Bereiding van plaatsspecifieke cytotoxische eiwitconjugaten via maleimide-thiolchemie en Sortase A-gemedieerde ligatie

Samenvatting

Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor een plaatsspecifieke labeling van eiwitten met cytotoxische geneesmiddelen met behulp van maleimide-thiolreactie en sortase A-gemedieerde ligatie.

Samenvatting

Kanker is momenteel wereldwijd de op één na meest voorkomende doodsoorzaak. Het kenmerk van kankercellen is de aanwezigheid van specifieke markereiwitten zoals groeifactorreceptoren op hun oppervlak. Deze eigenschap maakt de ontwikkeling mogelijk van zeer selectieve therapieën, de eiwitbioconjugaten, samengesteld uit targeting-eiwitten (antilichamen of receptorliganden) die door een specifieke linker zijn verbonden met zeer cytotoxische geneesmiddelen. Vanwege de zeer hoge affiniteit en selectiviteit van targeting-eiwitten, herkennen de bioconjugaten markereiwitten op het oppervlak van kankercellen en gebruiken ze receptor-gemedieerde endocytose om het celinterieur te bereiken. Het intracellulaire vesiculaire transportsysteem levert uiteindelijk de bioconjugaten aan de lysosomen, waar proteolyse vrije cytotoxische geneesmiddelen scheidt van de eiwitachtige kern van de bioconjugaten, waardoor geneesmiddelafhankelijke kankerceldood wordt veroorzaakt. Momenteel zijn er verschillende eiwitbioconjugaten goedgekeurd voor de behandeling van kanker en een groot aantal is in ontwikkeling of klinische proeven.

Een van de belangrijkste uitdagingen bij het genereren van de bioconjugaten is een plaatsspecifieke hechting van het cytotoxische geneesmiddel aan het doelwit. De afgelopen jaren is er enorme vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van chemische en enzymatische strategieën voor eiwitmodificatie met cytotoxische geneesmiddelen. Hier presenteren we de gedetailleerde protocollen voor de plaatsspecifieke integratie van cytotoxische kernkoppen in targeting-eiwitten met behulp van een chemische methode die gebruik maakt van maleimide-thiolchemie en een enzymatische benadering die berust op sortase A-gemedieerde ligatie. We gebruiken een gemanipuleerde variant van fibroblastgroeifactor 2 en een fragmentkristalliseerbaar gebied van humaan immunoglobuline G als een voorbeeldig gericht op eiwitten en monomethylauristatine E en methotrexaat als cytotoxische modelgeneesmiddelen. Alle beschreven strategieën maken het mogelijk om zeer efficiënte generatie van biologisch actieve cytotoxische conjugaten met een gedefinieerde moleculaire architectuur te genereren met potentieel voor selectieve behandeling van diverse kankers.

Inleiding

Tientallen jaren van wetenschappelijke inspanningen hebben geleid tot een enorme vooruitgang in onze kennis over de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en progressie van kanker bepalen. Tegelijkertijd zijn de therapeutische mogelijkheden nog steeds grotendeels beperkt vanwege de nadelige effecten van geneesmiddelen die worden veroorzaakt door hun gebrek aan selectiviteit, de grote variabiliteit van tumoren en geneesmiddelresistentie die zich ontwikkelt na langdurige behandeling. Gerichte antikankertherapieën hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen als nieuwe en veelbelovende benaderingen voor de behandeling van diverse tumoren. Gerichte therapieën zijn gebaseerd op geavanceerde medicijnafgiftesystemen die de cytotoxische lading nauwkeurig aan de kankercellen leveren en de gezonde cellen sparen. Deze omvatten voornamelijk diverse nanodeeltjes, liposomen en op eiwitten gebaseerde medicijndragers.

Kankercellen stellen vaak verhoogde niveaus van specifieke markereiwitten op hun oppervlak bloot. Antilichaamgeneesmiddelconjugaten (ADC's) zijn nieuwe op eiwitten gebaseerde therapieën tegen kanker, die in één molecuul extreme specificiteit van monoklonale antilichamen combineren met een hoge cytotoxische potentie van geneesmiddelen. Eenmaal gebonden aan het oppervlak van de kankercel, gebruikt ADC receptor-gemedieerde endocytose om de cel binnen te dringen. Vervolgens worden ADC's via endosomale compartimenten naar de lysosomen getransporteerd, waar proteasen ADC's afbreken en actieve cytotoxische geneesmiddelen afgeven. Momenteel zijn er in de VS acht ADC's goedgekeurd voor de behandeling van diverse tumoren, waaronder triple-negatieve borstkanker, HER2-positieve borstkanker, urotheelkanker, diffuus grootcellig B-cellymfoom, hematologische maligniteit, Hodgkin-lymfoom en acute myeloïde leukemie. Een groot aantal ADC's is ook in ontwikkeling of wacht op goedkeuring¹. Opmerkelijk is dat eiwittechnische benaderingen hebben geleid tot de ontwikkeling van diverse alternatieven voor monoklonale antilichamen eiwitsteigers en hun cytotoxische conjugaten. Deze omvatten verschillende antilichaamfragmenten ^2,3, DARPins ^4,5, knottinen ^6,7, centyrines⁸, affibodies ^9,10 of gemanipuleerde receptorliganden^11,12.

Er zijn verschillende kritische vereisten waaraan een succesvol cytotoxisch conjugaat op basis van eiwitten moet voldoen, namelijk de stabiliteit van het conjugaat, buitengewone specificiteit, hoge affiniteit van het conjugaat naar kankerspecifieke marker, snelle internalisatie van het conjugaat in het inwendige van de kankercel, het efficiënte transport naar de lysosomen en effectieve intracellulaire afgifte van de actieve payload. Een ander belangrijk kenmerk is de homogeniteit van de geconjugeerden, die grotendeels afhangt van de toegepaste strategie voor de bevestiging van de payload aan de doeleiwitten. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor plaatsspecifieke conjugatie van eiwitten met cytotoxische geneesmiddelen, zoals modificatie van cysteïne- of lysineresiduen in de zijketen van eiwitten, hechting van het geneesmiddel aan onnatuurlijke aminozuren die zijn opgenomen in de targeting-eiwitten, of enzymatische modificaties van de targeting-eiwitten (bijv. met transglutaminase, glycosyltransferase, formylglycine-genererend enzym, sortase A). In de meeste gevallen vereisen plaatsspecifieke conjugatiemethoden modificaties van de doelmoleculen (bijv. via cysteïne-engineering of introductie van korte peptide-tags), maar resulteren ze op hun beurt in een efficiënte productie van homogeen conjugaat van belang.

Hier bieden we protocollen voor zeer efficiënte plaatsspecifieke conjugatie van targeting-eiwitten met cytotoxische geneesmiddelen. Als voorbeeldeiwitten gebruikten we twee verschillende moleculen: het fragment kristalliseerbaar (Fc) van humaan IgG en een gemanipuleerde variant van humane fibroblastgroeifactor 2 (FGF2). Het Fc-fragment vormt een integraal onderdeel van typische ADC's, maar het is ook aanwezig in andere soorten conjugaten zoals cytotoxische peptilichamen of conjugaten van antilichaamfragmenten. FGF2 is een natuurlijke ligand van de fibroblastgroeifactorreceptor (FGFR) die met succes is ontwikkeld om een selectief cytotoxisch conjugaat te produceren dat gericht is op FGFR-overproducerende kankercellen.

We presenteren twee verschillende conjugatiestrategieën die de plaatsspecifieke incorporatie van cytotoxische geneesmiddelen mogelijk maken. Eerst wordt het protocol voor conjugatie aan de cysteïnezijketens van het Fc-fragment via maleimide-thiolchemie op basis van Hermanson's protocol¹³ verstrekt (Figuur 1A,B). In dit protocol worden aanvankelijk twee disulfidebindingen gereduceerd met tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en de resulterende vrije thiolgroepen worden onderworpen aan conjugatie met monomethylauristatine E (MMAE) via maleimide-thiolchemie (Figuur 1B). Door de interactie tussen de constante zware ketendomeinen 2 en 3 (CH2 en CH3) blijft de dimeer structuur van de geneesmiddelgebonden Fc behouden. Ten tweede wordt de strategie voor het genereren van FGF2-conjugaat met dubbele kernkop gepresenteerd die cysteïne-engineering en sortase A-gemedieerde ligatie combineert voor opname van twee verschillende geneesmiddelen in FGF2 op een plaatsspecifieke manier (Figuur 1A,C). De cysteïnevrije variant van FGF2 met extra N-terminale KCKSGG met enkelvoudig blootgesteld cysteïneresidu en C-terminale LPETGG korte peptidetag wordt gebruikt¹². De maleimide-thiol-reactie maakt de conjugatie van MMAE tot cysteïne mogelijk in KCKSSG-linker ontworpen door onze groep^14,15. Sortase A-afhankelijke stap (gebaseerd op Chen et al.)¹⁶ bemiddelt de ligatie van methotrexaat (MTX)-gekoppeld tetraglycinepeptide GGGG-MTX aan de C-terminale LPETGG-sequentie, wat twee soorten conjugaten met één kernkop oplevert (Figuur 1C). Sortase A is een cysteïneprotease dat de transpeptidatiereactie tussen LPETGG- en GGGG-motieven katalyseert. Het enzym bindt zich aan het LPETGG-motief aan de C-terminus van het eiwit, waarna de amidebinding tussen de threonine en de glycine wordt gehydrolyseerd om een enzym-substraatcomplex te vormen. De volgende stap is de aminolyse van de thioester-enzym-substraatbinding, waarbij de donor van een primaire aminogroep het glycineresidu van het tetraglycinemotief¹⁷ is. Combinatie van deze twee benaderingen genereert locatiespecifieke FGF2 dubbele kernkopconjugaten (Figuur 1C). In principe kunnen op voorwaarde dat conjugatieprotocollen met succes kunnen worden toegepast op elk gemanipuleerd targeting-eiwit dat van belang is om selectieve cytotoxische conjugaten te genereren. Bovendien maakt de veelzijdigheid van deze benadering het geschikt voor vele andere eiwit-eiwit- en eiwit-peptideligatiedoeleinden, evenals voor de hechting van lipiden, polymeren, nucleïnezuren en fluoroforen aan eiwitten met een beschikbare sulfhydrylgroep (of gegenereerd door reductie van natieve disulfidebindingen) en/of met een geïntroduceerd klein peptidelabel.

Protocol

1. Vervoeging van het Fc-domein met MMAE

OPMERKING: Bereid voorafgaand aan plaatsspecifieke conjugaties de belangrijkste reagentia voor: zeer zuiver eiwit van belang (in dit geval het Fc-fragment en de gemanipuleerde FGF2-variant, als uitgangspunt 1-5 mg recombinant eiwit, bereid volgens Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzylalcohol (PABC)-monomethylauristatine E (MMAE) (LET OP, zeer cytotoxisch middel, voorzichtig behandelen), Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en sortase A¹⁶. Methotrexaat gekoppeld aan tetraglycinepeptide (GGGG-MTX) (LET OP, MTX is een zeer cytotoxisch middel, voorzichtig behandelen) kan ofwel worden gesynthetiseerd in de vaste ondersteuningsfase volgens de vastefasepeptidesynthese (SPPS)-methode in de FMOC-strategie¹⁹ of worden verkregen uit commerciële bronnen.

1. Om de disulfidebindingen in het Fc-fragment te verminderen (figuur 1), wordt een tienvoudige molaire overmaat aan TCEP toegevoegd aan het Fc-eiwit (39 μM) in PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7,4) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. De pH van de TCEP-stamoplossing moet met 0,1 M NaOH worden aangepast aan 6,0, om eiwitneerslag door pH-veranderingen te voorkomen.
2. Filtreer na incubatie het gereduceerde eiwit met behulp van een filter van 0,2 μm om eiwitneerslag te verwijderen.
3. Voeg aan de nieuwe reactiebuis eerst een viervoudige molaire overmaat van MMAE toe (los MMAE op in N,N-dimethylacetamide (DMAc) om 40 mM stockoplossing te bereiden) over eiwit-SH-groepen. Voeg vervolgens een dubbel volume PBS-buffer toe in verhouding tot het volume van het Fc-eiwit. Voeg als laatste het verminderde Fc-fragment uit stap 1.2 toe.
   OPMERKING: In deze stap is de volgorde van de toevoeging van reagentia belangrijk.
4. Voer de conjugatiereactie 's nachts uit bij 15 °C met zachte rotatie. Deze milde omstandigheden voorkomen eiwitdenaturatie.
5. Filtreer de oplossing met conjugaat met behulp van een filter van 0,2 μm om mogelijke neerslag te verwijderen.
6. Voer SDS-PAGE uit om de efficiëntie van de reactie te analyseren. Gebruik 10% scheidingsgel, 10 – 250 kDa eiwitmarker en analyseer banden tussen 35 en 50 kDa (Figuur 2).
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en het reactiemengsel kan worden bewaard bij 4 °C voor korte opslag, of bij -80 °C voor langdurige opslag. Bevriezen en ontdooien kan echter extra neerslag veroorzaken en de geconjugeerde zuiveringsopbrengsten verminderen.
7. Vul het reactiemengsel op een kolom met eiwit A-geconjugeerde korrels en spoel het teveel aan MMAE af met wasbuffer 1 met 300 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0.1% Tween 20, 2 mM EDTA pH 7.4. Was de kolom vervolgens met wasbuffer 2 met 650 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄, pH 7,4.
   OPMERKING: Door selectieve interactie van het Fc-gebied van het geconjugeerde met eiwit A op de kralen, wordt het geconjugeerde op de kolom opgevangen, terwijl niet-gereageerde MMAE wordt uitgewassen. Deze stap is nodig om een zeer zuiver conjugaat te verkrijgen.
8. Elueer het Fc-MMAE-conjugaat uit de kolom met 0,1 M natriumcitraat, pH 3,5 tot 1,5 ml, buisjes met 1 M Tris pH 9,0 (1 ml eiwit tot 200 μl van 1 M Tris pH 9,0).
9. Ontzout Fc-MMAE tot PBS pH 7,4 met behulp van een kolom met Sephadex G-25 hars. Deze stap voorkomt denaturatie van het conjugaat en maakt het mogelijk om het conjugaat te gebruiken in in-vitro- en in-vivotests.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
10. Voer SDS-PAGE (10%) uit om het uiteindelijke Fc-MMAE-conjugaat te analyseren. Gebruik 10% scheidingsgel, 10 – 250 kDa eiwitmarker en analyseer banden tussen 35 en 50 kDa (Figuur 2).

2. Conjugatie van gemanipuleerde FGF2

1. Conjugatie van GGGG-MTX aan de C-terminale LPETGG-sequentie van gemanipuleerde FGF2 via sortase A-gemedieerde ligatie
   1. Breng gezuiverde gemanipuleerde FGF2 met N-terminale KCKSGG- en C-terminale LPETGG-sequentie (in deze stap gebruikt voor conjugatie) over naar de sortase A-reactiebuffer (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) met behulp van een kolom met G-25-hars. Stel de eiwitconcentratie in op 1 μM met sortase A Reaction Buffer.
   2. Voeg GGGG-MTX-peptide opgelost in DMAc rechtstreeks toe aan de eiwitoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM.
   3. Voeg sortase A toe aan een eindconcentratie van 0,1 μM en incubeer gedurende 12 uur bij 15 °C met zachte rotatie. De concentraties van de reagentia die in de stappen 2.1.1-2.1.3 moeten worden gebruikt, worden grotendeels bepaald door het te bereiken conjugaatrendement en de biochemische eigenschappen van het doeleiwit (doeltreffendheid van de eiwitzuivering, oplosbaarheid en stabiliteit). Gebruik voor een effectieve sortase A-reactie een startpunt dat tien tot honderdvoudig lager is dan de concentratie sortase A dan het LPETGG-bevattende doeleiwit en een 100 keer hogere concentratie GGGG-MTX dan het LPETGG-gelabelde eiwit.
   4. Laad het reactiemengsel op een heparinesefarosekolom.
   5. Spoel niet-gereageerde moleculen af met 25 mM HEPES pH 7,4.
   6. Elueer het product van de reactie (FGF2. MTX) met 25 mM HEPES pH 7,4 met 2 M NaCl.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
   7. Analyseer de efficiëntie van de conjugatie met behulp van SDS-PAGE. Gebruik 15% scheidingsgel, 10 – 250 kDa eiwitmarker en analyseer banden tussen 15 en 25 kDa (Figuur 3).
2. Conjugatie van MMAE aan de N-terminale KCKSGG-sequentie van gemanipuleerde FGF2 via maleimide-thiolreactie
   1. Ontzout gemanipuleerde FGF2 met N-terminale KCKSGG- en C-terminale LPETGG-sequentie naar de reactiebuffer (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM methionine, 0,1 mM EDTA) met behulp van een kolom met Sephadex G-25-hars. Stel de eiwitconcentratie in op 25 μM met de reactiebuffer.
   2. Los MMAE op in DMAc om 40 mM stockoplossing te bereiden.
   3. Voeg aan de nieuwe reactiebuis eerst een viervoudige molaire overmaat van MMAE toe ten opzichte van eiwit-SH-groepen. Voeg vervolgens een dubbel volume PBS-buffer toe in verhouding tot het volume van het FGF2-eiwit. Voeg als laatste FGF2-eiwit toe.
      OPMERKING: In deze stap is de volgorde van de toevoeging van reagentia belangrijk.
   4. Voer de reactie gedurende 1 uur uit bij 20 °C met zachte rotatie.
   5. Laad het reactiemengsel op een carboxymethyl (CM)-sepharosekolom en spoel het teveel aan het ongeconjugeerde cytotoxische middel af met 25 mM HEPES pH 7,4. Deze milde omstandigheden voorkomen eiwitdenaturatie.
   6. Elute de MMAE. FGF2 conjugeert uit de kolom met 25 mM HEPES pH 7,4 met 0,5 M NaCl.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
   7. Analyseer de efficiëntie van de conjugatie met behulp van SDS-PAGE. Gebruik 15% scheidingsgel, 10 – 250 kDa eiwitmarker en analyseer banden tussen 15 en 25 kDa (Figuur 3).
3. Bereiding van dubbele kernkopconjugaat van enginnered FGF2 met behulp van een combinatie van maleimide-thiolchemie en sortase A-gemedieerde ligatie
   OPMERKING: Voor het genereren van dubbele kernkopconjugaten van gemanipuleerde FGF2 worden de stappen 2.1 en 2.2 gecombineerd. Eerste MMAE. FGF2-conjugaat wordt geproduceerd via maleimide-thiolchemie (stap 2.2) en gebruikt voor de bevestiging van GGGG-MTX met sortase A aan de C-terminale LPETGG-tag van MMAE. FGF2 (stap 2.1). Ook is een omgekeerde procedure mogelijk (eerst sortase A-gemedieerde conjugatie, dan maleimide-thiolreactie).
   1. Gebruik de stappen 2.2.1-2.2.7 voor de bereiding van monogesubstitueerde MMAE. FGF2 conjugeren.
   2. Vervang de buffer voor de sortase A Reaction Buffer (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) met behulp van een kolom met Sephadex G-25 hars.
   3. Ga verder zoals beschreven in 2.1.2-2.1.7.

Resultaten

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee verschillende strategieën voor de conjugatie van verschillende cytotoxische geneesmiddelen tot interessante eiwitten. Bovendien wordt een combinatie van individuele strategieën getoond die het mogelijk maakt om op een plaatsspecifieke manier cytotoxische conjugaten met dubbele kernkop te genereren.

Zoals te zien is op SDS-PAGE-gels in figuur 2 (baan 2 vs. 3), maakt de maleimide-thiolr...

Discussie

Vanwege de grote belangstelling voor het ontwerp van selectieve therapieën tegen diverse kankertypes is er een dringende behoefte aan strategieën die het mogelijk maken om plaatsspecifieke hechting van verschillende ladingen aan de doeleiwitten te maken. De plaatsspecifieke modificatie van targeting-eiwitten is van cruciaal belang omdat het zorgt voor homogeniteit van ontwikkelde bioactieve conjugaten, een vereiste voor moderne therapieën. Er zijn verschillende methoden, zowel chemisch a...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CM-Sepharose kolom	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	CCF100
Heparine Sepharose kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE17-0407-01
HiTrap Desalting kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe kolom	GE Healthcare, Chicago, IL, VS	GE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, VS	HY-100374	Toxisch
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	185884
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, VS	646547