Eierstokkankerstamcellen (OCSC) zijn verantwoordelijk voor kankerinitiatie, recidief, therapeutische resistentie en metastase. De OCSC vasculaire niche wordt beschouwd als het bevorderen van zelfvernieuwing van OCSC's, wat leidt tot chemoresistance. Dit protocol vormt de basis voor het opzetten van een reproduceerbaar OCSC vasculair nichemodel in vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kankerstamcellen (CSC's) bevinden zich in een ondersteunende niche en vormen een micro-omgeving die bestaat uit aangrenzende stromale cellen, bloedvaten en extracellulaire matrix. Het vermogen van CSC's om deel te nemen aan de ontwikkeling van endotheel vormt een belangrijk kenmerk dat direct bijdraagt aan het algemene begrip van de mechanismen van tumorigenese en tumormetastase. Het doel van dit werk is om een reproduceerbare methodologie vast te stellen om het tumorinitiatievermogen van eierstokkankerstamcellen (OCSC's) te onderzoeken. Hierin onderzochten we het neovascularisatiemechanisme tussen endotheelcellen en OCSC's, samen met de morfologische veranderingen van endotheelcellen met behulp van het in vitro co-kweekmodel NICO-1. Dit protocol maakt visualisatie van de neovascularisatiestap rond de OCSC's mogelijk op een tijdsverloopmanier. De techniek kan inzicht geven in de angiogenetische eigenschappen van OCSC's bij tumormetastase.
Inleiding
Eierstokkanker is de achtste meest voorkomende maligniteit bij vrouwen wereldwijd, met ongeveer 300.000 nieuwe diagnoses en naar schatting 180.000 sterfgevallen per jaar1. Bij de eerste diagnose presenteert eierstokkanker zich vaak met ernstige symptomen, waarbij ongeveer 75% van de patiënten zich al in stadium III-IV bevindt. Dienovereenkomstig is de 5-jaarsoverleving <30% en het sterftecijfer is het hoogste onder gynaecologische kankers2, waarbij de efficiëntie van de behandeling van eierstokkanker sterk afhankelijk is van klinische factoren zoals het succesvol uitvoeren van debulkingchirurgie, resistentie tegen chemotherapie en herhaling na de initiële therapie.
Eierstokkankerweefsels zijn hiërarchisch georganiseerd, waarbij niet alle tumorcomponenten even goed in staat zijn om nakomelingen te genereren. De enige cellen die in staat zijn zichzelf te vernieuwen en een heterogene tumorcelpopulatie te produceren, worden beschouwd als kankerstamcellen (CSC's)3. CSC-zelfvernieuwing en tumorinitiatie gaan gepaard met de bevordering van angiogenese om hun tumormicro-omgeving te hermodelleren met als doel een ondersteunende niche te behouden. Eerdere modellen konden echter niet worden gebruikt voor in vitro analyses vanwege de beperkte reproduceerbaarheid van het kweken van CSC's afgeleid van klinische monsters als gevolg van de verstoring van sferoïden na meervoudige passaging. Meer recent zijn experimentele methoden ontwikkeld om CSC's van patiënten te kweken voor verschillende toepassingen 4,5,6,7. In het bijzonder, door gebruik te maken van het kenmerk van CSC's om te groeien door sferoïden te vormen in ultralage hechtingsplaten met serumvrij medium, worden de gecultiveerde CSC's geïnduceerd om een stamceloppervlakmarker tot expressie te brengen die niet tot expressie komt in normale tumorcellen met multilineaire differentiatiepotentiaal 8,9.
Recente gegevens hebben aangetoond dat de persistentie van slapende ovariële (O) CSC's gevisualiseerd als verspreiding aan het peritoneum geassocieerd is met hun regeneratie als terugkerende tumoren10. Inzicht in de moleculaire en biologische kenmerken van OCSC's kan dus effectieve targeting en uitroeiing van deze cellen mogelijk maken, wat resulteert in potentiële tumorremissie. In het bijzonder is er weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanistische kenmerken van CSC-rollen in angiogenese11. Daarom hebben we in het huidige protocol patiënt-afgeleide OCSC's in een in vitro setting gebruikt om de angiogene eigenschap van endotheelcellen te onderzoeken met behulp van het co-kweekmodel, dat de tumormicro-omgeving van CSC's en endotheelcellen op de gemetastaseerde plaats in de klinische setting kan nabootsen. Uiteindelijk, aangezien neovascularisatie een kritisch proces vormt dat nodig is om tumorgroei en metastase te ondersteunen, zal een beter begrip van het mechanisme de ontwikkeling van een nieuwe targetingtherapie voor OCSC's op de gemetastaseerde plaats mogelijk maken.
Hier presenteren we een protocol om de neovascularisatiestap rond de CSC's op een tijdsverloopmanier te visualiseren. Het voordeel van het protocol is het mogelijk maken van volledig reproduceerbaar onderzoek met behulp van het 3D-cocultuursysteem NICO-1, waardoor observatie van de effecten op patiënten van het ocsc-afgeleide tumorinitiatievermogen tijdens endotheelcelangiogenese mogelijk is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens het protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie voor menselijk welzijn. Alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het onderzoeksgebruik van hun monsters, en de verzameling en het gebruik van weefsels voor deze studie werden goedgekeurd door de Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee aan de Teikyo University.
1. Isolatie en kweek van eierstokkankerstamcellen (OCSC's) van patiënten met eierstokkanker en ascites in een bioveiligheidskast van niveau 2
- Isoleer kankerstamcellen van menselijke eierstokkanker ascites verkregen via paracentese. Verzamel ten minste 100-250 ml ascites van patiënten om voldoende kankerstamcellen te nemen. Evalueer daarnaast de expressieprofielen van kankerstamcelmarkers (d.w.z. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 en Oct4) en eierstokkankermarkers (pAX-8, WT-1) door flowcytometrie.
- Centrifugeer de menselijke eierstokkanker ascites bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur binnen 24 uur na ascites-aspiratie.
- Verwijder het supernatant en voeg 2 ml OCSC-medium en 8 ml 30% Histodenz/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) toe.
- Bereid OCSC-medium voor: StemPro hESC-supplement, DMEM⁄F-12 met L-glutamine (GlutaMAX-medium), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoethanol, 8 ng/ml FGF BASIC, 10 μM insuline en 20 μM Y-27632.
- Leg voorzichtig 2 ml OCSC-medium over de celoplossing in stap 1.1.2 in een buis van 15 ml en centrifugeer op 450 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een zwenkbakrotor zonder te remmen.
- Breng de OCSC-laag (ongestoord in de interfase) voorzichtig over naar een nieuwe buis van 15 ml via een transferpipet.
- Vul met PBS tot 15 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Resuspensie de celpellet in OCSC-medium en zaad op een ultra-low-attachment kweekschaal; culturen moeten worden gehandhaafd op 37 °C in 5% CO2.
- Verander het medium om de drie dagen. Laat de kweekschaal ongeveer 1 minuut staan en gooi een deel van het supernatant weg en voeg het nieuwe medium toe.
- Passage van CSC's
- Verzamel OCSC's in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, vul met PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml van de celloslatingsoplossing toe, bestaande uit proteolytische en collagenolytische enzymen (bijv. AccuMax) en incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Meng goed door te pipetteren en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Zorg ervoor dat cellen zich in één suspensie bevinden.
- Meng goed door te pipetteren, vul met PBS en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in OCSC-medium voor daaropvolgende zaaiing op kweekschalen met ultralage hechting en onderhoud bij 37 °C in 5% CO2.
2. HUEhT-1 endotheelcelkweek
- Passage van HUEhT-1 cellen
- Haal medium uit de HUEhT-1 kweekschaal en was de cellen met PBS.
- Voeg 1 ml 0,025% trypsine toe en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ml endotheelcelgroeimedium 2 toe, verzamel cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in HUEhT-1 medium en zaai de cellen op collageen gecoate kweekschalen gevolgd door onderhoud bij 37 °C in 5% CO2.
- Verander het medium om de drie dagen.
3. Bereiding van de NICO-1 cocultuurplaat voor buisvormingstest met HUEhT-1-cellen
- Monteer NICO-1 en coating met de extracellulaire hydrogel op basis van matrix (Matrigel Matrix).
- Monteer één kant van NICO-1 volgens de instructies van de fabrikant en houd deze op ijs.
- Bedek het oppervlak van NICO-1 met 300 μL koud PBS en verwijder vervolgens de buffer.
- Voeg 300 μL gekoelde extracellulaire hydrogel op basis van matrix toe en incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten.
- Om in evenwicht te komen, dompelt u het filter onder met 100% ethanol en wast u vervolgens een 13 mm ICCP-filter (0,6 μm) met PBS gedurende 1 minuut.
- Monteer de NICO-1 inclusief de hoofdgedeelten A (rechterkamer) en B (linkerkamer) samen met de O-ring en het gebalanceerde filter.
4. Hueht-1-cellen en CSC's op het NICO-1-systeem zaaien
- Bereid HUEhT-1 celsuspensies door de celmonolagen te trypsiniseren en de cellen in endotheelcelgroeimedium te resuspenderen met 2% foetaal kalfsserum.
- Voeg 1,2 ml van de celsuspensie (1,5 x 105 cellen) toe aan elke extracellulaire hydrogel-gecoate put op basis van matrix.
- Voeg 1,5 ml OCSC's gekweekt gedurende vijf dagen toe aan de andere put.
- Incubeer NICO-1 bij 37 °C in 5% CO2; buisvorming kan worden waargenomen onder de microscoop en netwerkvorming op extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel gemeten door middel van het aantal takken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We verzamelden ascitesvloeistoffen verkregen van patiënten met gevorderde eierstokkanker tijdens een operatie of paracentese met als doel een langdurige stabiele kweek voor sferoïden uit te voeren. Hier presenteren we gevallen van een langdurige sferoïde cultuur van ovariële CSC's genaamd CSC1 en CSC2. Beide cellijnen dragen dezelfde diagnose en histologische profielen. De mechanistische rollen van OCSC's die ten grondslag liggen aan de interactie met endotheelcellen die nodig zijn om de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe de tumormicro-omgeving van OCSC's in een in vitro setting kan worden nagebootst. De primaire component van de methode vormt het zeer reproduceerbare cocultuurmodel dat is verkregen met behulp van het NICO-1-systeem, een indirect Transwell-cocultuursysteem. Veel van de momenteel beschikbare cocultuurmodellen onderzoeken de effecten van direct cel-celcontact op coculturele celpopulaties 12,13,14,15,16,17,18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research C (subsidie nr. 19K09834 aan K.N.) van het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur, Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endotheelcel Groeimedium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cel | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, menselijk | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscoop | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
Referenties
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413(2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
