Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62129

⸱

3 maart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.

Samenvatting

Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (PSC-CMs) kunnen worden geproduceerd uit zowel embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellen (ES/iPS). Deze cellen bieden veelbelovende bronnen voor het modelleren van hartaandoeningen. Voor cardiomyopathieën is sarcomere verkorting een van de standaard fysiologische beoordelingen die worden gebruikt met volwassen cardiomyocyten om hun ziektefenotypes te onderzoeken. De beschikbare methoden zijn echter niet geschikt om de contractiliteit van PSC-CMs te beoordelen, aangezien deze cellen onderontwikkelde sarcomen hebben die onzichtbaar zijn onder fasecontrastmicroscopie. Om dit probleem aan te pakken en sarcomere verkorting uit te voeren met PSC-CMs, werden fluorescerende sarcomere-eiwitten en fluorescerende live-imaging gebruikt. Dunne Z-lijnen en een M-lijn bevinden zich aan beide uiteinden en het midden van een sarcomere, respectievelijk. Z-line eiwitten — α-Actinine (ACTN2), Telethonine (TCAP) en actine-geassocieerd LIM eiwit (PDLIM3) — en één M-lijn eiwit — Myomesin-2 (Myom2) — werden getagd met fluorescerende eiwitten. Deze gelabelde eiwitten kunnen worden uitgedrukt uit endogene allelen als knock-ins of uit adeno-geassocieerde virussen (AAV's). Hier introduceren we de methoden om muis- en menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in cardiomyocyten, om AAV's te produceren en om live-imaging uit te voeren en te analyseren. We beschrijven ook de methoden voor het produceren van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels voor een patrooncultuur van PSC-CMs, wat de analyse van sarcomere verkorting met fluorescerende eiwitten vergemakkelijkt. Om de verkorting van sarcomen te beoordelen, werden time-lapse beelden van de kloppende cellen geregistreerd bij een hoge framerate (50-100 frames per seconde) onder elektrische stimulatie (0,5-1 Hz). Om de lengte van sarcomen in de loop van de celcontractie te analyseren, werden de opgenomen time-lapse-beelden onderworpen aan SarcOptiM, een plug-in voor ImageJ / Fiji. Onze strategie biedt een eenvoudig platform voor het onderzoeken van fenotypes van hartaandoeningen in PSC-CMs.

Inleiding

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak vanmortaliteit 1 en cardiomyopathie is de derde oorzaak van hartgerelateerde sterfgevallen2. Cardiomyopathie is een collectieve groep ziekten die hartspieren aantasten. De recente ontwikkelingen van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) en de gerichte differentiatie van iPS-cellen naar cardiomyocyten (PSC-CMs) hebben de deur geopend voor het bestuderen van cardiomyocyten met het genoom van de patiënt als een in vitro model van cardiomyopathie. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de pathofysiologie van hartziekten te begrijpen, om hun moleculaire mechanismen op te helderen en om verschillende therapeutische kandidaten te testen3. Er is een enorme hoeveelheid interesse, dus patiënt-afgeleide iPS-cellen zijn gegenereerd (bijv. hypertrofische cardiomyopathie [HCM]4,5,aritmogene rechterventrikel cardiomyopathie [ARVC]6, verwijde cardiomyopathie [DCM]7, en mitochondriale-gerelateerde cardiomyopathieën8,9). Omdat een van de kenmerken van cardiomyopathie de disfunctie en verstoring van sarcomen is, is een geldig hulpmiddel nodig dat de sarcomerefunctie uniform meet.

Sarcomere verkorting is de meest gebruikte techniek om de sarcomerefunctie en de contractiliteit van volwassen cardiomyocyten afgeleid van diermodellen en mensen te beoordelen. Om sarcomere verkorting uit te voeren, zijn goed ontwikkelde sarcomen nodig die zichtbaar zijn onder fasecontrast. Psc-CMs gekweekt in vitro display onderontwikkelde en ongeorganiseerde sarcomen en, daarom, zijn niet in staat om te worden gebruikt om goed te meten sarcomere verkorting10. Deze moeilijkheid om de contractiliteit van PSC-CMs goed te beoordelen, belemmert het gebruik ervan als platform om cardiale functies in vitrote beoordelen . Om de contractiliteit van PSC-CMs indirect te beoordelen, zijn atoomkrachtmicroscopie, micro-postarrays, tractiekrachtmicroscopie en impedantiemetingen gebruikt om de effecten van de beweging die door deze cellen op hun omgeving wordt uitgeoefend te meten11,12,13. Meer geavanceerde en minder invasieve videomicroscopie-opnamen van daadwerkelijke cellulaire beweging (bijv. SI8000 van SONY) kunnen worden gebruikt om hun contractiliteit als alternatief te beoordelen, maar deze methode meet niet direct sarcomerebeweging of krachtgeneratiekinetiek14.

Om de beweging van sarcomen in PSC-CMs direct te meten, ontstaan nieuwe benaderingen, zoals fluorescerende tagging voor sarcomere-eiwitten. Lifeact wordt bijvoorbeeld gebruikt om filamenteuze actine (F-actine) te labelen om sarcomerebeweging15,16te meten . Genetisch gemodificeerde iPS-cellen zijn een andere optie voor het taggen van sarcomere-eiwitten (bijv. α-actinine [ACTN2] en Myomesin-2 [MYOM2]) door fluorescerend eiwit17,18,19.

In dit artikel beschrijven we hoe u time-lapse beeldvorming kunt uitvoeren voor het meten van sarcomere verkorting met behulp van Myom2-TagRFP (muis embryonale stam [ES] cellen) en ACTN2-mCherry (menselijke iPS-cellen). We laten ook zien dat een patrooncultuur de uitlijning van sarcomere vergemakkelijkt. Daarnaast beschrijven we een alternatieve methode van sarcomere-etikettering, met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV's), die op grote schaal kunnen worden toegepast op iPS-cellen die van de patiënt zijn afgeleid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Differentiatie van pluripotente stamcellen van muizen

  1. Onderhoud van muis ES cellen
    1. Onderhoudsmedium: Meng 50 ml foetale runderserum (FBS), 5 ml L-alanine-L-glutamine, 5 ml niet-essentieel aminozuur (NEAA), 5 ml 100 ml natriumpyrolaat en 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol met 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Supplement Leukemie remmende factor (LIF), CHIR-99021 en PD0325901 bij een eindconcentratie van respectievelijk 1000 U/ml, 1 μM en 3 μM. Steriliseer het medium via een filter van 0,22 μm.
    2. FBS-medium: Meng 55 ml FBS, 5,5 ml L-alanine-L-glutamine, 5,5 ml natriumpy pyruvaat en 5,5 ml NEAA tot 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose. Filtraat het medium door een filter van 0,22 μm om te steriliseren.
    3. Cultuur SMM18 muis ES cellen waarin TagRFP werd geslagen in de Myom2 locus op een gelatinized 6 cm schotel in onderhoudsmedium zoals eerder beschreven18. Passage om de 2-3 dagen.
  2. Bereiding van serumvrije differentiatie (SFD) medium
    1. Basale SFD: Meng 250 ml Ham's F-12, 750 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml B27-supplement minus vitamine A, 5 ml N2-supplement, 10 ml L-alanine-L-glutamine, 5 ml 10% runderserumalbumine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filtreer door een zeef van 0,22 μm om te steriliseren.
    2. Los ascorbinezuur op bij 5 mg/ml in gedestilleerd water en filtreer door een zeef van 0,22 μm om te steriliseren.
    3. Verdun 13 μL 1-Thioglycerol tot 1 ml IMDM. Verwijs hierin naar deze verdunde 1-Thioglycerol als MTG.
    4. Voeg 10 μL ascorbinezuur (5 mg/ml) en 3 μL MTG toe aan 1 ml basale SFD op de dag van gebruik. Raadpleeg dit mengsel hier als volledige SFD.
  3. Dag 0, embryonale lichaamsvorming (EB) voor differentiatie
    1. Oogst SMM18 muis ES cellen met een recombinant trypsine-achtige protease (rTrypsin) en tel de cellen.
    2. Centrifugeer 5 x 105 cellen bij 300 x g gedurende 3 min in 4 °C, resuspend in 10 ml volledige SFD en zaai in een petrischaal van 10 cm. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 50 uur.
  4. Differentiatie dag 2
    1. Voeg Activine A, humane vasculaire endotheelgroeifactor (hVEGF) en botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4) toe om SFD te voltooien bij een eindconcentratie van respectievelijk 5 ng/ml, 5 ng/ml en 1,9 ng/ml.
      OPMERKING: BMP4-concentraties kunnen verschillen, afhankelijk van de partij BMP4. Test verschillende concentraties in een kleinschalige studie voordat u een nieuwe partij gebruikt en bepaal de beste concentratie voor hartdifferentiatie.
    2. Breng EBs van een petrischaal over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 50-100 x g.
    3. Voeg ondertussen het medium dat in stap 1.4.1 is bereid toe aan de Petrischaal om te beschermen dat de resterende EBs droog zijn.
    4. Aspireer het supernatant uit de 15 ml buis, resuspendeer de EBs met het medium in de Petrischaal en breng de EB-oplossing terug naar de schaal. Cultiveer vervolgens de EBs bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 46 uur.
  5. Differentiatie dag 4
    1. Gelatiniseer een met weefselkweek behandelde schaal van 10 cm met 5 tot 10 ml 0,1% gelatine gedurende ten minste 5 minuten. Aspireer gelatine vlak voor het zaaien van cellen.
    2. Bereid medium voor: Meng de basisgroeifactor voor fibroblasten (bFGF), FGF10 en hVEGF om SFD te voltooien bij respectievelijk 5 ng/ml, 25 ng/ml en 5 ng/ml eindconcentraties. Voor een schaal van 10 cm, bereid 10 ml.
    3. Breng cellen van de Petrischaal over naar een buis van 15 ml. Voeg 5 ml PBS toe aan de petrischaal, was meerdere keren en breng over naar de buis van 15 ml om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer bij 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspireer supernatant, voeg 1 ml rTrypsin toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C.
    5. Vortex kort om EBs te dissocieren, voeg 9 ml 10% FBS medium, vortex opnieuw toe en tel de cellen.
    6. Centrifugeer 1,5 x 107 cellen bij 300 x g, 4 °C gedurende 3 minuten, resuspend met de media bereid in stap 1.4.2 en zaai in de gelatineschaal. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 dagen.
      OPMERKING: Op dag 7 of 8 kan een uitgebreide pak slaag van PSC-CMs worden waargenomen.
  6. Geneesmiddelenselectie op differentiatiedagen 7 en 9: Voer de media opnieuw met puromycine (2 μg/ml bij de uiteindelijke concentratie) om niet-cardiomyocyten op dag 7 en 9 van differentiatie te elimineren.
    OPMERKING: Ouderlijke lijn van SMM18 is syNP4 muis ES cellen, herbergen NCX1 promotor-gedreven puromycine-resistent gen20.
  7. Dag 10, replate voor toekomstige experimenten
    1. Bekleed een kweekplaat met glazen bodem of een beeldvormingsschaal van 35 mm met een polymeerafdekkingslip met 0,1% gelatine. Om de rijping te verbeteren, bedek de gerechten met laminine-511 E8 fragment (LN511-E8) op 1 μg/cm2 gedurende 30-60 min bijkamertemperatuur 18. Om PSC-CMs in specifieke interessepatronen te gekweekt, raadpleegt u stap 4 en 5 voor het bereiden van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels.
    2. Om SMM18 PSC-CMs te oogsten, wast u de schaal tweemaal met PBS, breng u 1 ml rTrypsine aan en incubeert u 3 minuten bij 37 °C.
    3. Verzamel cellen in 9 ml van 10% FBS-medium, s hang op en tel de cellen. Plaats de cellen op 50.000-100.000 cellen in één put van een 24-put plaat of 250.000-500.000 cellen in een 35 mm beeldvormingsschaal.
    4. Centrifugeer een voldoende aantal cellen (300 x g, 3 min) en resuspend de cellen met volledige SFD aangevuld met FBS (eindconcentratie bij 10%).
    5. Incubeer 's nachts en verander het cultuurmedium om SFD met puromycine te voltooien.
    6. Verander vanaf dag 14 het cultuurmedium twee tot drie keer per week met volledige SFD tot dag 21-28, wanneer Myom2-RFP prominent wordt. Voor AAV-gebaseerde transductie van fluorescerende sarcomere-eiwitten, zie stap 3.

2. Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

  1. Voorbereiding van differentiatiemedia
    1. RPMI+B27-Ins: meng 500 ml RPMI 1640 medium, 10 ml B27 minus insuline en 5,25 ml L-alanine-L-glutamine.
    2. RPMI+B27+Ins: meng 500 ml RPMI, 10 ml B27-supplement en 5,25 ml L-alanine-L-glutamine.
  2. Onderhoud van menselijke iPS-cellen
    1. Passage menselijke iPS cellen twee keer per week met AK02N op LN511-E8 volgens eerder gepubliceerde methode met enkele wijzigingen21.
    2. Oogst cellen met een behandeling van 3 minuten rTrypsin en verzamel in 10% FBS-medium. Tel cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Zaai 75.000-125.000 cellen in één put van 6 putplaat met 2 ml AK02N aangevuld met RESPECTIEVELIJK LN511-E8 en Y27632 bij de eindconcentratie van respectievelijk 0,5 μg/ml (0,1 μg/cm2)en 10 μM.
    3. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 en vervang het medium de volgende dag door 2 ml AK02N zonder supplement. Verander media om de twee tot drie dagen en passage om de drie tot vier dagen.
  3. Dag -4: herplaat voorafgaand aan differentiatie
    1. Bekleed een 6 putplaat met 0,5 μg/cm2 LN511-E8 verdund in PBS. Incubeer vervolgens gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 of 1 uur bij kamertemperatuur. Aspirate coating oplossing vlak voor het zaaien van cellen.
    2. Oogst menselijke iPS-cellen met rTrypsin en tel cellen zoals in stap 2.2.2.
    3. Centrifugeer 1,25 x10 5 cellen voor een put van een 6-putplaat bij 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C en resuspend in 2 ml AK02N aangevuld met LN511-E8 (eindconcentratie 0,5 μg/ml of 0,1 μg/cm2) en Y27632 (eindconcentratie 10 μg/ cm).
    4. Aspiraat coating oplossing, zaad geresuspendeerde cellen in de gecoate plaat, en incuberen bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Dagen -3 en -1: vervang medium door 2 ml AK02N.
  5. Dag 0: Vervang medium door 2 ml RPMI+B27-Ins aangevuld met CHIR99021 (eindconcentratie 6 μM) per put om differentiatie te starten.
  6. Dag 2: Vervang medium door 2 ml RPMI+B27-Ins door WntC59 (eindconcentratie 2 μM) per put.
  7. Dag 4: Vervang medium door 2 ml RPMI+B27-Ins per put.
  8. Dag 7 en dag 9: vervang medium door 2 ml RPMI+B27+Ins door puromycine (eindconcentratie 10 μg/ml) per put om PSC-CMs selectief te kweeken.
    OPMERKING: ACTN2-mCherry lijn, gebruikt in deze studie, heeft een cassette van interne ribosomale entry site (IRES), puromycine-resistent gen ingevoegd in de 3′-onvertaalde regio (UTR) van TNNT2 locus, en mCherry ter vervanging van de stop codon van ACTN2. Raadpleeg stap 3 en 4 om cardiomyocyt te zuiveren zonder aan te kloppen.
  9. Dag 10: replate voor toekomstige experimenten
    1. Bekleed een beeldvormingsschaal van 35 mm met een polymeerafdekkingslip met 0,5-1 μg/cm2 LN511-E8 verdund in 0,1% gelatine. Incubeer 2-4 uur bij kamertemperatuur voor levensvatbaarheid op lange termijn. Raadpleeg stap 4 en 5 voor het voorbereiden van PDMS-stempels om PSC-CMs in gewenste patronen te culteren.
    2. Om menselijke PSC-CMs te oogsten, wast u de schaal tweemaal met PBS, breng u 1 ml rTrypsine per put aan en incubeert u 3 minuten bij 37 °C.
    3. Verzamel cellen in 4 ml van 10% FBS-medium, s hang op en tel de cellen. Plaat 250.000-500.000 cellen per 35 mm beeldschaal.
    4. Centrifugeer een voldoende aantal cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, resuspend met RPMI+B27+Ins met puromycine (10 μg/ml) en plaat op de gecoate beeldvormingsschaal van 35 mm.
    5. Incubeer 's nachts. Vervang de volgende ochtend het kweekmedium door RPMI+B27+Ins door puromycine (10 μg/ml).
    6. Verander vanaf dag 14 2-3 keer per week van cultuurmedium met RPMI+B27+Ins tot dag 21-28 voor beeldvorming. Voor AAV-gebaseerde transductie van fluorescerende sarcomere-eiwitten, zie stap 3.

3. Fluorescerende etikettering van sarcomen met behulp van adeno-geassocieerde virussen

  1. Voorbereiding voor AAV-productie
    1. Behoud HEK293T cellen in DMEM aangevuld met FBS (eindconcentratie 10%) op een 10 cm weefselkweekplaat. Passagecellen drie keer per week.
    2. Bereid polyethyleenimine (PEI) voor bij 1 mg/ml. Meng 50 mg polyethyleenimine MAX 40000 en 40 ml ultrapure water. Stel de pH in op 7,0 met 1 N NaOH. Maak vervolgens het uiteindelijke volume tot 50 ml met ultrapure water en filtreer door een zeef van 0,22 μm.
    3. Bereid een shuttlevector voor met een sarcomere-labelgen (bijv. TCAP of PDLIM3 gefuseerd met een groen fluorescerend eiwit [GFP]), aangedreven door een cardiomyocytspecifieke promotor, zoals cardiale troponine T (cTNT)22.
      OPMERKING: In dit geval gebruikten we monomere verbeterde GFP met mutaties van V163A, S202T, L221V23.
  2. Dag 0, passage HEK cellen
    1. Wanneer cellen samenvloeien, passage 2,0 x 107 HEK293T cellen naar een 15 cm weefselkweekplaat met 20 ml DMEM met 10% FBS.
  3. Dag 1, transfectie
    1. Meng 13,5 μg van de shuttlevector, 26 μg pHelper (een vectorcodering E2A, E4 en VA van adenovirus), 16,5 μg pRC6 (een vectorcoderende AAV2 Rep- en AAV6 Cap-genen) en 1 ml DMEM zonder natriumpy pyruvaat (DMEM-Pyr).
    2. Meng 224 μL PEI (1 mg/ml, bereid in stap 3.1.2) en 776 μL DMEM-Pyr.
    3. Meng en incubeer de plasmideoplossing en de PEI-oplossing gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
    4. Voeg de plasmide/PEI-oplossing toe aan de HEK293T-cellen die in stap 3.2 zijn bereid.
  4. Dag 2, medium verandering
    1. Verander na 24 uur na transfectie van medium naar DMEM-Pyr. Kweekcellen tot het oogsten van AAV op dag 7. AAV wordt vrijgegeven in de cultuurmedia.
  5. Dag 7, AAV-inzameling, concentratie en buffersubstitutie met minimale zuiveringsmethode24
    1. Incubeer een centrifugale ultrafiltratie-eenheid (100k moleculaire gewichtsafsnijding [MWCO]) met 5 ml 1% BSA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de ultrafiltratie-eenheid gedurende 2 minuten op 500 x g en aspireer zowel gefilterde als resterende oplossingen.
    2. Breng het medium van de 15 cm schotel die AAV produceerde over naar een nieuwe 50 ml conische buis en centrifuge (500 x g, 5 min). Filtreer het supernatant door een spuitzeef van 0,45 μm om celresten te verwijderen en suspensie op de ultrafiltratie-eenheid aan te brengen.
    3. Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 90 min of tot het concentreren van de kweeksupernatant 0,5 tot 1 ml.
    4. Aspireer het filtraat en breng 15 ml PBS aan op de ultrafiltratie-eenheid.
    5. Herhaal de centrifugeer tot het concentraat 0,5-1 ml wordt.
    6. Herhaal 3.5.4 en 3.5.5.
    7. Breng geconcentreerde AAV over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en bewaar deze bij 4 °C of -20 °C.
      OPMERKING: AAV kan worden gebruikt in P1-faciliteiten, maar volg de lokale regels en voorschriften. AAV kan ook op conventionele wijze worden geproduceerd.
  6. Berekening van AAV titer
    1. Meng 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr en 10 U benzonase en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Voeg 200 μL proteïnase K-buffer (0,02 M Tris HCl en 1% SDS) en 5 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
    3. Bereid zorgvuldig 400 μL van een 25:24:1 Fenol/chloroform/isoamyl alcoholoplossing, vortex gedurende 1 min, en centrifugeer op 20.000 x g gedurende 1 min.
    4. Breng 200 μL van de waterfase over naar een nieuwe buis van 1,5 ml, die ongeveer de helft van de oorspronkelijke AAV-genomen zal opleveren.
    5. Voeg 1 μL glycogeen (20 mg/ml) toe aan 20 μL van 3 M CH3COONa (pH 5,2) en vortex. Voeg opnieuw 250 μL 2-Propanol toe aan 100 μL 100% ethanol en vortex.
    6. Incubeer bij -80 °C gedurende 15 min. Centrifugeer vervolgens bij 20.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
    7. Aspireer supernatant en voeg 70% ethanol toe aan de tube. Centrifugeer vervolgens bij 20.000 x g, 4 °C gedurende 5 min.
    8. Aspireer supernatant en droog aan de lucht tot de pellet helder wordt.
    9. Voeg 200 μL Tris-Ethyleendiaminetetraazijnzuur (TE; pH 8,0) toe om de AAV-genomen op te lossen. Verdun het monster vervolgens 100 keer met TE.
    10. Bereid een standaard voor met pAAV-CMV-Vector bij 6,5 ng/μL met TE om 109 vectorgenomen (vg)/μL te verkrijgen. Maak vervolgens een reeks 10-voudige verdunning van 104 tot 108 met TE.
    11. Meng 1 μL monster-DNA (of de standaarden), 0,4 μL primers (5 μM), 3,6 μL gedestilleerd water en 5 μL SYBR Green mastermix. Primers, gelegen op ITR, zijn 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ en 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Voer real-time PCR uit met de volgende voorwaarde: Initiële denature bij 95 °C gedurende 60 s, 40 cycli van denaturering bij 95 °C gedurende 15 s, en gloeien en verlengen bij 60 °C gedurende 30 s, gevolgd door smeltcurve.
    13. Op basis van de normen en Ct-waarden levert een real-time PCR-machine het kopieernummer van het vectorgenoom in 1 μL van een monster. Bereken de oorspronkelijke AAV-titer met behulp van de volgende vergelijking: een kopienummer geleverd door real-time PCR (vg/μL) x 8 x 103 x 2, waarbij 8 x 103 als verdunningsfactor tijdens AAV-genoomisolatie, en 2 als de verschilfactor van AAV (enkele streng) en plasmide (dubbele streng).
  7. Transductie naar PSC-CMs
    1. Tel PSC-CMs in een extra put of extra schotel.
    2. Verdun AAV's (1 x 104 tot 1 x 106 vg/cel) om 50 μL met PBS te maken. Pas AAV's toe bij de multipliciteit van infectie (MOI) van 1 x 104 tot 1 x10 6 vg/cel op PSC-CMs en kweek PSC-CMs gedurende 3 dagen met AAV in de overeenkomstige differentiatiemedia voor muis- en menselijke PSC-CMs en verander vervolgens media in cultuurmedium zonder AAV.
    3. Gebruik PSC-CMs voor live-cell imaging na 7 dagen of meer na transductie.

4. [Facultatief] Zuivering op basis van AAV van PSC-CMs

  1. Voorbereiding van AAV
    1. Bereid AAV voor zoals beschreven in stap 3 met behulp van een shuttlevector die blasticidin-resistent gen uitdrukt onder controle van de cTNT-promotor.
  2. Transductie naar differentiërende iPS-cellen
    1. Differentieer menselijke iPS-cellen gedurende 4 dagen volgens het protocol beschreven in stap 2 en tel het aantal cellen in een extra put.
    2. Nadat u op dag 4 van medium bent veranderd, past u AAV's toe op de MOI van 1 x10 5 vg/cel op het onderscheiden van PSC's in RPMI+B27-Ins media.
    3. Ververs op dag 7 het medium met RPMI+B27+Ins en voeg 2,5-10 μg/ml blasticidin toe.
    4. Op dag 10 staan PSC-CMs klaar om opnieuw te worden geplateeerd.

5. Voorbereiding van PDMS-stempels

  1. Ontwerp het apparaatpatroon van stroken van 200 μm samen met 10-25 μm groeven tussen de strips met behulp van een CAD-tekensoftware (Computer Aided Design).
  2. Teken het patroon van apparaten op een chroomfotomasker bedekt met AZP1350 met behulp van UV-licht van een maskerloze lithografietool.
  3. Ontwikkel het patroon op het fotomasker in een reeks positieve fotoresistente ontwikkelaars (bijv. chroom enz.) en spoel af met DI-water.
  4. Dehydrateer een siliconen wafeltje op een hete plaat bij 120 °C gedurende 15 min.
  5. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur en draai een negatieve fotoresist SU-8 3010 om een hoogte van 10-20 μm te maken met 1500 tpm gedurende 30 s met behulp van een spin-coater.
  6. Bak de wafel in twee stappen zacht op een hete plaat volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Nadat de wafer is afgekoeld tot kamertemperatuur, laadt u de wafer op de maskeruitlijner.
  8. Gebruik een maskeruitlijner om het masker op de wafer uit te lijnen en de wafer bloot te stellen aan UV-licht.
  9. Voer de bak na blootstelling in twee stappen uit op de wafer op een kookplaat volgens het protocol van de fabrikant.
  10. Ontwikkel de wafer in een reeks SU-8 developer en 2-Propanol en droog de wafer vervolgens met een stikstofstroom.
  11. Doe het wafeltje in een Petrischaaltje van een geschikte maat.
  12. Meng PDMS-elastomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 w/w en giet het mengsel in de Petrischaal.
  13. Ontlucht het PDMS in een desiccator totdat alle luchtbellen verdwijnen en hard PDMS vervolgens uit op een kookplaat bij 80 °C gedurende 2 uur.
  14. Verwijder de uitgeharde PDMS van de hoofdmal met behulp van een pincet en knip vervolgens het gedeelte met het ontwerp uit om een PDMS-stempel te zijn.
    OPMERKING: Vorm kan vierkant zijn, maar een achthoekige vorm brengt het patroon beter over aan de rand.

6. Patrooncultuur van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

  1. Verwijder stof van het oppervlak van PDMS-stempels met behulp van hersteltape.
  2. Dompel de stempels onder in 70% ethanol om te steriliseren. Blaas vervolgens ethanol van het oppervlak van de stempels met behulp van een luchtdoek.
  3. Breng 5-10 μL 0,5 wt% 2-methacryloyloxyethylfosforylcholine (MPC) polymeer/ethanol aan op het oppervlak van PDMS-stempels.
    OPMERKING: Ongelijke verdeling van MPC-polymeer kan een verstoord patroon veroorzaken.
  4. Incubeer 10-30 min tot MPC polymeer volledig gedroogd is.
  5. Plaats de stempels in contact met afdekplaten van een kweekplaat met glazen bodem of een beeldplaat van 35 mm met een polymeerafdekkingslip en leg een gewicht (bijv. een AAA-batterij) gedurende 10 minuten op de stempel.
  6. Verwijder het gewicht en de stempels. Bevestig vervolgens dat het patroon onder de microscoop is overgebracht.
    OPMERKING: Gestempelde borden/borden kunnen tot 1 week bij kamertemperatuur worden bewaard.
  7. Was de gestempelde putten/schalen twee keer met PBS.
  8. Verdun LN511-E8 met PBS bij 2-4 μg/ml en bedek de schaal met LN511-E8 op 0,5-1 μg/cm2. Verdun LN511-E8 voor menselijke PSC-CMs met 0,1% gelatineoplossing in plaats van PBS. Incubeer vervolgens gedurende ten minste 1 uur (optimaal, meer dan 4 uur).
  9. Plaatcellen zoals beschreven in de vorige secties.

7. Time-lapse beeldvorming van sarcomen onder fluorescerende microscoop

  1. Schakel de microscoop, de bijbehorende computer en alle vereiste randapparatuur in en sluit deze aan.
  2. Om timelapse-beeldvorming uit te voeren, legt u timelapse-beelden vast met de hoogste vergroting (100X objectieve lens met olie-emersion).
  3. Selecteer livebeeldomstandigheden. Om goede representatieve gegevens te verkrijgen, probeert u zich aan te passen aan de hoogste framerate (minimaal 20 ms of 50 frames per seconde wordt aanbevolen). Stel de sluiter open en breng een noodzakelijke binning (4 X 4) en een crop van het acquisitiegebied aan om de kortste intervallen tussen afbeeldingen te bereiken tijdens de time-lapse-beeldvorming.
    OPMERKING: De instelling kan variëren afhankelijk van de configuraties van microscopen. De camera moet zeer gevoelig zijn en kan de gegevens snel genoeg overbrengen naar de aangesloten pc. Hiervoor hebben we ORCA-flitser gebruikt met Camera-link. We hebben een draaiende confocale microscopie getest en hebben beelden verkregen met 400 frames per seconde.
    1. [Optioneel] Als de klopsnelheid van de cellen laag is, roep de cellen dan op door elektrische veldstimulatie.
  4. De timelapse-record uitvoeren
    1. Zorg ervoor dat de afgebeelde velden scherp blijven tijdens het opnemen van de time-lapse-afbeelding.
    2. Sla de timelapse-afbeeldingen op in een geschikte map.

8. Analyse van time-lapse imaging met behulp van SarcOptiM, een ImageJ/Fiji plugin

  1. Laad een reeks timelapse-afbeeldingen in ImageJ. Voor Olympus VSI-formaat opent u bestanden via olympusviewer plugin.
  2. Pas de helderheid en het contrast van het beeld aan om het sarcomerepatroon duidelijk te observeren(Afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast).
  3. Open SarcOptiM door op Meer gereedschapsmenu (>>) te klikken en SarcOptiMte selecteren.
  4. Kalibreer het programma door op Ctrl + Shift + P en de 1 μm-knop op de werkbalk te drukken en de instructies van de dialoogvensters te volgen.
  5. Teken een lijn over het gebied van de sarcomere die zal worden gebruikt om de sarcomere verkorting te meten.
  6. Start de sarcomere verkortingsanalyse door op SingleCell (AVI) op de werkbalk te drukken. Representatieve gegevens zijn weergegeven in figuur 1 en figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het meten van sarcomere verkorting met behulp van knock-in PSC-CMs reporter lijnen. Psc-CMs met sarcomere-label werden gebruikt om de verkorting van sarcomen te meten. De lijnen drukken Myom2-RFP en ACTN2-mCherry uit van endogene loci. TagRFP werd ingevoegd in Myom2, codeert M-eiwitten die lokaliseren naar de M-lijn, terwijl mCherry werd ingeslagen in ACTN2, codering α-Actinine, die lokaliseert naar de Z-lijn18,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

PSC-CMs hebben een groot potentieel om te worden gebruikt als een in vitro platform om hartaandoeningen te modelleren en de effecten van geneesmiddelen te testen. Niettemin moet eerst een nauwkeurige, uniforme methode worden vastgesteld om de functies van PSC-CMs te beoordelen. De meeste functionele tests werken met PSC-CMs, bijvoorbeeld elektrofysiologie, calcium transiënt en metabolisme26, en een van de eerste patiënt-afgeleide PSC-CM studies ging over long-QT syndroom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

H.U. heeft een patent aangevraagd met betrekking tot dit manuscript.

Dankbetuigingen

We willen graag alle lableden van de afdeling Regeneratieve Geneeskunde van de Jichi Medical University erkennen voor de nuttige discussie en technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door de subsidies van het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 en JP20bm0804018), de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), en de Japanese Circulation Society (de Grant for Basic Research) aan H.U.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-mm imaging dish met een polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, hoog)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectoren; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.V.We hebben IRES-puromycine-resistente cassette ingebracht in 3' UTR van TNNT2-locus en mCherry rond het stopcodon van ACTN2 in 610B1 hiPSC-lijn, volgens een methode die elders wordt beschreven (Anzai, Methods Mol Biol, in druk)
B-27 Supplement (50X), serumvrijThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µL)Merck Millipore70746
Blasticidin S HydrochlorideFujifilm wako029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.314-BP-010
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD-tekeningsoftware,Robert McNeel and Associates, WA, VSRhinoceros 6.0
Centrifugeer ultrafiltratie-eenheid (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etchantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JapanN14B
Chromium masker bedekt met AZP1350Clean Surface Technology Co., JapanCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitatie Carrier (20mg/mL Glycogeen, 3 M Natriumacetaat (pH 5,2))Takara9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - hoge glucoseSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - hoge glucose, zonder natriumpyruvaatSigma-AldrichD5796
Ethanol (99,5)Fujifilm wako057-00456
Fetal Bovine SerumMoregate59301104
FGF-10, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basis), humaan, recombinantFujifilm wako060-04543
Gelatine van varkenshuidpoederSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
GLASBODEM kweekplatenMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-Ascorbinezuur natriumzoutFujifilm wako196-01252
Laminin-511 E8-fragment (LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Masker alignerUnion Optical Co., Ltd., JapanPEM-800
Maskloos litografie-instrumentNanoSystem Solutions, Inc., JapanD-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Spuitfiltereenheid, 0,45 µm, PVDF (0,45-µm filter)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.V.Ontwikkeld in ons vorige artikel (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digitale CMOS-cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
PetrischaalSansei medical co. Ltd01-004
Fenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeerDow Corning Corp., MI, VSSILPOT 184
Polyethyleeniminee MAX (MW. 40.000)Polyscience24765-1
Positieve fotoresistontwikkelaarTokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., JapanNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinase KTakara9034
Puromycine dihydrochlorideFujifilm wako166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A-eiwitR&D Systems, Inc.338-AC-050
Recombinant trypsine-achtig protease (rTrypsi

Referenties

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Pluripotente stamcellencardiomyocytdifferentiatiefluorescente live imaginggepatroneerde celkweekAAV-transductietime-lapse-imagingmodellering van hartaandoeningenImageJ SarcOptiM
Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.