80 (8), 2921-2931 (2008).
  10. Stepanova, E., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Filter-based protein digestion (FPD): A detergent-free and scaffold-based strategy for TMT workflows. Journal of Proteome Research. 17 (3), 1227-1234 (2018).
  11. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical Chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  12. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, synthesis, and initial evaluation of a proline-based isobaric 16-plex tandem mass tag reagent set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  13. Li, J., et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples. Nature Methods. 17 (4), 399-404 (2020).
  14. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  15. Labib, M., Kelley, S. O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nature Reviews Chemistry. 4 (3), 143-158 (2020).
  16. Ren, R. J., Dammer, E. B., Wang, G., Seyfried, N. T., Levey, A. I. Proteomics of protein post-translational modifications implicated in neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 3 (1), 23(2014).
  17. Pagel, O., Loroch, S., Sickmann, A., Zahedi, R. P. Current strategies and findings in clinically relevant post-translational modification-specific proteomics. Expert Review of Proteomics. 12 (3), 235-253 (2015).
  18. Mertins, P., et al. Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 13 (7), 1632-1661 (2018).
  19. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  20. Bai, B., et al. Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer's disease progression. Neuron. 105 (6), 975-991 (2020).
  21. Kelstrup, C. D., et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6187-6195 (2014).
  22. Meier, F., et al. Online parallel accumulation - serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (12), (2018).
  23. Schweppe, D. K., et al. Full-featured, real-time database searching platform enables fast and accurate multiplexed quantitative proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2026-2034 (2020).
  24. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. Journal of Proteome Research. 14 (2), 829-838 (2015).
  25. Dey, K. K., et al. Deep undepleted human serum proteome profiling toward biomarker discovery for Alzheimer's disease. Clinical Proteomics. 16, 16(2019).
  26. Bai, B., et al. Deep profiling of proteome and phosphoproteome by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, and mass spectrometry. Methods in Enzymology. 585, 377-395 (2017).
  27. High, A. A., et al. Deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification. Journal of Visualized Experiments. (129), e56474(2017).
  28. Chick, J. M., et al. Defining the consequences of genetic variation on a proteome-wide scale. Nature. 534 (7608), 500-505 (2016).
  29. Wang, Z., et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need. Nature. 558 (7710), 435-439 (2018).
  30. Tan, H., et al. Integrative proteomics and phosphoproteomics profiling reveals dynamic signaling networks and bioenergetics pathways underlying T cell activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  31. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764(2011).
  32. Kleiman, L. B., Maiwald, T., Conzelmann, H., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Rapid phospho-turnover by receptor tyrosine kinases impacts downstream signaling and drug binding. Molecular Cell. 43 (5), 723-737 (2011).
  33. Mertins, P., et al. Ischemia in tumors induces early and sustained phosphorylation changes in stress kinase pathways but does not affect global protein levels. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (7), 1690(2014).
  34. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  35. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  36. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  37. Niu, M., et al. Extensive peptide fractionation and y(1) ion-based interference detection method for enabling accurate quantification by isobaric labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (1), 2956-2963 (2017).
  38. Wang, X., et al. A tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3663(2014).
  39. Li, Y., et al. JUMPg: An integrative proteogenomics pipeline identifying unannotated proteins in human brain and cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (7), 2309-2320 (2016).
  40. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  41. Wang, Z., et al. 27-plex tandem mass tag mass spectrometry for profiling brain proteome in Alzheimer's disease. Analytical Chemistry. 92 (10), 7162-7170 (2020).
  42. Ow, S. Y., et al. iTRAQ underestimation in simple and complex mixtures: "The good, the bad and the ugly". Journal of Proteome Research. 8 (11), 5347-5355 (2009).
  43. Karp, N. A., et al. Addressing accuracy and precision issues in iTRAQ quantitation. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1885-1897 (2010).
  44. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  45. Gygi, J. P., et al. A triple knockout isobaric-labeling quality control platform with an integrated online database search. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1344-1349 (2020).
  46. Savitski, M. M., et al. Measuring and managing ratio compression for accurate iTRAQ/TMT quantification. Journal of Proteome Research. 12 (8), 3586-3598 (2013).
  47. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376(2002).
  48. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513(2014).
  49. Brenes, A., Hukelmann, J., Bensaddek, D., Lamond, A. I. Multibatch TMT reveals false positives, batch effects and missing values. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 1967-1980 (2019).
  50. Yu, J., Peng, J., Chi, H. Systems immunology: Integrating multi-omics data to infer regulatory networks and hidden drivers of immunity. Current Opinion in Systems Biology. 15, 19-29 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

16 plex TMT labelingeiwitmonsterbereidingenzymatische digestieLC LC fractioneringtandemmassaspectrometriecomputationele gegevensverwerking
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen