Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Samenvatting

Het vastleggen van de dynamische replicatie- en assemblageprocessen van virussen is belemmerd door het ontbreken van robuuste in situ hybridisatie (ISH) -technologieën die gevoelige en gelijktijdige etikettering van viraal nucleïnezuur en eiwit mogelijk maken. Conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) methoden zijn vaak niet compatibel met immunostaining. We hebben daarom een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA en protein), die gelijktijdige eencellige visualisatie van DNA, RNA en eiwit mogelijk maakt. In vergelijking met conventionele DNA FISH maakt MICDDRP gebruik van vertakte DNA (bDNA) ISH-technologie, die de gevoeligheid en detectie van oligonucleotide-sondes drastisch verbetert. Kleine modificaties van MICDDRP maken beeldvorming van virale eiwitten mogelijk gelijktijdig met nucleïnezuren (RNA of DNA) van verschillende strengen. We hebben deze protocollen toegepast om de levenscyclus van meerdere virale pathogenen te bestuderen, waaronder humaan immunodeficiëntievirus (HIV)-1, humaan T-lymfotroop virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) en influenza A-virus (IAV). We hebben aangetoond dat we virale nucleïnezuren en eiwitten efficiënt kunnen labelen voor een breed scala aan virussen. Deze studies kunnen ons een verbeterd mechanistisch begrip geven van meerdere virale systemen en bovendien dienen als een sjabloon voor de toepassing van multiplexed fluorescentie beeldvorming van DNA, RNA en eiwit over een breed spectrum van cellulaire systemen.

Inleiding

Hoewel er duizenden commerciële antilichamen beschikbaar zijn om eiwitten specifiek te labelen via conventionele immunostaining-benaderingen, en terwijl fusie-eiwitten kunnen worden ontworpen met foto-geoptimaliseerde fluorescerende tags voor het volgen van meerdere eiwitten in een monster¹, is microscopische visualisatie van eiwit vaak niet compatibel met conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)² . Technische beperkingen in gelijktijdige visualisatie van DNA, RNA en eiwit met behulp van op fluorescentie gebaseerde benaderingen hebben een diepgaand begrip van virusreplicatie belemmerd. Door zowel viraal nucleïnezuur als eiwit in de loop van de infectie te volgen, kunnen virologen fundamentele processen visualiseren die ten grondslag liggen aan virusreplicatie en assemblage 3,4,5,6.

We hebben een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en Protein (MICDDRP)³, die gebruik maakt van vertakte DNA (bDNA) in situ technologie om de gevoeligheid van nucleïnezuurdetectie te verbeteren ^7,8,9 . Bovendien maakt deze methode gebruik van gepaarde sondes voor verbeterde specificiteit. bDNA-sequentiespecifieke sondes gebruiken vertakkende voorversterker en versterker-DNA's om een intens en gelokaliseerd signaal te produceren, ter verbetering van eerdere hybridisatiemethoden die afhankelijk waren van het richten op herhaalde gebieden in het DNA⁹. Geïnfecteerde cellen in een klinische context bevatten vaak geen overvloedig viraal genetisch materiaal, wat een grondstof vormt voor een gevoelige methode voor fluorescente nucleïnezuurdetectie in diagnostische omgevingen. De commercialisering van bDNA-technologie door middel van benaderingen zoals RNAscope⁷ en ViewRNA¹⁰ hebben deze niche opgevuld. De gevoeligheid van bDNA-fluorescentiebeeldvorming heeft ook een belangrijk nut in de celbiologie, waardoor schaarse nucleïnezuursoorten in celkweekmodellen kunnen worden gedetecteerd. De enorme verbetering van de gevoeligheid maakt op bDNA gebaseerde beeldvormingsmethoden geschikt voor het bestuderen van virussen. Een mogelijke tekortkoming is echter dat deze methoden zich richten op het visualiseren van RNA of RNA en eiwit. Alle replicerende cellen en veel virussen hebben DNA-genomen of vormen DNA tijdens hun replicatiecyclus, waardoor methoden die in staat zijn om zowel RNA als DNA, evenals eiwitten, in beeld te brengen, zeer wenselijk zijn.

In het MICDDRP-protocol voeren we bDNA FISH uit voor detectie van viraal nucleïnezuur met behulp van de RNAscope-methode, met wijzigingen⁷. Een van de belangrijkste wijzigingen in dit protocol is optimalisatie van proteasebehandeling na chemische fixatie. Proteasebehandeling vergemakkelijkt de verwijdering van eiwitten gebonden aan nucleïnezuur om de hybridisatie-efficiëntie van de sonde te verbeteren. Proteasebehandeling wordt gevolgd door incubatie met vertakte oligonucleotide-sonde(s). Na het aanbrengen van bDNA-sonde(s) worden monsters gewassen en vervolgens geïncubeerd met signaalvoorversterker en versterker-DNA's. Multiplexed in situ hybridization (ISH), labeling van meerdere gendoelen, vereist doelsondes met verschillende kleurkanalen voor spectrale differentiatie⁷. Incubatie met DNA-versterkers wordt gevolgd door immunofluorescentie (IF).

bDNA ISH verleent verbeteringen in signaal-naar-ruis door versterking van doelspecifieke signalen, met een vermindering van achtergrondruis van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen ^7,11. Doelsondes zijn ontworpen met behulp van softwareprogramma's die openbaar beschikbaar zijn en die de waarschijnlijkheid van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen voorspellen en de smelttemperatuur (T_m) van de probe-target hybride ^7,11 berekenen. Doelsondes bevatten een 18- tot 25-basengebied dat complementair is aan de doel-DNA / RNA-sequentie, een spacer-sequentie en een 14-base staartsequentie. Een paar doelsondes, elk met een verschillende staartsequentie, hybridiseren naar een doelgebied (verspreid over ~ 50 bases). De twee staartsequenties vormen een hybridisatieplaats voor de voorversterkersondes, die 20 bindingsplaatsen voor de versterkersondes bevatten, die bovendien 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde bevatten. Als voorbeeld, een gebied van één kilobase (kb) op het nucleïnezuurmolecuul wordt gericht door 20 sondeparen, waardoor een moleculaire steiger ontstaat voor sequentiële hybridisatie met de voorversterker, versterker en labelsonde. Dit kan dus leiden tot een theoretische opbrengst van 8000 fluorescerende labels per nucleïnezuurmolecuul, waardoor detectie van afzonderlijke moleculen en enorme verbeteringen ten opzichte van conventionele FISH-benaderingen⁷ mogelijk worden (zie figuur 1A voor schematische bDNA-signaalversterking). Als u sondes wilt instellen voor gemultiplexte ISH, moet elke doelsonde zich in een ander kleurkanaal bevinden (C1, C2 of C3). Deze doelsondes met verschillende kleurkanalen bezitten verschillende 14-base staartsequenties. Deze staartsequenties binden verschillende signaalversterkers met verschillende fluorescerende sondes, waardoor gemakkelijke spectrale differentiatie over meerdere doelen mogelijk wordt. In het gepresenteerde protocol, tabel 4 in stap 9, vindt u meer informatie over fluorescerend labelende doelsondes. Daarnaast geven figuur 2 en figuur 3 voorbeelden van hoe we de juiste versterker 4-FL (A, B of C) (fluorescerende sonde en de laatste hybridisatiestap) hebben gekozen om specifieke fluorescerende etikettering van meerdere virale nucleïnezuurdoelen na HIV-1- en HTLV-1-infecties te bereiken.

We hebben verschillende toepassingen van gelijktijdige fluorescentievisualisatie van RNA, DNA en eiwitten gedemonstreerd, waarbij kritieke stadia van virusreplicatie met een hoge spatiotemporale resolutie ^3,4,5 werden waargenomen. Bijvoorbeeld, gelijktijdige eencellige visualisatie van viraal RNA, cytoplasmatisch en nucleair DNA en eiwit hebben ons in staat gesteld om belangrijke gebeurtenissen tijdens HIV-1-infectie te visualiseren, waaronder het volgen van RNA-bevattende kernen in het cytoplasma voorafgaand aan nucleaire binnenkomst en integratie van proviraal DNA³. Daarnaast hebben we MICDDRP toegepast om de effecten van gastheerfactoren en medicamenteuze behandeling op virale infectie en replicatie^te karakteriseren ^4,5. In Ukah et al. volgden we reactivering van HIV-1-transcriptie in latentiecelmodellen die werden behandeld met verschillende latentie-omkeermiddelen om HIV-transcriptie en latentieomkering te visualiseren⁴. Bovendien kan MICDDRP ons in staat stellen om fenotypische veranderingen geassocieerd met antivirale remming toegeschreven aan behandeling van kleine moleculen of gastheerfactorbeperking te visualiseren. Als een proof of concept voor de robuustheid en brede toepasbaarheid van onze aanpak, hebben we aangetoond dat we wijzigingen van ons protocol kunnen gebruiken om viraal nucleïnezuur efficiënt te labelen om infectie te volgen, niet alleen in humaan immunodeficiëntievirus (HIV) -1, maar ook humaan T-lymfotroop virus (HTLV) -1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) en influenza A-virus (IAV). Omdat de HIV-1-levenscyclus bestaat uit zowel viraal DNA- als RNA-soorten, hebben we het grootste deel van onze optimalisatie van MICDDRP uitgevoerd na hiv-1-replicatiekinetiek. Daarnaast hebben we echter aangetoond dat we de synthese van verschillende virale RNA-transcripten van een of beide zintuig (+) en antisense (-) strandedness in virussen zoals ZIKV, IAV, HBV en HCV kunnen volgen om virale transcriptie en replicatie te controleren 3,4,5,6. De studies zijn gericht op het verbeteren van het mechanistische begrip van verschillende virale processen en dienen als richtlijn om deze fluorescentiebeeldvormingstechnologie te implementeren in een breed scala aan cellulaire modellen.

Protocol

1. Zaadcellen (suspensie versus aanhangende cellen) op coverslips of kamerdia's (protocol gepresenteerd maakt gebruik van coverslips).

1. Zaaien van suspensiecellen
   1. Bereid poly-D-lysine (PDL) gecoate coverslips (vergemakkelijkt de hechting van suspensiecellen aan coverslip) door eerst coverslips in ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten te broeden (steriliseert coverslips en verwijdert eventuele resten). Was vervolgens 2x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u coverslips in PDL (20 μg / ml) gedurende 30 minuten (min) bij kamertemperatuur (RT) broedt.
   2. Verwijder PDL en was 2x in PBS. Pelletcellen (eerder geïnfecteerd/behandeld op basis van gewenste beeldvormingsomstandigheden) en resuspenderen 10⁶cellen in 50 μL PBS. Spot 50 μL cellen op glas (PDL-gecoat) en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
2. Zaaien van aanhangende cellen
   1. Kweekcellen op steriele coverslip geplaatst in 6-well schotel en infecteren cellen met virale deeltjes of behandelen met verbinding van belang. Laat cellen 50-70% confluency bereiken voorafgaand aan de monstervoorbereiding voor beeldvormingsexperimenten.

2. Cellulaire fixatie: om cellulaire morfologie te behouden voor fluorescentiebeeldvormingsstudies

OPMERKING: Houd 4% PFA en PBS op RT gedurende ten minste 30 minuten voor cellulaire fixatie.

1. Aspirateer de cellulaire media, was cellen op coverslips 3x in PBS en fixeer cellen in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten. Aspirateer PFA en wascellen in PBS 2x.
   OPMERKING: Cellen kunnen nu worden uitgedroogd en opgeslagen als de experimentator het experiment op een andere datum wil hervatten. Vaste cellen kunnen worden gedehydrateerd in EtOH voorafgaand aan opslag.
   1. Verwijder PBS na het wassen na cellulaire fixatie en vervang door 500 μL van 50% EtOH (v/v in water). Incubeer bij RT gedurende 5 min.
   2. Verwijder 50% EtOH en vervang door 500 μL van 70% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
   3. Verwijder 70% EtOH en vervang door 500 μL van 100% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
   4. Verwijder 100% EtOH en vervang door verse 100% EtOH.
      OPMERKING: Gedehydrateerde cellen kunnen gedurende 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. Sluit platen af met tape of parafilm voorafgaand aan opslag om verdamping van EtOH te voorkomen.
   5. Rehydrateer cellen om over te gaan op multiplexed fluorescentie labeling van cellen / virus.
   6. Verwijder 100% EtOH en vervang door 500 μL van 70% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 2 min.
      OPMERKING: Laat cellen op geen enkel moment uitdrogen. Gebruik altijd voldoende oplossing om alle cellen onder te dompelen.
   7. Verwijder 70% EtOH en vervang door 500 μL van 50% EtOH. Incubeer bij RT gedurende 2 min.
   8. Verwijder 50% EtOH en vervang door 1x PBS.
      OPMERKING: Bereid proteaseverdunning, hybridisatiesondes en wasbuffer voor voorafgaand aan de proteasebehandeling (stap 4) en de doelsondetoepassing (stap 5). Specifieke instructies voor de bereiding van reagens worden aan het begin van elke respectieve stap gepresenteerd.

Reagentia	Overige opmerkingen
Protease oplossing	Voorbereiden in 1X PBS
Doel oligonucletodie sonde(s)	Verdunnen in hybridisatiebuffer
Wasbuffer	Wasbeurten volgens doelhybridisatiestappen
Hybridisatiebuffer	Recept in tabel 3

Tabel 1: Belangrijke reagentia in het MICDDRP-protocol.

3. Celpermeabilisatie: verhoogt de toegang tot de cel en cellulaire organellen voor binnenkomst van grote moleculen (antilichamen, nucleïnezuurhybridisatiesondes)

1. Verwijder 1x PBS na cellulaire fixatie of rehydratatie en vervang door 500 μL van 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Incubeer bij RT gedurende 10 min. Vervang één voor één. Was één keer met 500 μL 1x PBS en voeg verse 1x PBS toe.

4. Coverslip immobilisatie op glasschuif en proteasebehandeling om nucleïnezuurbindende eiwitten uit vast viraal / cellulair nucleïnezuur te verwijderen om de hybridisatie-efficiëntie te verbeteren

OPMERKING: Bereid de verdunde Protease III (zie details van reagens in de tabel met materialen) oplossing tijdens cellulaire permeabilisatie. Laat protease RT bereiken gedurende 10 minuten voordat het permeabiliseert.

1. Plaats een klein druppeltje nagellak op een gesteriliseerde glasplaat. Droog de achterkant af (kant zonder cellaag) en plaats de rand van de coverslip op de nagellakdruppel, met de zijkant met de aangehechte cellen naar boven gericht. Voeg enkele druppels PBS toe aan de geïmmobiliseerde coverslip om uitdroging te voorkomen.
   1. Teken een cirkel (ongeveer 3 mm verwijderd van de coverslip) rond de omtrek van de coverslip die nu aan de dia is bevestigd met behulp van een hydrofobe barrièrepen (waterafstotende pen die reagentia gelokaliseerd houdt op cellen).
2. Verdun Protease III in 1x PBS (100 μL/coverslip).
   OPMERKING: Proteaseconcentratie moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van verschillen in celtypen, sondes of doelnucleïnezuur (en) door empirische optimalisatie (zie discussie). Voor de meest efficiënte RNA/DNA-etikettering in verschillende virale systemen hadden we succes met de volgende verdunningen in tabel 2 hieronder met verdunningen variërend van (1 tot 2) -(1 tot 15) (protease tot 1x PBS).

Probe Doelen	Proteaseverdunning in 1X PBS (Protease III tot 1X PBS)
HIV-1 DNA/RNA	1 tot 5
HTLV-1 DNA/RNA	1 tot 5
HBV pgRNA en totaal HBV RNA	1 tot 15
IAV-RNA	1 tot 15
ZIKV-RNA	1 tot 2

Tabel 2: Protease III verdunningen in PBS voor virale nucleïnezuurhybridisatie.

3. Decanteer de 1x PBS op de coverslip na immobilisatie en breng de verdunde Protease III aan.
4. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
5. Decant protease oplossing en dompelglijmen onder in 1x PBS. Roer met een schommelschaal gedurende 2 min op RT. Herhaal wassen met nieuwe 1x PBS.
   1. Was monsters alleen voor DNA-detectie driemaal met nucleasevrij water gedurende 2 minuten, gevolgd door incubatie met 5 mg/ml RNase A verdund in PBS gedurende 30 minuten bij 37 °C.
   2. Decanteer RNase A-oplossing en was 3x gedurende 2 minuten met ultrapuur water. Ga verder met ISH van doelsonde(s).
      OPMERKING: Hybridisatiebuffer verbetert vDNA-detectie zonder de vRNA-kleuringsefficiëntie te beïnvloeden voor de gepresenteerde resultaten (representatieve resultaten). Verdunde DNA-kanaal 1 (C1) sondes 1:1 met hybridisatiesonde. Verdun RNA C2- en C3-sondes in hybridisatiebuffer. De C2- en C3-sondes die in onze beeldvormingsstudies worden gebruikt, zijn in 50X-oplossingen (1:50; doelsonde naar hybridisatiebuffer).
6. Bereid hybridisatiebuffer voor in nucleasevrij water volgens de onderstaande stapsgewijze procedure:
   1. Voeg in een buis van 15 ml 700 μL nucleasevrij water, 300 μL van 50% (gewicht/volume (w/v)) dextransulfaat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM natriumcitraat (pH 6,2) en 375 mg (poeder) ethyleencarbonaat toe.
   2. Meng goed met behulp van een vortex om ethyleencarbonaat op te lossen (zorg ervoor dat al het poeder is opgelost en een heldere oplossing heeft).
   3. Voeg 25 μL van 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 en voldoende nucleasevrij water toe om 2,5 ml (2x oplossing) te voltooien.
      OPMERKING: Het recept voor de gepresenteerde hybridisatiebuffer is te vinden in tabel 3 hieronder. Oplossing is stabiel voor een week. Zorg voor voldoende menging van Tween-20 wasmiddel, terwijl u voorzichtig bent om borrelen van de oplossing te voorkomen.

Reagens	Voorraad concentratie	Aanvullende opmerkingen
Nucleasevrij water	NA
Dextransulfaat	50% (zonder)	Zeer stroperig
Tafelzout	5 meter
Natriumcitraat (pH 6,2)	200m	Bewaren bij 4 °C
Ethyleencarbonaat	NA	Poeder
Tween-20	10% (v/v)

Tabel 3: Hybridisatiebufferlijst van reagentia.

5. Incubatie met DNA / RNA-doelhybridisatiesondes: Doel-oligonucleotidesondes binden aan regio('s) van belang, waardoor een moleculaire scaffold ontstaat voor voorversterkers, versterkers en fluorescerende sondes om te binden.

OPMERKING: Warm DNA/RNA-sondes op bij 40 °C gedurende 10 minuten (tijdens celpermeabilisatie) en koel af tot RT gedurende ten minste 10 minuten, als er geen RNase-behandeling is inbegrepen. Als RNase-behandeling of verdere monsterbehandeling nodig is voorafgaand aan de hybridisatie van de doelsonde, warme sondes dienovereenkomstig. Spin C2- en C3-sondes na opwarming en verdun in hybridisatiebuffer. Na verdunning kunnen C2- en C3-sondes kort worden opgewarmd. Warm 50x wasbuffer (zie materiaaltabel voor meer details) op 40 °C gedurende 10-20 minuten en verdun tot 1x in water van moleculair biologische kwaliteit.

1. Incubeer 200 μL van de hybridisatiebuffer bij 67 °C gedurende 10 minuten voorafgaand aan de toevoeging van hybridisatiesonde(s). Verdunde sonde in hybridisatiebuffer (recept vermeld in tabel 2). Voeg 50 μL/coverslip toe.
2. Incubeer in de bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 2 uur (h). Decanteer sondes en dompelglijmen in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min te wiegen op RT. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.

6. Versterker (Amp) 1-FL Hybridisatie: Toevoeging van voorversterker die complementair is aan de staartsequentie van de doel-DNA / RNA-sondes (stap 5)

OPMERKING: Versterkers moeten voor gebruik op RT staan. Haal elke individuele versterker 30 minuten voor gebruik uit de koelkast en laat op de bank bij RT liggen.

1. Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
2. Voeg 1 druppel Amp 1-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 30 min.
3. Decant Amp 1-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.

7. Amp 2-FL Hybridisatie: Incubatie met signaalversterker met cognate herkenningsvolgorde naar voorversterkers (Amp 1-FL)

1. Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
2. Voeg 1 druppel Amp 2-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
3. Decant Amp 2-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.

8. Amp 3-FL Hybridisatie: Incubatie met tweede signaalversterker

1. Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
2. Voeg 1 druppel Amp 3-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 30 min.
3. Decant Amp 3-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min op RT te wiegen. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer.

9. Amp 4-FL Hybridisatie: fluorescerend label en laatste hybridisatiestap

OPMERKING: Zie eerst tabel 4 om de geschikte Amp 4 (A, B of C) - FL te kiezen op basis van de kanalen van de doelsonde(s). Beoordeel welke Amp 4-FL nodig is om DNA/RNA van belang te labelen. Een voorbeeld wordt gegeven door de onderstaande tabel:

	Een	B	C
DNA-kanaal 1 (C1)	488	550	550
DNA/RNA-kanaal 2 (C2)	550	488	647
RNA-kanaal 3 (C3)	647	647	488

Tabel 4: Selectie van Amp 4 (A, B of C)-FL fluorescentiesonde voor gemultiplexte ISH.

OPMERKING: Voor multiplexed FISH (meerdere doelen) is het kiezen van de juiste Amp 4 (A, B of C) - FL van cruciaal belang voor het correct labelen van uw doel van interesse (s). Doelsondes (stap 5) hebben verschillende kleurkanalen (C1, C2 of C3), die hun respectieve fluorescerende label (Alexa 488, Atto 550 of Alexa 647) dicteren, op basis van de gekozen Amp 4-FL. Voorbeelden van het kiezen van fluorofoorcombinaties voor multiplexed imaging worden gegeven in de legenda's van figuur 2 en figuur 3. Als bijkomend voorbeeld zal de selectie van Amp 4B-FL selectief DNA C1-sondes labelen met Atto 550 en RNA C3-sondes met Alexa 647.

1. Verwijder dia's uit 1x wasbuffer en tik/absorbeer om overtollige vloeistof te verwijderen.
2. Voeg 1 druppel Amp 4-FL toe aan de coverslip. Incubeer in een bevochtigde oven bij 40 °C gedurende 15 min.
   OPMERKING: Volg stap 9.2, houd monsters bedekt, beschermd tegen het licht.
3. Decant Amp 4-FL en dompel onder in 1x wasbuffer. Roer door de schaal 2 min te wiegen op RT. Herhaal de was met nieuwe 1x wasbuffer. Wassen met 1x PBS (2 min) en bewaren in PBS.

10. Eiwitimmunostaining: om eiwitten van belang te labelen

1. Decanteer PBS en voeg 200 μL blokkeerbuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS in PBS met 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) toe aan de coverslip. Incubeer 1 uur bij RT.
2. Decanterende blokkeringsbuffer en breng 200 μL primair antilichaam verdund in PBST + 1% w/v BSA aan. Incubeer 1 uur bij RT.
3. Was de glijbaan twee keer met PBST gedurende 10 minuten op RT met schudden.
4. Breng secundair antilichaam naar keuze aan gedurende 1 uur bij RT in PBST + 1% w / v BSA.
5. Was de glijbaan met PBST gedurende 10 minuten op RT met schudden.

11. Nucleaire kleuring: Contra-vlekkernen na immunostaining

1. Decanteer PBST en breng DAPI of nucleaire vlek naar keuze aan gedurende 1 min bij RT.
2. Was de glijbaan twee keer met PBS gedurende 10 minuten op RT met schudden.

12. Montage

1. Plaats 1 druppel antifade-oplossing (bijv. Prolong Gold) op een nieuwe steriele glazen glijbaan (eerst glijbaan reinigen met EtOH en laten drogen om ervoor te zorgen dat er geen resten op glas zitten). Verdeel met dezelfde punt de druppel antifade-oplossing om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als de coverslip.
   OPMERKING: De antifade-oplossing is erg stroperig en kan moeilijk te pipetteren zijn. Het afsnijden van de tip van een tip van 200 μL voorafgaand aan het pipetteren kan deze problemen verminderen.
2. Verwijder coverslip met celmonster van de dia en dompel onder in PBS om resterende nagellak aan de achterkant te verwijderen met behulp van de tang en PBS. Droge tang en achterkant van de coverslip met behulp van een Kimwipe.
3. Voorzichtig ingebedde coverslip in de druppel antifade-oplossing, waarbij de monsterzijde (zijkant met cellaag) van coverslip op druppel wordt geplaatst).
4. Laat de monsters een nacht drogen.

13. Beeldvorming

1. Afbeelding met een epifluorescente microscoop.

Resultaten

Een schema van MICDDRP is weergegeven in figuur 1. Labeling van DNA en RNA wordt gevolgd door immunostaining. Het gebruik van vertakkende versterkers verhoogt het signaal, waardoor detectie van enkele nucleïnezuurmoleculen mogelijk is.

Figuur 1: Schema van MICDDRP en stapsgewijze workflow. (A) het bDNA-signaal wordt ver...

Discussie

Gelijktijdige visualisatie van RNA, DNA en eiwit vereist vaak uitgebreide optimalisatie. Twee veelgebruikte methoden zijn 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) labeling en DNA FISH. EdU-etikettering is toegepast om viraal DNA en eiwit tegelijkertijd te visualiseren, omdat EdU wordt opgenomen in ontluikend DNA en vervolgens wordt gelabeld met azide-bevattende fluorescerende kleurstoffen via klikchemie. EdU-etikettering kan dus worden gebruikt om native virusreplicatiekinetiek van DNA-virussen of virussen te monitoren me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% PFA
50% dextran sulfate	Amreso	198	Voor DNA hybridisatie buffer
50X wash buffer	ACD Bio	320058
6-wells platen
Amplifier 1-FL	ACD Bio
Amplifier 2-FL	ACD Bio
Amplifier 3-FL	ACD Bio
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Raadpleeg Amp-4 tabel in protocol
Anti-HCV NS5a antilichaam	Abcam	ab13833	Muis monoklonaal; werkt met HCV genotypen 1a, 1b, 3 en 4
Anti-HIV-1 p24 monoklonaal antilichaam	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antilichaam	Abcam	ab80613	Konijn polyklonaal
Anti-PB1 antilichaam	GeneTex	GTX125923	Antilichaam tegen griep eiwit
Runder serum albumine			Blokreagens voor immunokleuring
Cel media met supplementen			Media geschikt voor celmodel
Dekvlakjes
DAPI	ACD Bio		Kernkleuring (RNAscope kit van ACD Bio)
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (1X PBS)	Gibco	14190250	Geen calcium en magnesium
Ethyleen carbonaat	Sigma	E26258
Fetaal bovien serum (FBS)			Gebruik specifiek FBS op basis van het serum waarin het secundaire antilichaam werd opgewekt (bijv. geiten FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscoopglaasjes	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Voorgereinigd
HCV-GT2a-sense-C2 sonde	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA sonde
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA sonde
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA sonde
HybEZ hybridisatie oven	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge hydrofobe barrière pen	Vector Laboratories	H-4000
Nagellak			Voor het onbeweeglijk maken van het dekvlakje op het glaasje voorafgaand aan de protease behandeling
Nuclease vrij water	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Bedek dekvlakjes in 20 µg/mL van PDL gedurende 30 minuten
Sonde verdunning	ACD Bio	300041	Voor het verdunnen van RNA C2 of C3 sondes
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope® Sonde- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Secundaire antilichamen
Glaazen
Natriumchloride			Voor DNA hybridisatie buffer
Natriumcitraat, pH 6,2			Voor DNA hybridisatie buffer
Tween-20			Voor DNA hybridisatie buffer en PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Totaal HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA sonde
V-HCV-GT2a sonde	ACD Bio	441361	HCV(-) sense RNA sonde
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sense RNA sonde gericht op HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA sonde
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sense RNA sonde
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA sonde
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sense RNA sonde
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA sonde