Methodenartikel

Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse

DOI:

10.3791/62062

⸱

2 februari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schatting van het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra is een belangrijke methode in preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson. Momenteel is onbevooroordeeld stereologisch tellen de standaard voor kwantificering van deze cellen, maar het blijft een moeizaam en tijdrovend proces, dat misschien niet voor alle projecten haalbaar is. Hier beschrijven we het gebruik van een beeldanalyseplatform, dat de hoeveelheid gelabelde cellen in een vooraf gedefinieerde interesseregio nauwkeurig kan schatten. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor deze analysemethode in rattenhersenen en tonen aan dat het een significante vermindering van tyrosine hydroxylase positieve neuronen kan identificeren als gevolg van expressie van mutante α-synucleïne in de substantia nigra. We hebben deze methodologie gevalideerd door te vergelijken met resultaten verkregen door onbevooroordede stereologie. Samen biedt deze methode een tijdsefficiënt en nauwkeurig proces voor het detecteren van veranderingen in het aantal dopaminerge neuronen, en is dus geschikt voor efficiënte bepaling van het effect van interventies op de celoverleving.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Parkinson (PD) is een veel voorkomende neurodegeneratieve bewegingsstoornis die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van eiwitaggregaten die α-synucleïne (α-syn) bevatten en het voorkeursverlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kwantificering van dopaminerge neuronen is een essentieel onderdeel van PD-onderzoek omdat het de evaluatie van de integriteit van het nigrostriatale systeem mogelijk maakt, waardoor het een belangrijk eindpunt is om de effectiviteit van potentiële ziekte-modificerende therapieën te beoordelen. Momenteel is de standaard voor kwantificering van celgetal onbevooroordeeld stereologisch tellen, dat tweedimensionale (2D) doorsneden van weefsel gebruikt om volumetrische kenmerken in driedimensionale (3D) structuren te schatten2,3,4. Moderne op ontwerpen gebaseerde stereologische methoden maken gebruik van uitgebreide steekproefprocedures en passen telprotocollen (bekend als sondes) toe om potentiële artefacten en systematische fouten te voorkomen, waardoor betrouwbare detectie van verschillen slechts iets groter is dan variatie tussen dieren5. Hoewel stereologie een krachtig analytisch instrument is voor in vivo histologische studies, is het tijdsintensief, veronderstelt het een uniforme monstervoorbereiding en vereist validatie in verschillende stappen, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie die steeds meer nodig is voor preklinisch translationeel onderzoek.

Recente technologische vooruitgang in de digitale wetenschap maakt het mogelijk om nieuwe toepassingen aan te nemen voor efficiëntere beoordelingen van pathologie zonder een stereomicroscoop, terwijl het een behoefte vervult als surrogaat van onbevooroordede stereologie. Deze methoden verhogen de snelheid, verminderen menselijke fouten en verbeteren de reproduceerbaarheid van stereologische technieken6,7. HALO is zo'n beeldanalyseplatform voor kwantitatieve weefselanalyse in digitale pathologie. Het bestaat uit een verscheidenheid aan verschillende modules en rapporteert morfologische en multiplexed expressiegegevens per cel over hele weefselsecties met behulp van patroonherkenningsalgoritmen. De cytonucleaire FL-module meet de immunofluorescente positiviteit van fluorescerende markers in de kern of cytoplasma. Dit maakt het mogelijk om het aantal positieve cellen voor elke markering en de intensiteitsscore voor elke cel te rapporteren. De module kan worden aangepast om individuele celgroottes en intensiteitsmetingen te bieden, hoewel deze functie niet nodig is voor kwantificering van dopaminerge neuronen.

Het doel van deze studie is deze methode te verifiëren met een eerder gevalideerd viraal vectorgebaseerd α-syn rat model van nigrale neurodegeneratie8,9,10. In dit model wordt humaan mutant A53T α-syn uitgedrukt in de SNpc door stereotactische injectie van adeno-geassocieerd virus hybride serotype 1/2 (AAV1/2), resulterend in significante neurodegeneratie over een periode van 6 weken. De contralaterale niet-geïnjecteerde SNpc kan in sommige studies dienen als een interne controle voor de geïnjecteerde kant. Vaker wordt injectie van AAV-Empty Vector (AAV-EV) in een controlecohort van dieren gebruikt als een negatieve controle. We presenteren een stapsgewijze handleiding om de dichtheid van dopaminerge neuronen te schatten die na 6 weken in de geïnjecteerde SNpc achterblijven met behulp van een geautomatiseerde beeldanalysesoftware (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door het University Health Network Animal Care Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Canadian Council on Animal Care.

1. Stereotactische injectie

  1. Paar-huis volwassen vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (250-280 g) in kooien met houten beddengoed en ad lib toegang tot voedsel en water. Houd de dierenkolonie in een regelmatige 12 uur licht/donker cyclus (lichten op 06:30) met constante temperatuur en vochtigheid.
  2. Voer unilaterale stereotactische injectie van AAV rechtstreeks uit op de SNpc aan de rechterkant van de hersenen (rechter- of linkerkant, volgens de voorkeuren van elk laboratorium) zoals eerder beschreven8,10. Injecteer 2 μL AAV1/2 bij een eindtiter van 3,4 x 1012 genomische deeltjes/ml.

2. Hersensectie en immunohistochie (IHC)

  1. Verdoof de rat met 5% isofluraan door 3 minuten in een verdovingskamer te plaatsen. Andere goedgekeurde methoden kunnen voor deze stap worden gebruikt na een passende institutionele evaluatie.
  2. Zodra de rat een chirurgisch vlak van diepe anesthesie heeft bereikt, brengt u het over op een neuskegel die stevig op een obductietafel is bevestigd. Beveilig de voorpoten van de rat met behulp van tape en gebruik de pinch-response-methode om de diepte van de anesthesie te bepalen. Het dier moet niet reageren voordat het verder gaat.
  3. Maak een laterale incisie onder het borstbeen en snijd door het middenrif over de hele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen. Til en klem het borstbeen met een hemostase en plaats boven het hoofd.
  4. Klem het hart met een tang en steek een vlindernaald die is aangesloten op een perfusiepomp in het achterste uiteinde van de linkerventrikel. Perfuseer rat transcardiaal met 150 ml gepariniseerde zoutoplossing, of totdat de ogen en huid helder zijn. Perfusie met 4% paraformaldehyde (PFA), in plaats van zoutoplossing, kan de voorkeur hebben om immunostaining met bepaalde antilichamen of dunnere hersendoorsnede te vergemakkelijken.
  5. Zodra de perfusie is voltooid, onthoofdt u met een guillotine en haalt u de hersenen naar een hersenmatrix, ventrale oppervlakte naar boven gericht.
  6. Maak met een vers scheermesje een snede in het coronale vlak 2 mm rostral naar het optische chiasme. Schuif het mes van links naar rechts om te voorkomen dat de hersenen kromtrekken tijdens het snijden.
  7. Dompel het achterste deel van de hersenen onder in een voorgelabelde flacon met ongeveer 20 ml 4% PFA gedurende 48 uur postfixatie bij kamertemperatuur. Het voorste deel van de hersenen kan worden bevroren in 2-methylbutaan gekoeld tot -42 °C vóór opslag bij -80 °C.
  8. Breng na 48 uur de vaste hersenen over naar een gelabelde flacon met 30% sacharose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze bij 4 °C totdat ze zinken (48-72 uur).
  9. Bereid een microtome door droogijs in de trog van het monsterstadium te plaatsen, gevolgd door 100% ethanol. Zodra het podium is afgekoeld, knijpt u de optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding op het podium totdat deze een cirkel van 2 cm in diameter en 0,5 cm dik vormt. Zodra het gedeeltelijk bevroren is, laat u de hersenen voorzichtig zakken op de heuvel van OCT, zodat het striatale snijoppervlak parallel blijft met het podium.
  10. Voeg meer droogijs toe aan het podium om de hersenen te helpen bevriezen. Zodra de hersenen een crèmekleur hebben veranderd, ruim je het stadium van droog ijs op.
  11. Prik een gat in de rechterkant van de hersenen met een 25G-naald om de rechter- en linkerhersenhelft te onderscheiden. Zorg ervoor dat u de naald niet door anatomische structuren van belang passeert.
  12. Snijd 40 μm secties in het coronale vlak serieel, beginnend bij bregma -3.8 en eindigend bij bregma -6.8.
  13. Bewaar zes series in gelabelde tubes met antivriesoplossing (40% PBS, 30% 2-ethoxyethanol, 30% glycerol). Elke serie moet 12 hersensecties bevatten.
  14. Selecteer één set secties voor immunohistochemische kleuring en was antivriesoplossing af met wasbeurten van 3 x 10 minuten in 0,2% PBS-T.
  15. Blokkeer gedurende 1 uur bij RT met zachte notatie in blokkerende oplossing (10% normaal geitenserum (NGS), 2% runderserumalbumine (BSA) in 0,2% PBS-T). Volg dit met incubatie met konijn anti-tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam (1:500) en muis anti-α-syn antilichaam (1:500) in 2% NGS in 0,2% PBS-T 's nachts bij kamertemperatuur.
  16. Was het primaire antilichaam af met 3 x 5 minuten wasbeurten in 0,2% PBS-T, gevolgd door 1 uur incubatie met geitenanti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:500) en geitenantimuis Alexa Fluor 555 secundair antilichaam in 2% NGS in 0,2% PBS-T. Zorg ervoor dat de secties zijn beschermd tegen licht en voorzichtig noteren.
  17. Was het secundaire antilichaam af met 3 x 5 minuten wasbeurten in 0,2% PBS-T en monteer de volledige set secties op dia's die beschermd zijn tegen licht en stof met behulp van een smalle kwast. Coverslip met fluorescentie montagemedium en afdichting met blanke nagellak.

3. Confocale microscopie en beeldverwerving

  1. Leg IHC-beelden vast met behulp van software die is gekoppeld aan een confocale microscoop met een vergroting van 10x. Open het pinhole tot 1,5 AU om een breed vlak van ~ 1,5 μm vast te leggen en de focus op de geïnjecteerde kant van de hersenen te leggen.
  2. Controleer op het tabblad Acquisitie de optie Tegelscanbeeldvorming en stel de afmetingen in op 10 x 4.
  3. Stel onder het deelvenster Acquisitiemodus de zoom in op 1.1. Dit helpt om duidelijke stiksporen tussen tegelscanafbeeldingen te voorkomen.
  4. Stel de framegrootte in op 1024 x 1024 pixels en de middeling op 2 om een hoge beeldkwaliteit te garanderen.
  5. Stel in het deelvenster Kanalen track 1 in op Alexa488 en track 2 op Alexa555.
  6. Plaats de dia op het podium en kies een sectie met sterke TH-kleuring. Klik op Live in het deelvenster Acquisitie.
  7. Stel in het deelvenster Kanalen de lasersterkte en versterking in op niveaus die het signaal maximaliseren en ruis vanaf de achtergrond beperken. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de signalen niet overbelicht zijn (zoals aangegeven door een donkerrode overlay).
  8. Herhaal de bovenstaande stap met meerdere dia's om ervoor te zorgen dat de kleuring consistent is tussen dia's, omdat de lasersterkte/versterking niet kan worden aangepast tussen dia's.
  9. Schakel op het tabblad Acquisitie het selectievakje Posities in.
  10. Op dit moment bent u klaar om te beginnen met beeldvorming. Kies met behulp van het oculair het eerste gedeelte met positieve TH-kleuring, stel de focus in op het punt van belang (d.w.z. SNpc) en verplaats het werkgebied vervolgens naar de middellijn van de sectie. Hiermee wordt de positie in de assen x, y en z opgeslagen en wordt een tegelscan weergegeven die de hele sectie vastlegt.
  11. Herhaal de bovenstaande stap voor alle secties in de SNpc en geef een complete set afbeeldingen van de SNpc. Indien een gedetailleerde analyse van de niet-geïnjecteerde zijde vereist is, moeten de stappen 3.10 tot en met 3.11 worden herhaald door de nadruk op de niet-geïnjecteerde zijde te stellen.

4. Beeldanalyse en kwantificering

  1. Afzonderlijke afbeeldingsbestanden met behulp van de juiste software en importeer afbeeldingsbestanden naar geautomatiseerde beeldanalysesoftware.
  2. Definieer een interessegebied door het gereedschap Penannotatie te selecteren om een annotatie rond de SNpc te tekenen.
    OPMERKING: In secties met een grote hoeveelheid dopaminerge neuron verlies, tijdelijk verhogen van de emittance / absorptie kan helpen om duidelijk te definiëren van de SNpc (Figuur 2).
  3. Ga naar het tabblad Analyse en selecteer real-time tuningin het vervolgkeuzemenu Analyseren. Dit opent een apart venster op de sectieafbeelding, zodat analyseparameters in realtime kunnen worden gewijzigd (figuur 3).
  4. Selecteer in de sectie Analysevergroting de juiste afbeeldingszoom.
  5. Selecteer onder de sectie Celdetectie nucleaire kleurstof als de kleurstof die wordt gebruikt voor TH-kleuring (Alexa Fluor 488).
  6. Pas de nucleaire contrastdrempel, minimale nucleaire intensiteit, nucleaire segmentatieagressiviteiten nucleaire grootte-instellingen aan terwijl u het real-time tuningvenster zorgvuldig bekijkt.
    OPMERKING: Een nauwkeurige weergave van elke afzonderlijke cel als één cel in het real-time tuningvenster is van vitaal belang voor de nauwkeurigheid. Deze instellingen zijn op willekeurige schaal, afhankelijk van de gebruikte software, maar de juiste aanpassing is nodig om de software in staat te stellen nauwkeurig onderscheid te maken tussen afzonderlijke cellen en tussen cellen en de achtergrond (figuur 3).
  7. Herhaal dit proces met minimaal 10 afzonderlijke monsters om een uniforme overeenstemming te garanderen van wat een cel over verschillende secties vormt.
    OPMERKING: Extra celmarkeringen (zoals α-syn of NeuN) kunnen binnen hetzelfde analyseplatform worden geïdentificeerd met behulp van de secties Marker 1 of Marker 2 op het analysetabblad.
  8. Zodra een passend aantal afbeeldingen is gesampled en Real-Time Tuning dienovereenkomstig is aangepast, slaat u de analyse-instellingen op in het vervolgkeuzemenu Instellingenacties.
  9. Selecteer alle te analyseren afbeeldingen en klik op Analyseren.
  10. Kies de analyse-instelling die u zojuist hebt opgeslagen en vink in het venster Analysegebied het selectievakje Annotatielaag(en) aan. Controleer vervolgens Laag 1 en klik op Analyseren.
    OPMERKING: Voor een enkel brein duurt de analyse meestal ongeveer 5 minuten. Het voltooide resultaat toont duidelijk elk item dat als cel is geteld (figuur 4).
  11. Als u klaar bent, exporteert u de overzichtsanalysegegevens voor alle secties. Er is een optie om objectanalysegegevenste exporteren, die gedetailleerde gegevens geven, waaronder de celgrootte van elke gedetecteerde afzonderlijke cel. Deze dataset kan worden gebruikt om veranderingen in celgrootte te onderzoeken als reactie op een toxine/therapeutisch middel.
  12. Voeg de totale cellen van elke geanalyseerde sectie per dier en het totale geanalyseerde gebied (mm2 ) toe. Deel het totale aantal cellen door het totale geanalyseerde gebied om het aantal cellen/mm2 in de SNpc voor elke rat te berekenen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de bovenstaande methoden toe te passen op hersenweefsel dat 6 weken na AAV-injecties is verzameld, hebben we aangetoond dat stereotactische injectie van AAV-expresserende mutant A53T α-syn (AAV-A53T) in de SNpc van rattenhersenen resulteert in een significante vermindering van de dichtheid van dopaminerge neuronen in vergelijking met injectie van lege vector AAV (AAV-EV) als controle (Figuur 5A, B). Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen/mm2 in de SNpc v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De betrouwbare beoordeling van de integriteit van het dopaminerge systeem in preklinische modellen van PD is van cruciaal belang om de effectiviteit van potentiële ziektemodificerende therapieën te bepalen. Daarom is het belangrijk om potentiële verwarringen te beheersen en te minimaliseren die de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histopathologische gegevens kunnen verminderen. Zorgvuldige kwantitatieve uitkomsten kunnen meer informatie opleveren dan alleen kwalitatieve of semi-kwantitatieve beschrijvingen. Tege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs rapporteren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen alle medewerkers van de Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) van het University Health Network bedanken voor hun tijd en hulp bij het ontwikkelen van dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A-Syn AntilichaamThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 secundair antilichaamThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 secundair antilichaamThermoFisher ScientificA-28180
Alkaline fosfatase-geconjugeerd anti-konijn igGJackson Immuno111-055-144
Gebiotinileerd anti-muis IgGVector LabsBA-9200
Rund Serum AlbumineSigmaA2153
DAKO fluorescerend montagemediumAgilentS3023
HALO™Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB Peroxidase substraatVector LabsSK-4105
LSM880 Confocal MicroscoopZeiss
NeuN AntilichaamMilliporeMAB377
Normaal Geiten SerumVector LabsS-1000-20
OCTTissue-Tek
ParaformaldehydeBioShopPAR070.1
Schuif microtoomLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SucroseBioShopSUC700
TH AntilichaamThermoFisher ScientificP21962
VectaMount montagemediumVector LabsH-5000
Vector Blue Alkaline Fosfatase substraatVector LabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen Blue SoftwareZeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  3. Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  4. Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).
  5. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  6. Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
  7. Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).
  8. Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).
  9. Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698(2011).
  10. McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).
  11. Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
  12. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).
  13. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Parkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

Gerelateerde artikelen