Bereiding van plaatsspecifieke cytotoxische eiwitconjugaten via maleimide-thiolchemie en Sortase A-gemedieerde ligatie

Samenvatting

Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor een plaatsspecifieke labeling van eiwitten met cytotoxische geneesmiddelen met behulp van maleimide-thiolreactie en sortase A-gemedieerde ligatie.

Samenvatting

Kanker is momenteel wereldwijd de op één na meest voorkomende doodsoorzaak. Het kenmerk van kankercellen is de aanwezigheid van specifieke markereiwitten zoals groeifactorreceptoren op hun oppervlak. Deze eigenschap maakt de ontwikkeling mogelijk van zeer selectieve therapieën, de eiwitbioconjugaten, samengesteld uit targeting-eiwitten (antilichamen of receptorliganden) die door een specifieke linker zijn verbonden met zeer cytotoxische geneesmiddelen. Vanwege de zeer hoge affiniteit en selectiviteit van targeting-eiwitten, herkennen de bioconjugaten markereiwitten op het oppervlak van kankercellen en gebruiken ze receptor-gemedieerde endocytose om het celinterieur te bereiken. Het intracellulaire vesiculaire transportsysteem levert uiteindelijk de bioconjugaten aan de lysosomen, waar proteolyse vrije cytotoxische geneesmiddelen scheidt van de eiwitachtige kern van de bioconjugaten, waardoor geneesmiddelafhankelijke kankerceldood wordt veroorzaakt. Momenteel zijn er verschillende eiwitbioconjugaten goedgekeurd voor de behandeling van kanker en een groot aantal is in ontwikkeling of klinische proeven.

Een van de belangrijkste uitdagingen bij het genereren van de bioconjugaten is een plaatsspecifieke hechting van het cytotoxische geneesmiddel aan het doelwit. De afgelopen jaren is er enorme vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van chemische en enzymatische strategieën voor eiwitmodificatie met cytotoxische geneesmiddelen. Hier presenteren we de gedetailleerde protocollen voor de plaatsspecifieke integratie van cytotoxische kernkoppen in targeting-eiwitten met behulp van een chemische methode die gebruik maakt van maleimide-thiolchemie en een enzymatische benadering die berust op sortase A-gemedieerde ligatie. We gebruiken een gemanipuleerde variant van fibroblastgroeifactor 2 en een fragmentkristalliseerbaar gebied van humaan immunoglobuline G als een voorbeeldig gericht op eiwitten en monomethylauristatine E en methotrexaat als cytotoxische modelgeneesmiddelen. Alle beschreven strategieën maken het mogelijk om zeer efficiënte generatie van biologisch actieve cytotoxische conjugaten met een gedefinieerde moleculaire architectuur te genereren met potentieel voor selectieve behandeling van diverse kankers.

Inleiding

Tientallen jaren van wetenschappelijke inspanningen hebben geleid tot een enorme vooruitgang in onze kennis over de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en progressie van kanker bepalen. Tegelijkertijd zijn de therapeutische mogelijkheden nog steeds grotendeels beperkt vanwege de nadelige effecten van geneesmiddelen die worden veroorzaakt door hun gebrek aan selectiviteit, de grote variabiliteit van tumoren en geneesmiddelresistentie die zich ontwikkelt na langdurige behandeling. Gerichte antikankertherapieën hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen als nieuwe en veelbelovende benaderingen voor de behandeling van d....

Protocol

1. Vervoeging van het Fc-domein met MMAE

OPMERKING: Bereid voorafgaand aan plaatsspecifieke conjugaties de belangrijkste reagentia voor: zeer zuiver eiwit van belang (in dit geval het Fc-fragment en de gemanipuleerde FGF2-variant, als uitgangspunt 1-5 mg recombinant eiwit, bereid volgens Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzylalcohol (PABC)-monomethylauristatine E (MMAE) (LET OP, zeer cytotoxisch middel, voorzichtig behandelen), Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en sortase A¹⁶. Methotrexaat gekoppeld aan tetraglycinepeptide (GGGG-....

Resultaten

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee verschillende strategieën voor de conjugatie van verschillende cytotoxische geneesmiddelen tot interessante eiwitten. Bovendien wordt een combinatie van individuele strategieën getoond die het mogelijk maakt om op een plaatsspecifieke manier cytotoxische conjugaten met dubbele kernkop te genereren.

Zoals te zien is op SDS-PAGE-gels in figuur 2 (baan 2 vs. 3), maakt de maleimide-thiolr.......

Discussie

Vanwege de grote belangstelling voor het ontwerp van selectieve therapieën tegen diverse kankertypes is er een dringende behoefte aan strategieën die het mogelijk maken om plaatsspecifieke hechting van verschillende ladingen aan de doeleiwitten te maken. De plaatsspecifieke modificatie van targeting-eiwitten is van cruciaal belang omdat het zorgt voor homogeniteit van ontwikkelde bioactieve conjugaten, een vereiste voor moderne therapieën. Er zijn verschillende methoden, zowel chemisch a.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CM-Sepharose kolom	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	CCF100
Heparine Sepharose kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE17-0407-01
HiTrap Desalting kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, VS	HY-100374	Toxisch
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	185884
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	646547