De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Bij de ziekte van Alzheimer (AD) en andere neurodegeneratieve aandoeningen is oligodendrogliaal falen een veel voorkomend vroeg pathologisch kenmerk, maar hoe het bijdraagt aan de ontwikkeling en progressie van de ziekte, met name in de grijze stof van de hersenen, blijft grotendeels onbekend. De disfunctie van oligodendrocytenafstammingscellen wordt gekenmerkt door tekortkomingen in myelinisatie en verminderde zelfvernieuwing van oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's). Deze twee defecten worden ten minste gedeeltelijk veroorzaakt door de verstoring van interacties tussen neuronen en oligodendrocyten langs de opbouw van pathologie. OPC's geven aanleiding tot myeliniserende oligodendrocyten tijdens de ontwikkeling van het CZS. In de volwassen hersenschors zijn OPC's de belangrijkste proliferatieve cellen (bestaande uit ~ 5% van de totale hersencellen) en controleren nieuwe myelinevorming op een neurale activiteitsafhankelijke manier. Dergelijke neuron-naar-oligodendrocytencommunicatie wordt aanzienlijk onderbelicht, vooral in de context van neurodegeneratieve aandoeningen zoals AD, vanwege het gebrek aan geschikte hulpmiddelen. In de afgelopen jaren hebben onze groep en anderen aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het verbeteren van de momenteel beschikbare protocollen om functionele neuronen en oligodendrocyten individueel te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen. In dit manuscript beschrijven we onze geoptimaliseerde procedures, waaronder het opzetten van een co-kweeksysteem om de neuron-oligodendrocytenverbindingen te modelleren. Onze illustratieve resultaten suggereren een onverwachte bijdrage van OPC's / oligodendrocyten aan de amyloïdose van de hersenen en synapsintegriteit en benadrukken het nut van deze methodologie voor AD-onderzoek. Deze reductionistische benadering is een krachtig hulpmiddel om de specifieke hetero-cellulaire interacties te ontleden uit de inherente complexiteit in de hersenen. De protocollen die we hier beschrijven, zullen naar verwachting toekomstige studies naar oligodendrogliale defecten in de pathogenese van neurodegeneratie vergemakkelijken.
Inleiding
Oligodendrocytenafstammingscellen - inclusief oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's), myeliniserende oligodendrocyten en overgangstypen daartussenin - vormen een belangrijke groep menselijke hersencellen1 die actief deelnemen aan vele kritieke functies voor de juiste werking en het onderhoud van ons centrale zenuwstelsel tijdens de neurale ontwikkeling en veroudering 2,3,4 . Hoewel oligodendrocyten bekend staan om het produceren van myeline om de overdracht van neuronale activiteit te vergemakkelijken en de axonale gezondheid in witte stof te onderste....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Inductie van menselijke neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen
- Lentivirus voorbereiding (~ 5 dagen, gedetailleerd protocol zoals eerder beschreven16)
- Plaat ~ 1 miljoen HEK293T-cellen per T75-kolf, om ze ~ 40% confluent te hebben bij het uitvoeren van transfectie. Transfecteer ze met plasmiden die tetracycline-induceerbare Ngn2 en puromycine-resistent gen (PuroR; onder dezelfde TetO-promotorcontrole) tot expressie brengen, rtTA en de drie helperplasmiden pRSV-REV, pMDLg / pRRE en VSV-G (12 μg lentiviral vector-DNA en 6 μg van elk van het helperplasmide-DNA). Bereid ten minste drie kolven per lentiviruspreparaat. Gebr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Directe generatie van door de mens geïnduceerde neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen
Het is van groot belang dat de startende menselijke pluripotente stamcellen een hoge mate van pluripotentie vertonen voor een succesvolle generatie van iN's of iOPCs/iOL's. Daarom moeten cellen worden gekleurd voor specifieke markers, zoals Oct4 en SOX2, voordat ze beginnen met een van de inductieprotocollen die in dit manuscript worden beschreven (figuur 1A). Menselijke H1-cel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Naast de fysieke en metabole ondersteuning om de synapsstructuren te stabiliseren en de zoute signaalgeleiding door myelinisatie te vergemakkelijken, kunnen oligodendrocytenafstammingscellen een neuronaal activiteitspatroon vormen via snelle en dynamische kruisgesprekken met neuronen 5,6,7. Terwijl in de AD-pathologie de oligodendrogliale responsen aanvankelijk werden beschouwd als slechts secundair aan ontsteking en oxidatieve .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de subsidies van National Institutes of Health (R00 AG054616 aan Y.A.H. en T32 GM136566 aan K.C.), Stanford University School of Medicine en een Siebel Fellowship (toegekend aan S.C.). Y.A.H. is een GFL Translational Professor van het Center for Translational Neuroscience in het Brown Institute for Translational Sciences.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
Referenties
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 6....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.
The fourth paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F).
