Methodenartikel

Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie

DOI:

10.3791/61807

⸱

18 september 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet, 2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh, 3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet, 4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een methode om Mycobacterium tuberculosis infectie in menselijke M1- of M2-gepolariseerde macrofagen te bestuderen op basis van differentiatie van perifere bloed-monocyten naar macrofaag-achtige cellen die zijn geïnfecteerd met de GFP-gelabelde virulente stam H37Rv, en geanalyseerd met flowcytometrie met behulp van een 10-kleurenpaneel inclusief expressie van geselecteerde M1/M2 markers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke macrofagen zijn primaire gastheercellen van intracellulaire Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infectie en spelen dus een centrale rol in de immuuncontrole van tuberculose (TB). We hebben een experimenteel protocol opgesteld om immuunpolarisatie van myeloïde-afgeleide cellen in M1 (klassiek geactiveerd) of M2 (alternatief geactiveerd) macrofaag-achtige cellen te volgen door beoordeling met een cytometriepaneel met 10 kleurenstroom dat visualisatie en diepe karakterisering van groen-fluorescerend eiwit (GFP)-gelabelde Mtb in verschillende macrofagen subsets mogelijk maakt. Monocyten verkregen uit gezonde bloeddonoren werden gepolariseerd in M1- of M2-cellen met behulp van differentiatie met granulocyt macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) of macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) gevolgd door polarisatie met respectievelijk IFN-γ en lipopolysaccharide (LPS) of IL-4. Volledig gepolariseerde M1- en M2-cellen werden gedurende 4 uur geïnfecteerd met Mtb-GFP voordat losgemaakte Mtb-geïnfecteerde macrofagen werden gekleurd met flowcytometrie na 4 of 24 uur na infectie. Monsterverwerving werd uitgevoerd met flowcytometrie en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometrieanalysesoftware. Handmatige gating en dimensionaliteitsreductie met Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) en fenograafanalyse werden uitgevoerd. Dit protocol resulteerde in effectieve M1/M2 polarisatie gekenmerkt door verhoogde niveaus van CD64, CD86, TLR2, HLA-DR en CCR7 op niet-geïnfecteerde M1-cellen, terwijl niet-geïnfecteerde M2-cellen een sterke up-regulatie vertoonden van de M2 fenotype markers CD163, CD200R, CD206 en CD80. M1-gepolariseerde cellen bevatten doorgaans minder bacteriën in vergelijking met M2-gepolariseerde cellen. Verschillende M1/M2 markers werden gereguleerd na Mtb infectie, wat suggereert dat Mtb macrofaag polarisatie kan moduleren. Bovendien bleken 24 verschillende celclusters van verschillende grootte op unieke wijze te zijn verdeeld over de niet-geïnfecteerde M1- en M2-en Mtb-geïnfecteerde cellen na 24 uur na infectie. Dit M1/M2 flow cytometrie protocol kan worden gebruikt als ruggengraat in Mtb-macrofaag onderzoek en worden aangenomen voor speciale behoeften op verschillende gebieden van onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen zijn immuuncellen die aanzienlijk bijdragen aan de regulatie van weefselhomeostase, ontstekingen en ziektepathologieën. Omdat het een essentieel onderdeel is van aangeboren immuniteit, drukt de monocyt-macrofaaglijn van cellen heterogene fenotypen uit als reactie op veranderde omgevingssignalen, die hun plasticiteit en aanpassing aan verschillende anatomische en immunologische locaties weerspiegelen1. Afhankelijk van de groeifactoren, cytokinen en andere bemiddelaars in het micromilieu, zijn macrofagen gecategoriseerd in twee belangrijke omkeerbare populaties, elk met een andere rol in bacteriële controle en klaring2: de pro-inflammatoire, klassiek geactiveerde M1-gepolariseerde macrofagen en de ontstekingsremmende, alternatief geactiveerde M2-gepolariseerde macrofagen die oorspronkelijk werden genoemd om T-helper (Th) celnomenclatuur na te bootsen3. Deze groepering van immuungepolariseerde macrofagen wordt vaak als simplistisch beschouwd, aangezien macrofaagactivatie en differentiatie niet lineair is, maar nauwkeuriger wordt geïllustreerd als een continuüm waarbij elke populatie verschillende kenmerken en functionele rollen heeft in de uitkomst van ziekteontwikkeling en progressie4,5,6,7. Toch zijn er tal van experimentele voordelen met het M1/M2 macrofaagmodel dat in verschillende onderzoeksgebieden kan worden gebruikt.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is de veroorzaker van tuberculose (TBC) en infecteert naar schatting elke seconde één persoon en wordt beschouwd als het meest dodelijke infectieuze agens ter wereld (Global TB report 2019). Aangezien de luchtwegen de belangrijkste route van Mtb-infectie zijn, zijn alveolaire macrofagen de voorkeursgastcellen die met Mtb worden geïnfecteerd en vertegenwoordigen zowel de primaire barrières als het infectieuze reservoir voor Mtb in de longen. Macrofaagpolarisatie als reactie op verschillende stimuli is in de loop der jaren uitgebreid bestudeerd7 en in het grootste deel van het gepubliceerde werk wordt M1-polarisatie van monocytculturen in vitro geïnduceerd door Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) samen met IFN-γ en LPS8,9, terwijl M2-polarisatie wordt geïnduceerd met Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) en IL-410,11. De M1-macrofagen zijn krachtige effectorcellen die antimicrobiële reacties tegen intracellulaire pathogenen bemiddelen en een essentiële rol spelen bij antitumorimmuniteit12. M2-macrofagen daarentegen hebben een ontstekingsremmende functie, een hoge fagocytische capaciteit en zijn voornamelijk betrokken bij wondgenezing en weefselherstel, evenals bij parasietinfecties12. Dienovereenkomstig worden M1-macrofagen als effectiever beschouwd bij intracellulaire controle van Mtb in vergelijking met M2-macrofagen13. Mtb-bacteriën hebben echter ook het potentieel om macrofaagpolarisatie te moduleren om aangeboren immuniteit te ondermijnen14,15,16,17.

Hoewel het gebruikelijk is macrofagen te genereren uit differentiatie van monocyten verkregen uit perifeer bloed18, kunnen macrofagen ook worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC 's)19 of uit van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen20,21. Dit zijn haalbare technieken om primaire macrofaagcellen te bestuderen die zijn verkregen uit monocyt/macrofaagvoorlopers die zich zullen verspreiden en differentiëren in een homogene populatie van volwassen macrofaagachtige cellen. Deze protocollen bieden echter zelden verdiepte kennis over het fenotype en de functie van de verkregen cellen en houden geen rekening met de natuurlijke heterogeniteit die wordt waargenomen bij macrofagen die in vivo worden verkregen. Omdat Mtb een strikte menselijke ziekteverwekker is, is er ook een voordeel om Mtb te bestuderen in gemenselijkede modelsystemen. Flow cytometrie is een krachtige technologie die de mogelijkheid biedt om meerdere fenotypische en functionele kenmerken van afzonderlijke cellen in suspensie22te beoordelen , iets dat vrij uitdagend kan zijn met aanhangende cellen zoals macrofagen waarvan ook bekend is dat ze autofluorescent zijn23,24. Naast chemische ontkoppeling van stevig hechtende macrofagen, kan Mtb-infectie een significante stressfactor vormen voor de cellen die een ander niveau van complexiteit toevoegt in flowcytometrische analyses van Mtb-geïnfecteerde macrofagen.

In dit experimentele protocol hebben we een eerder vastgesteld humaan macrofaaginfectiemodel gebruikt op basis van immuunpolarisatie van primaire perifere-bloedmonocyten-afgeleide cellen die zijn geïnfecteerd met de virulente laboratorium Mtb-stam H37Rv, en geanalyseerd met flowcytometrie met behulp van een 10-kleurenpaneel inclusief expressie van geselecteerde M1- en M2-markers25. Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare methode om reacties op Mtb-infectie in M1- of M2-gepolariseerde monocyt-afgeleide macrofagen te bestuderen. Bovendien stelt het gebruik van flowcytometrie op aanhangende Mtb-geïnfecteerde macrofagen ons in staat om een verscheidenheid aan oppervlaktemarkers te bestuderen die verband houden met conventionele M1- en M2-macrofagen en hun longitudinale reactie op Mtb-infectie. Belangrijk is dat dit protocol gemakkelijk kan worden aangenomen voor onderzoek naar infecties met andere pathogenen, in antitumorstudies of in studies naar ontstekingsaandoeningen, voor geneesmiddelenscreening enz. en kan ook worden gebruikt voor de beoordeling van M1/M2 macrofaagpolarisatie in menselijke klinische monsters.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijk perifeer bloed van gezonde anonieme bloeddonoren werd verkregen uit de bloedbank van het Karolinska Universitair Ziekenhuis, Huddinge, Zweden (ethische goedkeuring Dnr 2010/603-31/4). Alle experimentele stappen met levende virulente Mtb werden uitgevoerd in het Biosafety Level-3 (BSL-3) laboratorium van het Public Health Agency of Sweden (FOHM), Solna, Zweden.

1. Bereiding van media, buffers en bacterieculturen

OPMERKING: Details over alle reagentia en verbruiksartikelen vindt u in de tabel met materialen.

  1. RPMI compleet medium: Vul RPMI 1640 aan met 1 mM natrium pyruvaat, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES en 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS). Vermijd antibiotica in het celkweekmedium bij het werken met Mtb-infectie.
  2. Serumvrij RPMI medium: Supplement RPMI 1640 met 1 mM natrium pyruvaat, 2 mM L-glutamine en 10 mM HEPES.
  3. Wasbuffer: Bereid fosfaatbufferoplossing (PBS) voor die 0,05% (v/v) Tween-80 bevat.
  4. FACS buffer: Bereid PBS voor met 2,5% (v/v) FBS en 0,5 mM EDTA.
  5. Fixatiebuffer: Bereid PBS met 4% formaldehyde voor op PBS. Zorg ervoor dat het vers wordt bereid voor gebruik, bijvoorbeeld gemengd uit een stamoplossing van 37% formaldehyde.
  6. Permeabilisatiebuffer: Voeg 0,1% natriumcitraat en 0,1% Triton X-100 toe aan gedeioneerd water.
  7. Wasbuffer (voor immunofluorescentie): Bereid PBS voor dat 0,1% BSA en 0,1% Tween-20 bevat.
  8. Blokkeerbuffer: Bereid PBS met 0,1% BSA en 10% normaal geitenserum (NGS) voor op PBS.
  9. Kleurbuffer (voor immunofluorescentie): Bereid PBS voor dat 0,1% BSA tot PBS bevat.
  10. TB compleet medium: Supplement Middle Brook 7H9 bouillon met 0,05% (v/v) Tween-80, 0,5% (v/v) glycerol, kanamycine (20 μg/ml), 10% (v/v) Middlebrook oliezuur, albumine, dextrose en catalase verrijking (Middlebrook OADC Verrijking).
  11. Bacteriële culturen: Gebruik de standaard virulente Mtb-laboratoriumstam, H37Rv, die plantaardig fluorescerend eiwit (GFP) uitdrukt, voor infectie van monocyt-afgeleide cellen. Deze Mtb-stam draagt een pFPV2 plasmide die een gen bevat dat codeert voor GFP, evenals een gen voor kanamycineresistentie. De antibioticaresistentie maakt een continue selectie van plasmide-uitdrukkende bacteriën mogelijk in culturen die kanamycine bevatten. Bewaar bacteriën in tbc compleet medium en 70% glycerol (1:1 verdunning) bij -80 °C.

2. Perifere bloedmononucleaire celisolatie van buffycoats

OPMERKING: Voer alle werkzaamheden uit met menselijk bloed (mogelijk besmettelijk) in een bioveiligheidskast van klasse II. Inactiveer resterende bloedproducten met ontsmettingsmiddelen gedurende 15 minuten voordat u ze weggooit. In dit geval werd bloed verkregen van gezonde vrijwilligers. Dit in vitro macrofaagdifferentiatieprotocol werd opgezet om 10 x 106 geïsoleerde PBMC's/donor/put op te nemen. Van elke donor bevat één buffy coat ongeveer 50 ml geconcentreerde leukocytensuspensie afkomstig van volbloed, die normaal gesproken 500-800 x 106 PBMCs levert waaruit ongeveer 10% of 50-80 x 106 monocyten kunnen worden opgehaald.

  1. Laad 15 ml buffy coat bloed bovenop 15 ml dichtheid gradiënt medium bereid in 50 ml buis. Leg langzaam bloed bovenop de dichtheidsgradiëntlaag door de pipetpunt naar de wand van de buis te leunen.
  2. Draai de buizen gedurende 25 minuten op 600 x g bij kamertemperatuur (RT) met 0 versnelling en 0 vertraging.
    OPMERKING: Sluit de deksels zorgvuldig voor het centrifugeren en controleer de buishouders altijd op mogelijke overloop na centrifugeren.
  3. Verwijder de bovenste plasmalaag met een steriele Pasteur pipet en verzamel daarna voorzichtig de mononucleaire cellaag in een nieuwe buis van 50 ml met behulp van een steriele Pasteur pipet. Voeg serumvrij RPMI-medium toe aan de PBMC-pellet om een eindvolume van 50 ml te verkrijgen. Meng voorzichtig door de buis een paar keer om te keren voor centrifugeren op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  4. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspend de celkorrel door de onderkant van de buis in de vingers om te draaien.
  5. Om de medium contaminatie van de dichtheidsgradiënt uit de PBMC's te verwijderen, wast u cellen 2-3 keer met serumvrije RPMI om een eindvolume van 50 ml te verkrijgen. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 min bij RT. Was tot het celsupernatant transparant wordt.
  6. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 20 ml serumvrij RPMI-medium.
  7. Tel de cellen door blauwe vlekken te proberen, handmatig met behulp van een hemocytometer of met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verdun de celsuspensie in trypanblauw in 1:2 of 1:10 verdunning door het cel-trypanblauwe monster te mengen in een 96 putplaat, bijvoorbeeld 50 μL + 50 μL (voor hemocytometertelling) of 10 μL + 10 μL (voor automatisch celtelling) en tel de cellen om het aantal levende cellen/ml te verkrijgen.
    LET OP: Trypan blauw is giftig en moet worden weggegooid in een apart chemisch afval.

3. Differentiatie en polarisatie van monocyt-afgeleide cellen

OPMERKING: Voor differentiatie en polarisatie van monocyt-afgeleide cellen werd een protocol gevolgd dat we eerder hebben opgesteld voor M0-, M1-achtige en M2-achtige cellen, evenals volledig M1- en M2-gepolariseerde cellen25. Voor de eenvoud worden hier alleen volledig gepolariseerde M1- en M2-macrofagen beschreven.

  1. Gebruik plastic hechting voor isolatie van monocyten. Kortom, zaai vers geïsoleerde PBMC's in een 6-well kweekplaat in een geschikte concentratie, bijv. 10 x 106 PBMCs/well in 2 ml serumvrij RPMI-medium en incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Verwijder na 2-3 uur de niet-hechtende cellen met een pipet en was de putten 3 keer met 1 ml serumvrij medium. De bijgevoegde cellen zijn monocyten en omvatten ongeveer 10% van het totale PBMC dat aan de put is toegevoegd, d.w.z. 106 monocyten die zijn opgehaald uit 10 x 106 PBMCs die per put zijn toegevoegd.
  3. Bereid voor macrofaagdifferentiatie een werkoplossing voor met 50 ng/ml GM-CSF of M-CSF voor respectievelijk M1- en M2-macrofaagpolarisatie, toegevoegd in 2 ml RPMI compleet medium per put. Kweek de cellen gedurende 3 dagen in een CO2-incubator van 5% in 37 °C.
  4. Verwijder op dag 3 voorzichtig 1 ml van het celkweekmedium uit de bovenste laag van elke put en vul de celculturen aan met 1 ml vers RPMI compleet medium met de dubbele concentratie M-CSF of GM-CSF om 50 ng/ml eindconcentratie in de putten te verkrijgen. Voeg de groeifactoren toe in een vooraf gemaakte werkoplossing van 100 ng/ml/put.
  5. Voeg op dag 6 verschillende stimuli toe voor de laatste 18-20 uur celdifferentiatie om volledig gepolariseerde en volwassen M1 (interferon-γ te verkrijgen; IFN-γ en lipopolysaccharide; LPS (E. coli O55:B5)) of M2 (interleukine 4; IL-4) macrofagen. Bereid voor M1-polarisatie IFN-γ en LPS in RPMI compleet medium voor en voeg 50 μL per put toe om een eindconcentratie van 50 ng/ml IFN-γ en 10 ng/ml LPS in de celculturen te verkrijgen. Bereid voor M2-polarisatie IL-4 in RPMI compleet medium voor en voeg 50 μL per put toe om een eindconcentratie van 20 ng/ml in de celculturen te verkrijgen.
  6. Voor differentiatie van M0 gepolariseerde macrofagen, stimuleer de cellen alleen met M-CSF, zonder extra cytokinen (die een M2-achtig fenotype leveren)25.
  7. Controleer de morfologie van monocyt-afgeleide celculturen regelmatig met lichte microscopie om ervoor te zorgen dat kleinere monocyten worden gedifferentieerd in grotere macrofaagachtige cellen. Bewaak ook potentiële morfologische verschillen tussen de M1- en M2-polarisatie, d.w.z. langwerpige en uitgerekt M1-cellen in vergelijking met M2-cellen met een meer afgeronde vorm25.
  8. Breng op dag 7 de platen met monocyt-afgeleide cellen over naar een BSL-3 laboratorium voor infectie met virulente Mtb.

4. Voorbereiding Mtb-culturen

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL-3-faciliteit. Gebruik voor alle werkzaamheden met virulente Mtb beschermende kleding, ademhalingsbescherming en ethanolbestendige handschoenen.

  1. Ontdooi een flacon met 1 ml bacteriële aliquot en meng met 9 ml tbc compleet medium (1:10 verdunning) in een 50 ml gefilterde dopbuis. Kweek de suspensie in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Draai na 24 uur de bacteriële suspensie gedurende 10 minuten op 2.300 x g en giet het medium voorzichtig af. Resuspendeer de bacteriële pellet met 15-20 ml verse tbc complete medium in een nieuwe 50 ml gefilterde dop kweekbuis en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Meng de neergestreken bacteriën om de 2-3 dagen in de buis om een homogene voedingsvoorraad voor alle bacteriële cellen te behouden.
  3. Meng na 7-10 dagen de bacteriële suspensie goed door op en neer te pipetten voordat u overgaat op een schroefdopbuis van 50 ml.
  4. Voeg 35-40 ml steriele wasbuffer toe aan de buis van 50 ml en draai de bacteriële suspensie gedurende 10 minuten op 2.300 x g. Herhaal de wasstappen één keer. Resuspendeer de bacteriële pellet in 1 ml serumvrij RPMI-medium door pipetten met een micropipet.
  5. Voeg nog eens 9 ml serumvrij RPMI-medium toe en soniceer de bacteriële suspensie in een bioveiligheidskast van klasse II gedurende 5 minuten bij 37 °C, om de bacteriële klonters te verstoren. Dompel de buis herhaaldelijk (3-4 keer) in de waterbad sonicator om maximale verstoring van bacteriële klonters te garanderen. Meet de optische dichtheid (OD) van 1 ml bacteriële suspensie bij een golflengte van 600 nm met behulp van een spectrofotometer die in de bioveiligheidskast is geplaatst. Gebruik serumvrij RPMI-medium om de referentie in te stellen.
  6. Bereken het aantal kolonievormende eenheden (CFU) met behulp van de formule: (OD+0,155)/0,161 = Y, en Y x 107= Y x 106 KVE/ml, bijvoorbeeld een OD-waarde 0,32 geeft een bacterieconcentratie van (0,32+0,155)/0,161 = 2,9

5. Mtb-infectie van monocyt-afgeleide cellen

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL-3-faciliteit.

  1. Resuspendeer de bacteriële pellet in serumvrij RPMI-medium in een nieuwe steriele buis van 50 ml en pas de uiteindelijke bacteriële concentratie aan op ongeveer 5 x 106 KVE/ml.
  2. Verwijder het celkweekmedium uit de 6 putplaat(en) die monocyt-afgeleide cellen bevatten. Voeg 1 ml serumvrij RPMI-medium toe aan elke put. Voeg 1 ml bacteriële suspensie per put toe om een multipliciteit van infectie (MOI) 5:1 te verkrijgen, d.w.z. 5 x 106 KVE per 106 macrofagen in 2 ml/put en incubeer de platen gedurende 4 uur in 37 °C en 5% CO2.
  3. Was de cellen na infectie 3 keer met 1 ml steriele wasbuffer om extracellulaire bacteriën te verwijderen. Kantel de plaat en verwijder voorzichtig de gehele wasbuffer uit de hoeken. Resuspendeer de Mtb-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen in 2 ml RPMI volledig medium zonder antibiotica en ga verder met cytometriekleuring of incubeer de cellen nog eens 24 uur (of andere tijdpunten) vóór flowcytometrie.

6. Flow cytometrie kleuring van Mtb-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL-3-faciliteit. De stromingscytometriekleuring kan worden uitgevoerd in een 96-putplaat in plaats van buizen.

  1. Maak de met Mtb geïnfecteerde cellen (en niet-geïnfecteerde besturingselementen) los van de putten in de 6 putplaat(en) door incubatie met 1 ml FACS-buffer per put gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Pipetteer voorzichtig een paar keer op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen loskomen. Bevestig indien mogelijk de celloslating met microscopie. Breng de celsuspensie van elke put over naar een microcentrifugebuis met schroefdop en draai de buizen gedurende 5 minuten op 200 x g. Gooi het supernatant voorzichtig weg door te pipetten.
  3. Was de celkorrel twee keer in elke buis met FACS-buffer en draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g.
  4. Bevlek de cellen (ongeveer 0,5 x 106 tot 1 x10 6 cellen/buis) met ongeveer 50 μL cocktail van fluorchrome geconjugeerde anti-menselijke antilichamen waaronder TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabel 1) in combinatie met levensvatbaarheidskleurstof Zombie-UV gedurende 30 min bij 4 °C (koelkast) in het donker.
  5. Was de bevlekte cellen tweemaal met 400 μL FACS-buffer en draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g.
  6. Bevestig de bevlekte cellen met 200 μL fixatiebuffer (vers bereid) gedurende 30 minuten bij RT in het donker om volledige inactivatie van mycobacteriën te garanderen.
  7. Was de cellen tweemaal met 400 μL FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 200 x g om overtollige fixbuffer te verwijderen.
  8. Resuspendeer de vaste cellen in 400 μL FACS-buffer en breng de monsters over in nieuwe 1 ml microcentrifugebuizen voordat ze uit het BSL-3-laboratorium voor flowcytometrie in BSL-2 worden gehaald. Bewaar de bevlekte cellen in +4 °C tot monsterverwerving.
    OPMERKING: Besproei de buizen met 70% ethanol voordat u ze uit het BSL-3 laboratorium haalt. Formaldehyde is giftig (kankerverwekkend) en moet worden behandeld in een bioveiligheidskast van klasse II. Gooi formaldehydeafval weg in een apart chemisch afval.

7. Flow cytometrische gegevens verwerving en analyse van Mtb-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen

OPMERKING: Stap 7.1–7.2 moet worden uitgevoerd voorafgaand aan de hierboven beschreven stroomcytometriekleuring. Om problemen met celklonteren en dissociatie van tandemkleurstoffen na celfixatie te voorkomen, wordt monsterverwerving van zowel Mtb-geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde cellen uitgevoerd binnen 4-10 uur na primaire antilichaamkleuring.

  1. Compenseer vóór de hierboven beschreven stromingscytometriekleuring het fluorescerende signaal voor elk fluorchrome geconjugeerd antilichaam dat in het kleurpaneel (tabel 1) wordt vermeld met behulp van compensatieparels (zowel positief als negatief).
  2. Titreer de antilichaamverdunning voor het kleuren van menselijke macrofagen om het optimale signaal voor elke fluorchrome te verkrijgen.
  3. Gebruik niet-aangetaste cellen om het niveau van achtergrondfluorescentie te bepalen dat nodig is om poort in te stellen voor de negatieve celpopulatie, zodat de bevlekte cellen kunnen worden gevisualiseerd (macrofagen zijn zeer automatisch fluorescerend).
  4. Verkrijg minimaal 50.000 cellen/monster in de flowcytometer met behulp van de aanbevolen software voor gegevensverzameling.
  5. Exporteer de acquisitiebestanden van de flowcytometer in flow cytometrie standaard (FCS) formaat 3.1.
  6. Analyseer de FCS-bestanden in flow cytometrie analyse software.
  7. Gate macrofagen volgens hun forward- en side scatter (FSC en SSC) kenmerken en sluit dode cellen uit door levend/dood cel gating met behulp van de Zombie-UV levensvatbaarheidskleurstof.
  8. Visualiseer H37Rv-GFP geïnfecteerde macrofagen in het FITC-kanaal.
  9. Identificeer de frequentie van positief bevlekte cellen en geometrische gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor alle markers (Tabel 1).

8. Immunofluorescentiekleuring van Mtb-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen

OPMERKING: Mtb-infectie moet worden uitgevoerd in een BSL-3-faciliteit.

  1. Voor immunostaining, zaad 2 x 105 PBMC's/put in 500 μL serumvrij RPMI-medium in 8 putkamerglijbanen om 2 x 104 monocyten/put te verkrijgen. Ga na differentiatie en M1/M2-polarisatie van monocyten verder met Mtb-infectie zoals hierboven beschreven. Bevestig de dia's na 24 uur Mtb-infectie met fixatiebuffer gedurende 30 minuten. Vaste dia's worden bij -20 °C in de vriezer bewaard tot verdere analyses.
  2. Was de monocyt-afgeleide cellen tweemaal met 200 μL PBS gedurende elk 10 minuten.
  3. Permeabiliseer de cellen met 200 μL permeabilisatiebuffer gedurende 5 minuten bij RT.
  4. Was de cellen 3 keer met 200 μL PBS gedurende elk 5 minuten.
  5. Was de cellen tweemaal met 200 μL wasbuffer gedurende elk 5 minuten.
  6. Blokkeer niet-specifieke binding met 200 μL blokkeerbuffer gedurende 30 minuten bij RT.
  7. Verdun de primaire antilichamen 1:100 in de kleuringsbuffer en incubeer de M1-cellen met een niet-geconjugeerd CD64-antilichaam (kloon: 10.1) en de M2-cellen met een niet-geconjugeerd CD163-antilichaam (polyklonaal) gedurende 2 uur bij RT.
  8. Was vervolgens de cellen 3 keer met 200 μL wasbuffer gedurende elk 10 minuten.
  9. Verdun de fluorescerende gelabelde secundaire antilichamen 1:1.000 in kleurbuffer en incubeer de M1-cellen met een antimuis IgG-Alexa Fluor 594 en de M2-cellen met een anti-konijn IgG-Alexa Fluor 594 gedurende 1 uur bij RT.
  10. Was de cellen 3 keer met een wasbuffer van 200 μL gedurende elk 10 minuten.
  11. Verwijder het kamerraster en voeg ~20 μL DAPI-montagemedium toe aan elke put en plaats een afdeklip van 1,5 mm op elke dia.
  12. Sluit de hoeslip af met een laag nagellak.
  13. Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop met lasers die uitzenden bij 486 nm voor excitatie van respectievelijk GFP (groen kanaal), 402 nm voor DAPI (blauw) en 560 nm voor secundair antilichaam (rood).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische illustratie van de cytokinestimulaties die worden gebruikt voor polarisatie van monocyt-afgeleide cellen naar M0 (M2-achtige cellen), M1 (volledig gepolariseerde M1-cellen) en M2 (volledig gepolariseerde M2-cellen) wordt weergegeven in figuur 1A, terwijl representatieve afbeeldingen van M0-, M1- en M2-celculturen en M1-culturen op dag 0, 3 en 7 worden weergegeven in figuur 1B. Niet-geïnfecteerde M0-cellen werden gebruikt om de basis gatingstrategie aan te tonen (figuur 2A). Aanvankelijk waren de myeloïde cellen (~85%) werden gated op basis van hun forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) eigenschappen, waaronder de grotere cellen met een hoge granulariteit en exclusief het kleine puin met een lage SSC en FSC die te vinden zijn in de linkerbenedenhoek van het dot plot. In het tweede perceel werden doubletten (d.w.z. celklonters) gedefinieerd als een groter gebied, maar een vergelijkbare hoogte in vergelijking met afzonderlijke cellen en werden uitgesloten van verdere analyse. Daarom werden alleen cellen die evenredig zijn tussen FSC-Area en FSC-Height (enkele cellen) opgenomen in de schuine vormpoort. Vervolgens werd de Zombie-UV levensvatbaarheidskleurstof die de cytoplasmatische eiwitten in de dode cellen bevlekt, gebruikt om de dode cellen uit te sluiten van latere analyse. Zoals verwacht waren levensvatbare niet-geïnfecteerde M0-cellen negatief voor Mtb-GFP-expressie gevisualiseerd in het FITC-kanaal.

Vervolgens pasten we dezelfde gating-strategie toe op niet-geïnfecteerde en met Mtb geïnfecteerde M1- en M2-macrofagen na 4 uur na infectie (figuur 2B,C). Twee subpopulaties werden gedetecteerd in de FCS/SSC-poort van niet-geïnfecteerde M1 gepolariseerde macrofagen; één populatie met een kleinere omvang (FCS) en hogere granulariteit (SSC) en de andere populatie met een grotere omvang en lagere granulariteit (figuur 2B), terwijl de hoofdpoort van niet-geïnfecteerde M2-cellen homogener leek (figuur 2C). Zowel M1- als M2-monocyt-afgeleide cellen vertoonden een verticale verschuiving naar een hogere granulariteit en verminderde celgrootte bij Mtb-infectie, wat een verhoogde complexiteit in de cellen kan weerspiegelen die wordt veroorzaakt door de opname van intracellulaire Mtb-bacteriën (figuur 2B,C). Bovendien onthulde de levensvatbaarheidsvlek een verbeterde celdood (17-22%) onder de Mtb-geïnfecteerde M1- en M2-cellen bij een MOI van 5, vergeleken met niet-geïnfecteerde M0-cellen (99%) (Figuur 2A-C ) ofniet-geïnfecteerdeM1- en M2-cellen (gegevens niet weergegeven). Representatieve gegevens toonden aan dat Mtb-GFP expressie (d.w.z. Mtb infectiviteit) aanzienlijk hoger was in M2 (77% GFP-positieve cellen) in vergelijking met M1 (19% GFP-positieve cellen) cellen na 4 uur infectie (Figuur 2B,C). Na 24 uur infectie was de Mtb-GFP-expressie respectievelijk 43% en 85% in M1- en M2-cellen, wat suggereert dat M1-cellen een relatief hogere toename van GFP-expressie hadden van 4-24 uur na Mtb-infectie in vergelijking met M2-cellen, 126% versus 10,4% toename van GFP-expressie in M1- en M2-cellen van respectievelijk 4-24 uur.

Om de werkzaamheid van M1/M2-polarisatie in niet-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen te karakteriseren, werden puntpercelen gebruikt om M1-cellen te identificeren die dubbelpositief waren voor CD64- en CD86-cellen (CD64+CD86+) en M2-cellen die dubbelpositief waren voor CD163 en CD200R (CD163+CD200R+; Figuur 3A,B). De selectie van M1/M2 markers is voornamelijk gemaakt op basis van de resultaten van ons vorige werk25 maar ook uit andere studies26,27,28,29. De kwadranten voor de bevlekte cellen werden ingesteld met behulp van overeenkomstige poorten voor niet-aangetaste M1/M2-cellen (figuur 3A). Geen van deze markers wordt uitsluitend uitgedrukt door M1- of M2-cellen, maar het aandeel positieve cellen en de intensiteit van de oppervlakteexpressie is anders. Dit bleek met name uit de M1-vlek, waar ongeveer 95% van de M1-cellen en 79% van de M2-cellen CD64+CD86+waren , maar de kleuringsintensiteit was aanzienlijk hoger in de M1-subset (figuur 3A). Terwijl 27% van de M1-cellen positief was voor de M2-marker CD200R, was slechts 1% positief voor CD163, wat 0,5% CD163+CD200R+ M1-cellen oplevert in vergelijking met 63% CD163+CD200R+ M2-cellen (figuur 3A). Na 4 uur Mtb-infectie werd een toename van de frequentie van CD200R+ cellen waargenomen in Mtb-GFP-positieve M1 gepolariseerde cellen (16%), terwijl CD163-expressie werd verminderd in M2-cellen (Figuur 3B). De heat-map toont een hoge intensiteit van GFP-expressie in CD163+CD200R+ M2 cellen, maar ook in de CD64+CD86+ M2 subset in vergelijking met de corresponderende M1 cellen subsets (Figuur 3B). Over het algemeen wordt de verschuiving in expressie van de respectieve M1- en M2-markeringen ook gevisualiseerd in de histogrammen in figuur 3C. Bovendien werden Mtb-GFP-bacteriën ook gevisualiseerd in CD64+ M1-cellen en in CD163+ M2-cellen door confocale microscopie, die een verbeterde intracellulaire opname en / of groei van Mtb in M2 ondersteunde in vergelijking met M1-cellen (figuur 3D).

Om de resultaten van de handmatige gating te verifiëren, hebben we dimensionaliteitsreductie toegepast met behulp van Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). UMAP-analyse toonde aan dat Mtb-infectie gedurende 4 uur niet voldoende was om de polarisatie van macrofagen te beïnvloeden, in tegenstelling tot 24 uur infectie, wat resulteerde in duidelijk gescheiden clusters van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen M1 en M2 (figuur 4A). Niet-geïnfecteerde M1-macrofagen vertoonden een hogere expressie van CD64, CD86, TLR2, HLA-DR en CCR7 in vergelijking met M2-macrofagen, terwijl niet-geïnfecteerde M2-cellen een sterke up-regulatie vertoonden van de M2-fenotypemarkers CD163, CD200R, CD206 en CD80 (figuur 4B,C). In overeenstemming met de handmatige gating veroorzaakte Mtb-infectie na 24 uur een duidelijke downregulatie van CD163, CD200R en CD206 op M2-cellen en upregulatie van CD86 en HLA-DR op M1-cellen (figuur 4B,C), wat suggereert dat Mtb macrofaagpolarisatie kan moduleren. Latere fenograafanalyse (Figuur 4D-F) identificeerde 24 verschillende clusters van verschillende grootte die uniek verdeeld waren over de niet-geïnfecteerde M1- en M2- en Mtb-geïnfecteerde cellen , zoals geïllustreerd in de UMAP-grafieken (Figuur 4D), cirkeldiagrammen (Figuur 4E) en heat-maps (Figuur 4F). Al met al tonen deze resultaten veelbelovende efficiëntie van dit protocol om fenotypisch en functioneel diverse M1- en M2-gepolariseerde cellen in vitro te genereren die verder worden gemoduleerd door Mtb-infectie.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische illustratie van in vitro differentiatie en polarisatie van menselijke myeloïde-afgeleide cellen. (A) M0 (M2-achtig), M1 (klassiek geactiveerd) en M2 (alternatief geactiveerd) cellen worden afgebeeld. Monocyten verkregen van gezonde bloeddonoren werden gepolariseerd met verschillende cytokinen zoals beschreven in het protocol en geïnfecteerd met de GFP-gelabelde Mtb-stam, H37Rv, gedurende 4 uur vóór analyse met 10-kleurenstroomcytometrie. M1-gepolariseerde cellen bevatten doorgaans minder bacteriën in vergelijking met M2-gepolariseerde cellen. (B) Microscopische beelden van volledig gepolariseerde, niet-geïnfecteerde M0-, M1- en M2-cellen in de 6-putplaten op dag 7, en representatieve beelden van M1-celdifferentiatie van monocyten op dag 0, 3 en 7. Vergroting is 20x (bovenpaneel) en 10x (onderste paneel). Merk op dat de M1-cellen langwerpiger en uitgerekt zijn in vergelijking met de meer afgeronde M0- en M2-cellen (bovenste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Gating strategie van differentieel gepolariseerde myeloïde-afgeleide cellen. Representatieve puntplots met (A) Voorwaartse spreiding (FSC) en zijstrooiingseigenschappen (SSC) van niet-geïnfecteerde M0-macrofagen. Het FSC-A/FSC-H-perceel toont handmatige gating van enkele cellen die evenredig zijn voor oppervlakte en hoogte. De levende celpoort sloot cellen uit die positief waren voor Zombie-UV (levensvatbaarheidskleurstof). Intracellulaire Mtb werd gedetecteerd door GFP-expressie in levende cellen waargenomen in het FITC-kanaal. (B) Gating van M1- en (C) M2-macrofagen met FCS/SSC-puntpercelen van zowel in niet-geïnfecteerde cellen als met Mtb geïnfecteerde cellen 4 uur en 24 uur na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Werkzaamheid van het in vitro M1/M2 polarisatieprotocol. Representatieve puntplots en kwadrant gating met subsetfrequenties van M1- en M2-gepolariseerde cellen met behulp van CD64 en CD86 (M1) of CD163 en CD200R (M2) in (A) niet-aangetaste en bevlekte niet-geïnfecteerde cellen en (B) met Mtb geïnfecteerde bevlekte cellen 4 uur na infectie. De puntpercelen in (B) illustreren de fluorescentie-intensiteit van GFP-expressie (heat map) in M1- en M2-gepolariseerde macrofagen verkregen uit verschillende subpoorten. (C) Geometrisch gemiddelde van fluorescentie-intensiteit (MFI) wordt weergegeven in histogrammen van één representatieve donor na 4 uur Mtb-infectie. De MFI-waarden in niet-geïnfecteerde M1-cellen (lichtblauw) en M2-cellen (lichtpaars) worden weergegeven in het bovenste paneel en Mtb-geïnfecteerde M1-cellen (diepblauw) en M2-cellen (dieppaars) worden weergegeven in het onderste paneel. (D) Representatieve confocale afbeeldingen van niet-geïnfecteerde en Mtb-geïnfecteerde M1- en M2-gepolariseerde cellen worden getoond. M1- en M2-cellen werden gekleurd voor respectievelijk CD64- en CD163-expressie met behulp van immunofluorescentie. Positieve oppervlaktekleuring wordt getoond in rood en GFP-uitdrukkende intracellulaire bacteriën worden in groen weergegeven. DAPI-bevlekte kernen worden weergegeven in blauwe kleur. Schaal – 10 μm. De vergroting van afbeeldingen aan de rechterkant is 350x. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Dimensionaliteitsreductie met Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) en fenograafanalyse van niet-geïnfecteerde en Mtb-geïnfecteerde M1- en M2-cellen. (A) UMAP, gemaakt door 11000 levende cellen uit niet-geïnfecteerde en Mtb-geïnfecteerde M1- en M2-celculturen van twee representatieve bloeddonoren, 4 uur (linkergrafieken) of 24 uur (rechtergrafieken) na infectie. De heatmap voor GFP-expressie (onderste paneel) geeft niet-geïnfecteerde en met Mtb geïnfecteerde cellen aan. (B-C) MFI van markers uitgedrukt in niet-geïnfecteerde en met Mtb geïnfecteerde M1- en M2-cellen 24 uur na infectie, weergegeven als (B) heatmap of (C) staafpercelen. (D-F) Fenograafanalyse identificeerde 24 clusters die differentieel verdeeld zijn over de niet-geïnfecteerde en Mtb-geïnfecteerde M1- en M2-culturen. Clusters 8-13 zijn uniek in niet-geïnfecteerde M1-cellen, clusters 1-7 zijn uniek in Mtb-geïnfecteerde M1-cellen, clusters 20-24 zijn uniek in niet-geïnfecteerde M2-cellen en clusters 14-19 zijn uniek in Mtb-geïnfecteerde M2-cellen. De MFI van elke marker in elke fenograafcluster wordt weergegeven in (F). De gegevens worden gepresenteerd als niet-geïnfecteerde M1-cellen (lichtblauw) en M2-cellen (lichtpaars) en Mtb-geïnfecteerde M1-cellen (diepblauw) en M2-cellen (dieppaars). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1: Lijst van antilichamen die worden gebruikt voor flowcytometrie.

LaserFilterFluorchromeFenotypeFunctieKloonCatalogusnr.Bedrijf
639670/30AF647TLR2Pathogene herkenningsreceptorTL2.1309714BioLegend
639780/60APC-Cy7CD206Mannose receptor15-2321120BioLegend
405610/20BV605CD163De receptor van de aaseterGHI/62333616BioLegend
405670/30BV650CD80Co-stimulerend molecuul2D10305227BioLegend
405710/50BV711CCR7Chemokine receptorG043H7353228BioLegend
405780/60BV785CD86Co-stimulerend molecuulIT2.2305442BioLegend
488530/30GFPMtbIntracellulaire bacteriën
561586/15PeCD200RRemmende receptorOS-108329306BioLegend
561620/14PE/DAZZLE 594CD64Fc gamma receptor-I van IgG10.1305032BioLegend
561661/20PE-Cy5 (PC5)HLA-DRMHC klasse II molecuulL243307608BioLegend
355450/50BUV395Levensvatbaarheid KleurstofDode/levende celmarkeringZombie UV423108Invitrogen

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit experimentele protocol beschrijft effectieve polarisatie van myeloïde-afgeleide cellen in M1- of M2-fenotypen, inclusief beoordeling met een cytometriepaneel met 10 kleurenstroom dat visualisatie en diepe karakterisering van Mtb met GFP-label in verschillende macrofagensubgroepen mogelijk maakt. Hoewel TBC een oude menselijke ziekte is, is er momenteel geen gouden standaardmodel om Mtb-macrofaaginteracties te bestuderen, en multi-color flow cytometrie van macrofagen kan gecompliceerd zijn in vergelijking met analyses van lymfocytreacties. Weinig beschikbare protocollen voor in vitro differentiatie van menselijke monocyten naar macrofagen bieden diepgaande kennis van het type macrofagen dat wordt gegenereerd. Een basisprotocol voor macrofaagpolarisatie en flowcytometrische beoordeling van macrofaagactivering met behulp van een solide paneel van markers kan een dergelijke karakterisering waarschijnlijk vergemakkelijken en mogelijkheden bieden om aanvullende kenmerken van gepolariseerde cellen te verkennen die onder verschillende omstandigheden worden behandeld. Dit omvat analyses van cellen die in vitro zijn gekweekt, evenals analyses van cellen in vivo in klinische monsters, d.w.z. zowel PBMC- als eencellige suspensies uit lichaamsvloeistoffen (d.w.z. bronchoalveolaire lavage) of gehomogeniseerd weefsel. Dienovereenkomstig kan differentiatie en/of activeringsstatus van monocyten en macrofagen verkregen van patiënten verband houden met de uitkomst van de ziekte. Uitbreiding van CD16+CD163+ monocyten in perifeer bloed is gemeld bij pulmonale tbc-patiënten30. Een verhoogde frequentie van CD163+ cellen werd ook gedetecteerd in de ontstoken huid van atopische dermatitispatiënten31. Evenzo is aangetoond dat CD206+ M2-achtige macrofagen de proliferatie en differentiatie van cellen in het micromilieu van adipocytweefsel32 remmen en worden verrijkt in beenmergmonsters van patiënten met acute myeloïde leukemie (AML)29. Een verhoogde verhouding tussen CD64 (M1) en CD163 (M2) cellen in volbloed van patiënten met artrose bleek geassocieerd te zijn met de ernst van de ziekte33. Een andere studie gebruikte CD86 (M1) en CD163 (M2) om aan te tonen dat hoge M1-expressie in weefsel correleerde met een slechter resultaat in een subgroep van kwaadaardige hersentumoren34.

Er zijn verschillende belangrijke voordelen van dit experimentele M1/M2 flow cytometrie protocol. Dit model biedt de mogelijkheid om aangeboren immuunresponsen op virulente Mtb-infectie te bestuderen en kan worden ontwikkeld om studies van adaptieve immuunresponsen te bevatten door autologe T-cellen samen met M1- of M2-macrofagen toe te voegen in gemengde lymfocytreacties (MLR's). Het protocol is ook geschikt voor het screenen en testen van verschillende immunomodulerende en antimicrobiële verbindingen. Hier hebben we eerder de effecten van vitamine D en de histondeacetylaseremmer fenylbutyraat op myeloïde-afgeleide cellen bestudeerd na Mtb-infectie25,35. M1/M2-flowcytometrie kan ook worden gebruikt om macrofaagactivatie te beoordelen na conditionering met celkweeksupernatanten of patiëntplasma. Hoewel in vivo studies naar tbc-co-infectie met HIV of helminten of tbc-diabetes co-morbiditeit een uitdaging kunnen zijn, kan het minder complexe M1/M2-model studies naar co-morbiditeiten in vitro vergemakkelijken. Evenzo zou het protocol kunnen worden gebruikt voor transmissiestudies om de Mtb-infectiviteit van cellen te onderzoeken of om fagocytische en antigeenpresentatiecapaciteit van individuele M1/M2-cellen te onderzoeken. M1/M2 flow cytometrie is ook aantrekkelijk voor gebruik in biomarker- en vaccinstudies, om de ziekteprognose tijdens de behandeling te volgen en om therapieën te testen die gericht zijn op myeloïde-afgeleide cellen. Belangrijk is dat een aantal verschillende methoden parallel aan flowcytometrie kunnen worden toegepast voor gelijktijdige beoordeling van macrofaagpolarisatiefenotypes en functionele reacties met behulp van confocale microscopie(figuur 3D),real-time PCR, western blot, multiplex-assays en ELISA van oplosbare factoren in het cultuursupernatant, evenals beoordeling van intracellulaire bacteriële infectiviteit en groei met behulp van GFP-expressie (flowcytometrie en confocale microscopie) en kolonievormende eenheden (CFU). Infectie van M1- of M2-cellen met Mtb-GFP-bacteriën maakt het ook mogelijk om de niet-geïnfecteerde en Mtb-geïnfecteerde cellen uit hetzelfde monster te sorteren voor analyse van single cell-RNA-sequencing.

Het beschreven protocol heeft ook enkele beperkingen, waaronder zowel technische als wetenschappelijke nadelen. Het nadeel van monocyt-afgeleide macrofagen van menselijke bloeddonoren is dat de donorvariabiliteit vaak hoog is en het feit dat de cellen niet gepolariseerd zijn in de fysiologische omgeving van menselijke weefsels. Grote variabiliteit in M1/M2 polarisatie-werkzaamheid of Mtb-infectiviteit tussen donoren kan leiden tot problemen met zowel intra- als interexperimentale variaties, lage statistische kracht en de noodzaak om veel donoren op te nemen om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Bovendien resulteren plastic hechting van monocyten uit PBMC's in een donorafhankelijk aantal monocyten/put dat uiteindelijk een willekeurige MOI kan opleveren die de macrofaagpolarisatie en cel levensvatbaarheid na Mtb-infectie kan beïnvloeden. Kritieke stappen in het protocol omvatten goed wassen om te voorkomen dat andere celtypen de celculturen besmetten die ook macrofaagpolarisatie kunnen beïnvloeden. Hoewel een te lage MOI latente tbc-infectie kan nabootsen, zal een te hoge MOI de cellen doden, wat het belang benadrukt van het gebruik van een geschikte MOI. Bovendien kan het moeilijk zijn om stevig hechtende cellen op te halen bij onthechting, wat kan resulteren in een bevooroordeelde weergave van bepaalde macrofagen subsets die worden gebruikt voor flow cytometrie analyses. Een cruciale stap in flow cytometrie analyse omvat het juiste gebruik van kralen compensatie matrix en negatieve controles zoals niet-aangetaste cellen of FMO (Fluorescentie Minus One) controles om de juiste handmatige gating te garanderen.

Een andere beperking betreft polarisatie van monocyten afgeleid van bloed en niet van de lokale weefselomgeving. Het kenmerk van menselijke tbc is de vorming van granulomen in met Mtb geïnfecteerde weefsels en daarom moet immunopathologie bij tbc bij voorkeur worden bestudeerd op de lokale weefsellocatie. Monocyten worden echter gerekruteerd naar de long uit perifeer bloed bij ontsteking / infectie, waar cellen zich kunnen onderscheiden in macrofagen in aanwezigheid van inflammatoire cytokinen zoals GM-CSF12. Belangrijk is dat er in het fysiologische milieu van weefsel in vivo waarschijnlijk een grote heterogeniteit van macrofaagpolarisatie is, inclusief een mengsel en verschillende verhoudingen van diverse M1- en M2-achtige macrofaagpopulaties die bijdragen aan het lot van tbc-infectie36. We hebben eerder een menselijk organotypisch longweefselmodel ontwikkeld dat 3D-studies van macrofaaggemedieerde granuloomvorming in TB37mogelijk maakt. Het kan interessant zijn om het huidige M1/M2-polarisatieprotocol in combinatie met het longweefselmodel te gebruiken om de vorming van tbc-granuloom, effectorfuncties en M1/M2-verhouding in experimenteel weefsel verder te bestuderen.

Dit M1/M2 flowcytometrieprotocol kan gemakkelijk worden aangepast om een uitgebreid panel van myeloïde markers op te nemen die nuttig zijn voor de beoordeling van kenmerken die verband houden met remmende en inflammatoire reacties. Er is een grote onderzoeksinteresse in remmende immuuncontrolepuntmoleculen zoals PD-1, SIRP-α, IDO en arginases die macrofaagreacties kunnen moduleren38. In deze context kan polarisatie van myeloïde cellen ook andere stimuli omvatten die immunoregulerende macrofagen (Mreg) of myeloïde-afgeleide suppressorcellen (MDSC) bevorderen waarvan is aangetoond dat ze betrokken zijn bij verschillende ziekten, waaronder TB38. Meer geavanceerde flow cytometrie panelen van M1/M2/Mreg macrofaag subsets kunnen ook intracellulaire kleuring van cytokinen/chemokinen IL-1β, TNF-α, IL-10 en MCP-1 of andere oplosbare factoren of effector moleculen zoals inductief stikstofmonoxide (iNOS) en antimicrobiële peptiden omvatten. Dit zou de mogelijkheden kunnen vergroten om polyfunctionele macrofaagreacties te bestuderen, vergelijkbaar met wat uitgebreid is beschreven voor T-cellen39.

Momenteel kunnen flowcytometriekleuringspanelen tot 30-40 kleuren bevatten, wat de mogelijkheid biedt om meerdere celsubgroepen en moleculen tegelijkertijd te immunofenotyperen. De basis experimentele opzet van dit M1/M2 flow cytometrie protocol kan worden gebruikt als een ruggengraat die compatibel is met de meeste oude en nieuwe flow cytometers en kan worden gebouwd en aangepast aan individuele behoeften, inclusief de uitdagingen die het werken met virulente Mtb in een BSL-3 omgeving met zich meebrengt. Tegenwoordig zijn dimensionaliteitsreductietechnieken zoals UMAP beschikbaar in de nieuwe versies van flowcytometriesoftware, die analyse van een groot aantal parameters mogelijk maakt die worden gegenereerd in eencellige studies die essentieel zijn voor een betere visualisatie en interpretatie van hoogdimensionale gegevens40. De constante technologische verbeteringen in flowcytometrie zullen waarschijnlijk de komende jaren worden voortgezet, waaronder de combinatie van multiparametrische fenotypering in combinatie met moderne celsorteermogelijkheden, waar dit protocol nuttig zou kunnen zijn in verschillende op macrofaag gebaseerde Mtb-infectietesten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken onze collega's van het Zweedse Agentschap voor volksgezondheid, Matilda Svensson en Solomon Ghebremichael voor hun hulp in het BSL-3-laboratorium.

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Swedish Heart and Lung Foundation (HLF) (2019-0299 en 2019-0302 aan SB), de Swedish Research Council (VR) (2014-02592, 2019-01744 en 2019-04720 aan SB), de Foundation to Prevent Antibiotic Resistance (Resist), Karolinska Institutet Foundations ML werd ondersteund door de Swedish Children's Cancer Foundation (TJ2018-0128 en PR2019-0100).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
8-well chamber slidesLab-Tek154534
BD Comp bead plusBD560497
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
DAPI Mounting mediaVector LaboratoriesH-1200-10
EDTA (0,5 M)Karolinska University hospital, HuddingeN/A
Falcon 6-well Flat Bottom platesCorning Life Sciences353046
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Glycerol (70%)Karolinska University hospital, HuddingeN/A
GM-CSFPeprotech300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibodyInvitrogenR37121Secundaire antilichaam voor CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibodyInvitrogenA-11037Secundaire antilichaam voor CD163
HEPESGE Healthcare Life SciencesSH30237.01
IFN-γPeprotech300-02
IL-4Peprotech200-04
L-GlutamineGE Healthcare Life SciencesSH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5)Sigma-AldrichL6529
LymphoprepAlere Technologies AS11508545
M-CSFPeprotech300-25
Middle Brook 7H10 agar platesKarolinska University hospital, HuddingeN/A
Middle Brook 7H9 mediaKarolinska University hospital, HuddingeN/A
Mouse anti-human CD64 primary antibodyBio-RadMCA756GClone: 10.1
Na-pyruvateGE Healthcare Life SciencesSH300239.01
Normal goat serumJackson ImmunoResearch005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibodyGeneTexGTX81526Polyklonaal
RPMI 1640Life Technologies CorporationSH30096.01
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
TubeSpin bioreactor tubesTPP Techno Plastic Products AG87050
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Tween-80Sigma-AldrichP4780

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  2. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Scientific World Journal. 11, 2391-2402 (2011).
  3. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. Journal of Immunology. 164 (12), 6166-6173 (2000).
  4. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Reports. 6, 13(2014).
  5. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  6. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  7. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  8. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. Journal of Immunology. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  9. Nathan, C. F., Murray, H. W., Wiebe, M. E., Rubin, B. Y. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. Journal of Experimental Medicine. 158 (3), 670-689 (1983).
  10. Leidi, M., et al. M2 macrophages phagocytose rituximab-opsonized leukemic targets more efficiently than m1 cells in vitro. Journal of Immunology. 182 (7), 4415-4422 (2009).
  11. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 176 (1), 287-292 (1992).
  12. Italiani, P., Boraschi, D. From Monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5, 514(2014).
  13. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4560-4565 (2004).
  14. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 88 (1), 159-168 (2010).
  15. Refai, A., Gritli, S., Barbouche, M. R., Essafi, M. Mycobacterium tuberculosis virulent factor ESAT-6 drives macrophage differentiation toward the pro-inflammatory M1 phenotype and subsequently switches it to the anti-inflammatory M2 phenotype. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 327(2018).
  16. Kahnert, A., et al. Alternative activation deprives macrophages of a coordinated defense program to Mycobacterium tuberculosis. European Journal of Immunology. 36 (3), 631-647 (2006).
  17. Marino, S., et al. Macrophage polarization drives granuloma outcome during Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 83 (1), 324-338 (2015).
  18. Erbel, C., et al. An in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization. Journal of Visualized Experiments. (76), e50332(2013).
  19. Lee, C. Z. W., Kozaki, T., Ginhoux, F. Publisher Correction: Studying tissue macrophages in vitro: are iPSC-derived cells the answer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 726(2018).
  20. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323(2013).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).
  22. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Njoroge, J. M., et al. Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells. Cytometry. 44 (1), 38-44 (2001).
  24. Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
  25. Rao Muvva, J., Parasa, V. R., Lerm, M., Svensson, M., Brighenti, S. Polarization of human monocyte-derived cells with vitamin D promotes control of Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Immunology. 10, 3157(2019).
  26. Tarique, A. A., et al. functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
  27. Hristodorov, D., et al. Targeting CD64 mediates elimination of M1 but not M2 macrophages in vitro and in cutaneous inflammation in mice and patient biopsies. MAbs. 7 (5), 853-862 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Xu, Z. J., et al. The M2 macrophage marker CD206: a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia. Oncoimmunology. 9 (1), 1683347(2020).
  30. Liu, Q., et al. Differential expression and predictive value of monocyte scavenger receptor CD163 in populations with different tuberculosis infection statuses. BMC Infectious Diseases. 19 (1), 1006(2019).
  31. Sugaya, M., et al. Association of the numbers of CD163(+) cells in lesional skin and serum levels of soluble CD163 with disease progression of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Dermatological Science. 68 (1), 45-51 (2012).
  32. Nawaz, A., et al. CD206(+) M2-like macrophages regulate systemic glucose metabolism by inhibiting proliferation of adipocyte progenitors. Nature Communications. 8 (1), 286(2017).
  33. Liu, B., Zhang, M., Zhao, J., Zheng, M., Yang, H. Imbalance of M1/M2 macrophages is linked to severity level of knee osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 16 (6), 5009-5014 (2018).
  34. Lee, C., et al. M1 macrophage recruitment correlates with worse outcome in SHH Medulloblastomas. BMC Cancer. 18 (1), 535(2018).
  35. Rekha, R. S., et al. Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11 (9), 1688-1699 (2015).
  36. Mattila, J. T., et al. Microenvironments in tuberculous granulomas are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide synthase and arginase isoforms. Journal of Immunology. 191 (2), 773-784 (2013).
  37. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. Journal of Visualized Experiments. (104), e53084(2015).
  38. Brighenti, S., Joosten, S. A. Friends and foes of tuberculosis: modulation of protective immunity. Journal of Internal Medicine. , 12778(2018).
  39. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Good cell, bad cell: flow cytometry reveals T-cell subsets important in HIV disease. Cytometry Part A. 77 (7), 614-622 (2010).
  40. Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38-44 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

Trefwoorden

M1 M2 polarisatieflowcytometrie analyseGM CSF M CSF differentiatieIFN gamma LPS IL 4 stimulatieUMAP PhenoGraph analyseCD64 CD86 TLR2 markersCD163 CD200R CD206 markersconfocale microscopie beeldvorming

Gerelateerde artikelen