Method Article

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myosine-eiwitten binden en interageren met filamenteuze actine (F-actine) en worden aangetroffen in organismen in de fylogenetische boom. Hun structuur en enzymatische eigenschappen zijn aangepast voor de specifieke functie die ze in cellen uitvoeren. Myosine 5a loopt processief op F-actine om melanosomen en blaasjes in cellen te transporteren. Omgekeerd werkt niet-amuscle myosine 2b als een bipolair filament dat ongeveer 30 moleculen bevat. Het beweegt F-actine van tegenovergestelde polariteit naar het midden van de gloeidraad, waar de myosinemoleculen asynchroon werken om actine te binden, een krachtslag te geven en te ontkoppelen voordat de cyclus wordt herhaald. Nonmuscle myosine 2b, samen met zijn andere nonmuscle myosine 2 isovormen, heeft rollen die celadhesie, cytokinese en spanningsonderhoud omvatten. De mechanochemie van myosines kan worden bestudeerd door in vitro motiliteitstesten uit te voeren met behulp van gezuiverde eiwitten. In de gliding actine filament assay, de myosines zijn gebonden aan een microscoop coverslip oppervlak en translocate fluorescerend gelabeld F-actine, die kan worden gevolgd. In de single molecule/ensemble motility assay is F-actine echter gebonden aan een coverslip en wordt de beweging van fluorescerend gelabelde myosinemoleculen op de F-actine waargenomen. In dit rapport wordt de zuivering van recombinant myosine 5a uit Sf9-cellen met behulp van affiniteitschromatografie beschreven. Hierna schetsen we twee fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays: de gliding actine filament assay en de omgekeerde motility assay. Uit deze test kunnen parameters zoals actinetranslocatiesnelheden en looplengtes en snelheden van één molecuul worden geëxtraheerd met behulp van de beeldanalysesoftware. Deze technieken kunnen ook worden toegepast om de beweging van enkelvoudige filamenten van de niet-muscle myosine 2 isovormen te bestuderen, die hierin worden besproken in de context van niet-amuscle myosine 2b. Deze workflow vertegenwoordigt een protocol en een reeks kwantitatieve tools die kunnen worden gebruikt om de enkele molecuul- en ensembledynamiek van niet-muscle myosines te bestuderen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myosines zijn motoreiwitten die kracht uitoefenen op actinefilamenten met behulp van de energie die wordt afgeleid van adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyse1. Myosines bevatten een hoofd-, nek- en staartdomein. Het hoofddomein bevat het actinebindende gebied en de site van ATP-binding en hydrolyse. De nekdomeinen zijn samengesteld uit IQ-motieven, die zich binden aan lichte ketens, calmodulin of calmodulin-achtige eiwitten2,3. Het staartgebied heeft verschillende functies die specifiek zijn voor elke klasse myosines, waaronder maar niet beperkt tot de verkleining van twee zware ketens, binding van ladingmoleculen en regulering van het myosine via auto-inhibitory interacties met de hoofddomeinen1.

De beweeglijke eigenschappen van myosine variëren sterk tussen klassen. Sommige van deze eigenschappen omvatten de duty ratio (de fractie van de mechanische cyclus van myosine waarin de myosine gebonden is aan actine) en processiviteit (het vermogen van een motor om meerdere stappen op zijn spoor te maken voordat hij wordt losgemaakt)4. De meer dan 40 klassen myosines werden bepaald op basis van sequentieanalyses5,6,7,8. De klasse 2 myosines zijn geclassificeerd als "conventioneel" omdat ze de eerste waren die werden bestudeerd; alle andere klassen myosines worden daarom geclassificeerd als "onconventioneel".

Myosine 5a (M5a) is een klasse 5 myosine en is een processieve motor, wat betekent dat het meerdere stappen langs actine kan nemen voordat het dissocieert. Het heeft een hoge duty ratio , wat aangeeft dat het een groot deel van zijn mechanische cyclus besteedt aan actin9,10,11,12,13,14. Net als andere myosines bevat de zware ketting een N-terminal motordomein dat zowel een actinebinding als een ATP-hydrolyseplaats omvat, gevolgd door een nekgebied dat dient als hefboomarm, met zes IQ-motieven die zich binden aan essentiële lichtketens (ELC) en calmodulin (CaM)15. Het staartgebied bevat α-spiraalvormige coiled-coils, die het molecuul dimmen, gevolgd door een bolvormig staartgebied voor het binden van lading. De kinetiek weerspiegelt zijn betrokkenheid bij het transport van melanosomen in melanocyten en van het endoplasmatisch reticulum in Purkinje neuronen16,17. M5a wordt beschouwd als de prototypische vrachtvervoermotor18.

Klasse 2 myosines, of de conventionele myosines, omvatten de myosines die samentrekking van skelet, hart en gladde spieren aandrijven naast de niet-muscle myosine 2 (NM2) isovormen, NM2a, 2b en 2c19. De NM2-isovormen worden aangetroffen in het cytoplasma van alle cellen en hebben gedeelde rollen in cytokinese, adhesie, weefselmorfogenese en celmigratie19,20,21,22. Dit artikel bespreekt conventionele myosineprotocollen in de context van niet-muscle myosine 2b (NM2b)23. NM2b heeft, in vergelijking met M5a, een lage duty ratio en is enzymatisch langzamer met een Vmax van 0,2 s-123 in vergelijking met M5a's Vmax van ≈18 s-124. Met name afgeknotte NM2b-constructies met twee koppen bewegen niet gemakkelijk procesief op actine; in plaats daarvan resulteert elke ontmoeting met actine in een machtsslag gevolgd door dissociatie van het molecuul25.

NM2b bevat twee myosine zware kettingen, elk met één bolvormig hoofddomein, één hendelarm (met één ELC en één regulerende lichte ketting (RLC)), en een α-spiraalvormige spiraalvormige staaf/staartdomein, ongeveer 1.100 aminozuren lang, dat deze twee zware kettingen verkleint. De enzymatische activiteit en de structurele toestand van NM2b worden gereguleerd door fosforylering van RLC23. Niet-gefosforyleerde NM2b, in aanwezigheid van ATP en fysiologische ionische sterktes (ongeveer 150 mM zout), keurt een compacte conformatie goed waarbij de twee koppen deelnemen aan een asymmetrische interactie en de staart op twee plaatsen terugvouwt over de koppen23. In deze toestand heeft het myosine geen sterke interactie met actine en heeft het een zeer lage enzymatische activiteit. Bij RLC-fosforylering door calmodulin-afhankelijke myosine lichtketenkinase (MLCK) of Rho-geassocieerd eiwitkinase, breidt het molecuul zich uit en associeert het met andere myosines door het staartgebied om bipolaire filamenten te vormen van ongeveer 30 myosinemoleculen23. De bovengenoemde fosforylering van de RLC leidt ook tot een verhoogde actine-geactiveerde ATPase-activiteit van NM2b met ongeveer vier keer26,27,28. Deze bipolaire filamentopstelling, met veel myosinemotoren aan elk uiteinde, is geoptimaliseerd voor rollen in contractie- en spanningsonderhoud, waarbij actinefilamenten met tegengestelde polariteiten ten opzichte van elkaar kunnen worden verplaatst23,29. Het is dan ook aangetoond dat NM2b als een ensemble van motoren fungeert bij interactie met actine. Het grote aantal motoren binnen deze gloeidraad laat NM2b-filamenten in staat om processief te bewegen op actinefilamenten, waardoor in vitro filamentprocesiviteit mogelijk is om29te karakteriseren .

Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van de rol van myosines in de cel, is er een behoefte om hun individuele kenmerken op eiwitniveau te begrijpen. Om actomyosine-interacties op een eenvoudig eiwit-eiwitinteractieniveau te begrijpen, in plaats van in een cel, kunnen we recombinante myosines uitdrukken en zuiveren voor gebruik in in vitro studies. De resultaten van dergelijke studies informeren mechanobiologen vervolgens over de biofysische eigenschappen van specifieke myosines die uiteindelijk complexe cellulaire processen aansturen12,13,14,25,29. Meestal wordt dit bereikt door een affiniteitstag toe te voegen aan een volledige of afgeknotte myosineconstructie en te zuiveren via affiniteitschromatografie29,30,31. Bovendien kan de constructie worden ontworpen om een genetisch encodable fluorofoor of een label voor eiwitetikettering met een synthetische fluorofoor op te nemen. Door zo'n fluorescerend label toe te voegen, kunnen beeldvormingsstudies met één molecuul worden uitgevoerd om myosinemechanica en kinetiek te observeren.

Na zuivering kan de myosine op verschillende manieren worden gekarakteriseerd. ATPase-activiteit kan worden gemeten met colorimetrische methoden, die inzicht geven in het totale energieverbruik en de affiniteit van de motor onder verschillende omstandigheden in werking stellen32. Om meer te weten te komen over de mechanochemie van de beweeglijkheid ervan, zijn verdere experimenten nodig. Dit artikel beschrijft twee in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de beweeglijke eigenschappen van een gezuiverd myosine-eiwit te karakteriseren.

De eerste van deze methoden is de glijdende actinegloeidraadtest, die kan worden gebruikt om de ensemble-eigenschappen van myosinemotoren kwantitatief te bestuderen, evenals de kwaliteit van een partij gezuiverd eiwit kwalitatief te bestuderen33. Hoewel dit artikel het gebruik van tirf-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) voor deze test bespreekt, kunnen deze experimenten effectief worden uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop in het breed veld die is uitgerust met een digitale camera, die vaak in veel laboratoria wordt aangetroffen34. In deze test wordt een verzadigende laag myosinemotoren bevestigd aan een coverslip. Dit kan worden bereikt met behulp van nitrocellulose, antilichamen, membranen, SiO2-gederivatiseerde oppervlakken (zoals trimethylchlorosilane), onder andere29,33,35,36,37,38. Fluorescerend gelabelde actinefilamenten worden door de afdeklipkamer gepasseerd, waarop de actine zich bindt aan de myosine die aan het oppervlak is bevestigd. Na toevoeging van ATP (en kinases in de studie van NM2) wordt de kamer afgebeeld om de translocatie van actinefilamenten door de oppervlaktegebonden myosines te observeren. Tracking software kan worden gebruikt om de snelheid en lengte van elke glijdende actine filament correleren. Analysesoftware kan ook een maat bieden voor het aantal bewegende en stationaire actinefilamenten, wat nuttig kan zijn om de kwaliteit van een bepaald myosinepreparaat te bepalen. Het aandeel vastgelopen filamenten kan ook opzettelijk worden gemoduleerd door oppervlaktegebonden actine aan andere eiwitten en gemeten om de belastingsafhankelijkheid van het myosine39te bepalen . Omdat elk actinefilament kan worden aangedreven door een groot aantal beschikbare motoren, is deze test zeer reproduceerbaar, waarbij de uiteindelijke gemeten snelheid robuust is voor verstoringen zoals veranderingen in de start myosineconcentratie of de aanwezigheid van extra factoren in de oplossing. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden aangepast om myosine-activiteit te bestuderen onder verschillende omstandigheden, zoals gewijzigde fosforylering, temperatuur, ionische sterkte, viscositeit van de oplossing en de effecten van belasting veroorzaakt door oppervlaktetethers. Hoewel factoren zoals sterk bindende myosine "dode hoofden" die niet in staat zijn tot ATP-hydrolyse vastgelopen actinefilamenten kunnen veroorzaken, bestaan er meerdere methoden om dergelijke problemen te verminderen en nauwkeurige metingen mogelijk te maken. De kinetische eigenschappen van myosine variëren sterk tussen de klassen en, afhankelijk van de specifieke myosine die wordt gebruikt, kan de snelheid van actinefilament glijden in deze test variëren van minder dan 20 nm/s (myosine 9)40,41en tot 60.000 nm/s(Characean myosine 11)42.

De tweede test keert de geometrie van de glijdende actinegloeidraadtestom 12. Hier worden de actinefilamenten aan het afdeklipoppervlak bevestigd en wordt de beweging van enkele moleculen van M5a of van individuele bipolaire filamenten van NM2b gevisualiseerd. Deze test kan worden gebruikt om de looplengtes en snelheden van enkele myosinemoleculen of filamenten op actine te kwantificeren. Een coverlip is bedekt met een chemische verbinding die niet-specifieke binding blokkeert en tegelijkertijd het oppervlak functionaliseert, zoals biotine-polyethyleenglycol (biotine-PEG). De toevoeging van gemodificeerde avidinderivaten priemt vervolgens het oppervlak en biotinylated actine wordt door de kamer gepasseerd, wat resulteert in een laag F-actine die stabiel aan de onderkant van de kamer is gebonden. Ten slotte wordt geactiveerd en fluorescerend gelabeld myosine (meestal 1-100 nM) door de kamer gestroomd, die vervolgens wordt afgebeeld om myosinebeweging over de stationaire actinefilamenten te observeren.

Deze modaliteiten vertegenwoordigen snelle en reproduceerbare methoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek van zowel niet-amuskel- als spier myosines te onderzoeken. Dit verslag schetst de procedures om zowel M5a als NM2b te zuiveren en te karakteriseren, die respectievelijk onconventionele en conventionele myosines vertegenwoordigen. Dit wordt gevolgd door een bespreking van enkele myosine-specifieke aanpassingen, die kunnen worden uitgevoerd om een succesvolle vastlegging van beweging in de twee soorten van de test te bereiken.

Expressie en moleculaire biologie
Het cDNA voor het myosine van belang moet worden gekloond op een gemodificeerde pFastBac1-vector die codeert voor een C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) als M5a-HMM wordt uitdrukt, of een N-terminal FLAG-tag als het molecuul van NM2b23,43,44,45,46wordt uitdrukt . C-terminal FLAG-tags op NM2b resulteert in een verzwakte affiniteit van het eiwit voor de KOLOM FLAG-affiniteit. Daarentegen bindt het N-terminaal MET VLAG gelabelde eiwit zich meestal goed aan de KOLOM FLAG-affiniteit23. Het N-terminaal gelabelde eiwit behoudt enzymatische activiteit, mechanische activiteit en fosforyleringsafhankelijke regulatie23.

In dit artikel werd een afgeknotte muis M5a heavy meromyosine (HMM)-achtige constructie gebruikt met een GFP tussen de FLAG-tag en het C-terminus van de myosine zware ketting. Merk op dat in tegenstelling tot NM2b M5a-HMM met succes kan worden getagd en gezuiverd met N- of C-terminal FLAG-tags en in beide gevallen zal de resulterende constructie actief zijn. De M5a zware keten werd afgekapt op aminozuur 1090 en bevat een drie aminozuur linker (GCG) tussen de GFP en het coiled-coil gebied van de M5a47. Er is geen extra linker toegevoegd tussen de GFP en FLAG-tag. M5a-HMM werd samen met calmodulin uitgedrukt. De volledige menselijke NM2b-constructie werd samen met ELC en RLC tot uitdrukking gebracht. De N-termini van de RLC werd gefuseerd met een GFP via een linker van vijf aminozuren (SGLRS). Direct gekoppeld aan de FLAG-tag was een HaloTag. Tussen de HaloTag en het N-eindpunt van de myosine zware keten was een linker gemaakt van twee aminozuren (AS).

Beide myosinepreparaten werden gezuiverd uit één liter Sf9-celkweek die besmet was met baculovirus met een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/ml. De volumes van het baculovirus voor elke subeenheid waren afhankelijk van de veelheid van infectie van het virus, zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. In het geval van M5a werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met twee verschillende baculovirussen- één voor calmodulin en één voor M5a zware keten. In het geval van de NM2b werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met drie verschillende virussen- één voor ELC, één voor RLC en één voor NM2b zware keten. Voor laboratoria die werken met een diversiteit aan myosines (of andere multicomplexe eiwitten), is deze aanpak efficiënt omdat het veel combinaties van zware en lichte ketens mogelijk maakt en veelgebruikte lichte ketens zoals calmodulin kunnen worden gecotransfecteerd met veel verschillende myosine zware ketens. Al het celwerk werd voltooid in een bioveiligheidskast met de juiste steriele techniek om besmetting te voorkomen.

Voor de expressie van zowel M5a als NM2b werden de Sf9-cellen die de recombinante myosines produceren 2-3 dagen na infectie verzameld, via centrifugeren, en opgeslagen bij -80 °C. Celkorrels werden verkregen door de met co-geïnfecteerde Sf9-cellen gedurende 30 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C te centrifugeren. Het eiwitzuiveringsproces wordt hieronder beschreven.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eiwitzuivering

  1. Cellyse en eiwitextractie
    1. Bereid een 1,5x extractiebuffer voor op basis van tabel 1. Filtreer en bewaar bij 4 °C.
    2. Begin met het ontdooien van de celkorrels op ijs. Terwijl de pellets ontdooien, vult u 100 ml extractiebuffer aan met 1,2 ml dithiothreitol (DTT), 5 μg/ml leupeptine, 0,5 μM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en twee proteaseremmertabletten. Blijf op ijs.
    3. Zodra de pellet ontdooid is, voegt u 1 ml van de aangevulde extractiebuffer toe per 10 ml celkweek. Als de celpellets bijvoorbeeld zijn gevormd uit 500 ml celkweek, voegt u vervolgens 50 ml aangevulde extractiebuffer toe aan de pellet.
    4. Soniceer de celkorrels terwijl je ze op ijs houdt. Gebruik voor elke pellet de volgende omstandigheden: 5 s AAN, 5 s UIT, duur van 5 min, vermogen 4-5.
    5. Verzamel al het gehomogeniseerde lysaat in een bekerglas en voeg ATP (0,1 M stamoplossing; pH 7,0) toe, zodat de uiteindelijke concentratie ATP 1 mM is. Roer gedurende 15 minuten in een koude kamer. De ATP scheidt actieve myosine van actine, waardoor het in de volgende centrifugeerstap kan worden gescheiden. Het is daarom essentieel om onmiddellijk door te gaan naar de volgende stap om de kans op ATP-uitputting en rebinding tot actine te minimaliseren.
    6. Centrifugeer de lysaten bij 48.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Terwijl dit gebeurt, begint u met het wassen van 1-5 ml van een 50% drijfmest van Anti-FLAG affiniteitshars (voor een pellet gevormd uit 1 L cellen) met 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), volgens de instructies van de fabrikant. Was bijvoorbeeld voor 5 ml hars 10 ml van een 50% drijfmest. In de laatste wasstap, resuspend de hars met 1-5 ml PBS met voldoende volume om een 50% slurry te creëren.
    7. Combineer na lysaatcentrifugatie het supernatant met de gewassen harsmest en schommel zachtjes in de koude kamer gedurende 1-4 uur. Maak tijdens het wachten de in tabel 1 beschreven buffers en houd ze op ijs.
  2. FLAG affiniteit zuiveringsvoorbereiding
    1. Centrifugeer de oplossing in stap 1.7 bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. De hars wordt aan de onderkant van de buis verpakt. Verwijder het supernatant zonder de hars te verstoren.
    2. Resuspendeer de hars in 50 ml buffer A zoals beschreven in tabel 1 en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C bij 500 x g. Verwijder het supernatant zonder de hars te verstoren.
    3. Resuspendeer de hars in 50 ml buffer B zoals beschreven in tabel 1 en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C bij 500 x g. Herhaal deze stap nogmaals en resuspendeer de hars in 20 ml buffer B. Meng vervolgens de hars en de buffer grondig door de buis ongeveer 10 keer voorzichtig met de hand om te keren.
  3. Eiwit elutie en concentratie
    1. Maak 30 ml elutiebuffer zoals beschreven in tabel 1 en laat het afkoelen op ijs.
    2. Zet de elutiekolom in een koude kamer. Giet de harsmest voorzichtig in de kolom. Was de kolom met 1-2 kolomvolumes buffer B terwijl de hars op de bodem zit, zodat de hars niet uitdroogt.
    3. Desinstroom 1 ml van de Elution Buffer door de hars en verzamel de doorstroming in een buis van 1,5 ml. Herhaal dit zodanig dat 12, 1 ml fracties worden verzameld.
    4. Voer op dit punt een ruwe Bradford-test uit op de breuken om kwalitatief te bepalen welke fracties het meest geconcentreerd zijn48. Op één rij van een 96-put plaat, pipet 60 μL 1x Bradford reagens. Meng 20 μL van elke fractie per put als fracties worden verzameld. Een donkerder blauwe kleuring duidt op de meer geconcentreerde fracties.
    5. Verzamel in een buis van 50 ml het resterende eiwit door de resterende ElutionBuffer voorzichtig door de kolom te leiden, om eventuele resterende myosine die aan de hars in de kolomstroom is gebonden, vrij te geven. Deze doorstroming zal in de volgende stap worden geconcentreerd. Zorg ervoor dat de hars vervolgens wordt geregenereerd voor hergebruik en wordt opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Pool de drie meest geconcentreerde fracties en concentreer de doorstroming verder in de 50 ml buis en de resterende 1 ml fracties met behulp van een 100.000 MWCO geconcentreerde buis. Plaats het gepoolde monster op de geconcentreerde buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C op 750 x g en herhaal dit totdat alle geëuteerde eiwitten zijn geconcentreerd tot een eindvolume van ongeveer 0,5-1 ml.
      OPMERKING: Deze poriegrootte maakt het mogelijk om de myosinemoleculen vast te houden, die meerdere keren de moleculaire gewichtsafsnijding hebben. De lichtkettingen blijven gedurende deze tijdskoers nauw verbonden met de motordomeinen, zoals geverifieerd door SDS-PAGE gelelektroforese op het eindproduct uit te voeren.
  4. Dialyse en flash-freezing
    1. Maak 2 L dialysebuffer, zoals beschreven in tabel 1. Plaats het monster in een dialysezak of -kamer en dialyzeer 's nachts in de koude kamer. Merk op dat de samenstelling van de dialysebuffers verschilt voor NM2b en M5a.
      OPMERKING: In het geval van NM2b is het doel van deze dialysestap om myosinefilamenten te vormen in de buffer met lage ionische sterkte. Sedimentatie van deze filamenten zorgt vervolgens voor een extra zuiveringsstap en maakt de concentratie van het monster mogelijk. Er zal dus de volgende dag een zichtbaar wit neerslag in de dialysekamer zijn. Deze filamenten worden verzameld door centrifugeren en gedepolymeriseerd in stap 5.1. In het geval van M5a-HMM zal het eiwit na de nachtelijke dialyse voldoende zuiver zijn voor gebruik in latere testtesten. Verdere zuiveringsstappen zoals gelfiltratie of ionische uitwisselingschromatografie kunnen indien nodig worden uitgevoerd. Voor M5a-herstel na dialyse gaat u naar stap 5.2.
  5. Myosine herstellen na dialyse
    1. Voor NM2b het volledige monster voorzichtig uit de dialysezak of -kamer verwijderen en gedurende 15 minuten bij 49.000 x g bij 49.000 x g centrifugeren om de myosinefilamenten op te halen. Gooi het supernatant weg en voeg stapsgewijs de opslagbuffer toe aan de pellet zoals beschreven in tabel 1 totdat deze is opgelost. Zachte op- en neerpijpen helpt om de pellet te solubiliseren. Normaal gesproken is hiervoor niet meer dan 500 μL per buis nodig. Nadat de pellet volledig is opgelost in de opslagbuffer met hoge ionische sterkte, kan een extra centrifugeerstap (15 minuten bij 49.000 x g)worden uitgevoerd om ongewenste aggregaten indien nodig te verwijderen, omdat de myosine nu onpolymeriseerd is en in het supernatant blijft.
    2. Verzamel voor M5a-HMM zorgvuldig het volledige monster uit de dialysekamer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 49.000 x g bij 49.000 x g indien er ongewenste aggregaten aanwezig zijn. Neem de supernatant.
  6. Concentratiebepaling en flitsbevriezeling
    1. Om de concentratie van het product te bepalen, meet u de absorptie met behulp van een spectrofotometer op golflengten 260, 280, 290 en 320 nm. Bereken de concentratie in mg/ml (cmg/ml) met vergelijking 1, waarbij A 280 de absorptie bij 280 nm vertegenwoordigt en A320 de absorptie bij 320 nm. De resulterende concentratie in mg/ml kan worden omgezet in μM myosinemoleculen met vergelijking 2, waarbij M het molecuulgewicht van het hele eiwit is (inclusief de zware ketens, lichte ketens, fluoroforen en alle tags).
      cmg/ml = (A280 - A320) / ε (1)
      μM moleculen = 1000cmg/ml/M (2)
      OPMERKING: Als een verdunning nodig is, moet dit worden gedaan in een buffer met hoge ionische sterkte. De extinctiecoëfficiënt (ε) kan worden bepaald door de aminozuursequentie van het eiwit te importeren in een programma zoals ExPASy. De typische opbrengst voor de M5a-HMM is ongeveer 0,5-1 ml 1-5 mg/ml eiwit en voor de volledige NM2b is 0,5-1 ml van 0,5-2 mg/ml. De extinctiecoëfficiënt voor de M5a-HMM die in dit artikel werd gebruikt was 0,671. De extinctiecoëfficiënt voor de NM2b die in dit document werd gebruikt, was 0,611.
    2. Bewaar de gezuiverde myosine op een van de twee manieren. Aliquot tussen 10-20 μL in een dunwandige buis, zoals een polymerisatiekettingreactiebuis, en laat de buis in een container met vloeibare stikstof vallen om te knipperen. Als alternatief, direct pipet tussen 20-25 μL myosine in vloeibare stikstof en bewaar de bevroren kralen van eiwitten in steriele cryogene buizen. In beide gevallen kunnen de resulterende buizen worden opgeslagen in -80 °C of vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: Aangezien beide hieronder beschreven motiliteitstesten zeer kleine hoeveelheden eiwit vereisen, is opslag in kleine aliquots, zoals beschreven, economisch.

2. Glijdende actine filament assay

  1. Coverslip voorbereiding
    1. Maak een 1% nitrocellulose oplossing in amylacetaat.
    2. Verkrijg een weefselkweekschaal (150 x 25 mm) en voeg een cirkelvormig filterpapier (diameter 125 mm) toe aan de onderkant van de schaal.
    3. Laad acht 1,5 dikte 22 mm vierkante deksels op een rek en was met ongeveer 2-5 ml 200-proof ethanol gevolgd door 2-5 ml gedestilleerd water (dH2O). Herhaal deze wasstap en eindig met water. Droog vervolgens de afdeklips volledig met behulp van een gefilterde luchtleiding of N2-lijn.
    4. Neem één deklip en pipetteer langzaam 10 μL van de 1% nitrocelluloseoplossing langs één rand van de slip. Smeer het vervolgens in één vloeiende beweging over de rest van de afdeklip met behulp van de zijkant van een gladde pipetpunt van 200 μL. Plaats deze hoeslip op de weefselkweekschaal met de nitrocellulosezijde naar boven. Herhaal dit voor de resterende afdeklips en laat ze drogen tijdens het bereiden van de resterende reagentia en gebruik de afdeklips binnen 24 uur na het coaten.
  2. Kamervoorbereiding
    1. Veeg een microscoopschuif af met een optisch lenspapier om groot vuil te verwijderen. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer 2 cm lang.
    2. Plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif. Zorg ervoor dat de rand van de tape overeenkomt met de rand van de dia. Plaats het tweede stuk tape ongeveer 2 mm onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel en uitgelijnd zijn. Hierdoor ontstaat een debietkamer die ongeveer 10 μL oplossing kan bevatten (zie figuur 1).
    3. Neem een van de met nitrocellulose beklede coverslips uit deel 1. Plak de afdeklip voorzichtig op de tape zodat de met nitrocellulose bedekte zijde direct contact maakt met de tape (zie figuur 1). Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuifband om er zeker van te zijn dat de afdeklip goed aan de schuif is vastgehecht. Snijd de overtollige tape die over de rand van de glijbaan hangt met een scheermesje.
  3. Actin voorbereiding
    1. Maak 20 μM F-actine door bolvormige actine (G-actine) te polymeriseren in polymerisatiebuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) bij 4 °C 's nachts.
    2. Verdun F-actine tot 5 μM in motiliteitsbuffer (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etiket met ten minste 1,2x molaire overmaat aan rhodamine-phalloïdine. Laat (bedekt met aluminiumfolie) minstens 2 uur op ijs staan. Dit kan tot 1-2 maanden worden gebruikt, opgeslagen op ijs.
  4. Uitvoeren van de myosine 5a glijactine filament assay
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de myosine 5a (HMM) zweefvliegtest verstrekt.
    1. Bereid de oplossingen voor myosine 5a beschreven in tabel 2 voor en houd ze op ijs.
    2. Desluid in 10 μL myosine 5a (50-100 nM) door de stromingskamer en wacht 1 min.
    3. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 50 mM MB met 1 mM DTT ("zoutarme buffer"). Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen.
    4. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Debiet in 10 μL van de zwarte actineoplossing (5 μM F-actine, 1 μM calmodulin en 1 mM ATP in 50 mM MB met 1 mM DTT) om "dode koppen" te elimineren, zoals besproken in de sectie Discussie.
      1. Pipetteer de oplossing met een spuit van 1 ml en een naald van 27 G om de actinefilamenten te scheren voordat u de oplossing in de kamer introduceert. Herhaal deze stap nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde keer. Ongeveer 20 pipetevenementen zijn voldoende.
      2. Om de "dead head" spin uit te voeren, voegt u een stoichiometrische hoeveelheid F-actine toe aan myosine in aanwezigheid van 1 mM ATP en 1 mM MgCl2 bij een zoutconcentratie van 500 mM. Vervolgens ultracentrifugeren bij 480.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. De dode myosine zal in de pellet zitten.
    6. Debiet in 50 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT en 1 mM ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten.
    7. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer om de kamer van een ATP uit te putten.
    8. Debiet in 10 μL 20 nM rhodamine actine (Rh-Actin) oplossing met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 minuut om rigor binding van actine filamenten aan de myosine 5a bevestigd aan het oppervlak van de coverslip mogelijk te maken.
    9. Was met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT om Rh-Actin filamenten weg te spoelen die niet aan het oppervlak zijn gebonden. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 30 μL eindbuffer.
    11. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van een excitatiegolflengte van 561 nm om Rh-Actin te visualiseren. Een geschikte belichtingstijd is 200 ms bij 1,4 mW laservermogen voor een totale acquisitieduur van 0,5-1 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de acquisitiesnelheid op de juiste manier wordt geschaald naar de snelheid van de bewegende filamenten. Een belangrijke overweging voordat u gegevens verzamelt voor gebruik met trackingprogramma's, is de aanschafframesnelheid. Subpixelbewegingen tussen frames zullen resulteren in een overschatting van de snelheid en bewegingen van enkele honderden nanometers zijn nodig om nauwkeurige waarden te verkrijgen. Een optimale acquisitiesnelheid is voorzien van actineglijder voor ten minste één pixelafstand tussen frames. In het geval van de TIRF-microscoop die hier voor de beeldvorming wordt gebruikt, vertaalt deze drempel zich in 130 nm; daarom moet een myosine die naar verwachting 1 μm/s zal afleggen, worden afgebeeld met een snelheid van 5 frames/s (interval van 0,2 s) om 200 nm beweging te bereiken, terwijl een myosine die naar verwachting 10 nm/s zal reizen, 0,05 frames/s (intervallen van 20 s) vereist. Gegevens kunnen daarom in dit stadium indien nodig worden gesampled (zie Discussie voor meer details).
  5. Uitvoeren van de nonmuscle myosine 2b glijactine filament assay
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de volledige niet-puntige myosine 2b glijtest verstrekt. Het nonmuscle myosine 2b glijactine filament assay protocol verschilt bij bepaalde stappen van het myosine 5a protocol. Zorg ervoor dat de juiste buffers worden gebruikt voor elk van deze stappen. De NM2b-test vereist bijvoorbeeld bevestiging van myosine aan de afdeklip in een zoutrijke buffer, terwijl de M5a in hoge of lage zoutbuffers aan de afdeklip kan worden bevestigd. Bovendien gebruikt de M5a gliding actine filament assay een lagere concentratie myosine om de frequentie van actine filamenten die uit elkaar vallen tijdens de acquisitie te verminderen.
    1. Bereid de oplossingen voor NM2b voor zoals beschreven in tabel 2 en houd ze op ijs.
    2. Debiet in 10 μL van de niet-muscle myosine 2b (0,2 μM) in 500 mM Motility Buffer (MB) ("hoge zoutbuffer") en 1 mM dithiothreitol (DTT) door de debietkamer en wacht 1 min.
      OPMERKING: De zoutrijke buffers dissociate myosinefilamenten en maken de bevestiging van enkele myosinemoleculen aan het oppervlak mogelijk, omdat niet-amuskel myosine 2b kan polymeriseren tot filamenten bij ionische concentratie <150 mM.
    3. Stroming in 10 μL van het 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) in 500 mM MB met 1 mM DTT ("zoutrijke buffer") zoals beschreven in tabel 2. Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    4. Wassen met 10 μL van 500 mM MB met 1 mM DTT zoals beschreven in tabel 2. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Stroom in 10 μL van de zwarte actineoplossing zoals beschreven in tabel 2 om "dode hoofden" te elimineren, zoals verder besproken in de sectie Discussie. De zwarte actineoplossing bevat 5 μM ongelabeld F-actine, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM en 1 mM DTT in 50 mM NaCl motiliteitsbuffer om de niet-amuscle myosine 2b op het oppervlak van de kamer te fosforyleren.
      1. Pipetteer de oplossing met een spuit van 1 ml en een naald van 27 G om de actinefilamenten te scheren voordat u de oplossing in de kamer introduceert. Herhaal deze stap nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde keer. Ongeveer 20 pipetteerevenementen zijn voldoende.
    6. Debiet in 50 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT en 1 mM ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten.
    7. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer om de kamer van een ATP uit te putten.
    8. Debiet in 10 μL 20 nM Rh-Actin-oplossing met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 minuut om rigorbinding van actinefilamenten mogelijk te maken aan de niet-muscle myosine 2b die aan het oppervlak van de afdeklip is bevestigd.
    9. Was met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT om Rh-Actin filamenten weg te spoelen die niet aan het oppervlak zijn gebonden. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 30 μL eindbuffer. Voor niet-amuskel myosine 2b glijdende actine filament assay, de Final Buffer omvat ook calmodulin, CaCl2, en myosine lichte keten kinase om volledige fosforylering van de nonmuscle myosine 2b tijdens video imaging. 0,7% methylcellulose kan ook in de Eindbuffer worden opgenomen als actinefilamenten slechts losjes gebonden zijn of niet aan het oppervlak gebonden zijn. Dit wordt verder besproken in de sectie Discussie.
    11. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met een excitatiegolflengte van 561 nm. Een geschikte belichtingstijd is 200 ms bij 1,4 mW laservermogen voor een totale acquisitieduur van 0,5 -3 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de acquisitiesnelheid op de juiste manier wordt geschaald naar de snelheid van de bewegende filamenten. Een belangrijke overweging voordat u gegevens verzamelt voor gebruik met trackingprogramma's, is de aanschafframesnelheid. Subpixelbewegingen tussen frames zullen resulteren in een overschatting van de snelheid en bewegingen van enkele honderden nanometers zijn nodig om nauwkeurige waarden te verkrijgen. Een optimale acquisitiesnelheid is voorzien van actineglijder voor ten minste één pixelafstand tussen frames. In het geval van de TIRF-microscoop die hier voor de beeldvorming wordt gebruikt, vertaalt deze drempel zich in 130 nm; daarom moet een myosine die naar verwachting 1 μm/s zal afleggen, worden afgebeeld met een snelheid van 5 frames/s (interval van 0,2 s) om 200 nm beweging te bereiken, terwijl een myosine die naar verwachting 10 nm/s zal reizen, 0,05 frames/s (intervallen van 20 s) vereist. Gegevens kunnen daarom in dit stadium worden gesampled, indien nodig (zie Discussie voor meer details).

3. Tirf-test met één molecuul

  1. Coverslip voorbereiding
    1. Verdeel het bouillonpoeder in 10 mg aliquots (in 1,5 ml tubes) methoxy-Peg-silaan (mPEG) en 10 mg aliquots biotine-Peg-silaan (bPEG). Bewaren bij -20 °C in een afgesloten, vochtvrije container en binnen 6 maanden gebruiken.
    2. Laad acht no. 1,5H (hoge precisie) dikte 22 mm vierkante afdeklips op een rek en was met 2-5 ml 200-proof ethanol gevolgd door 2-5 ml gedestilleerd water. Herhaal deze wasstap en eindig met water. Droog vervolgens de afdeklips volledig met behulp van een luchtleiding of N2 en plasmaschoon met argon gedurende 3 minuten.
    3. Plaats de schone afdeklips op filterpapier (90 mm) in een weefselkweekschaal (100 x 20 mm) en incubeer in een oven van 70 °C terwijl u de volgende stappen uitvoert.
      OPMERKING: De plasmareiniging kan worden vervangen door andere chemische reinigingsmethoden49.
    4. Bereid 80% ethanoloplossing met dH2O en stel de pH in op 2,0 met HCl. Voeg hiervan 1 ml toe aan een 10 mg aliquot mPEG en 1 ml aan een 10 mg aliquot bPEG. Vortex om op te lossen, wat niet meer dan 30 s mag duren.
    5. Neem 100 μL van de bPEG-oplossing en voeg 900 μL 80% ethanol (pH 2,0) toe. Deze oplossing is 1 mg/ml bPEG. Maak vervolgens een oplossing van beide PEGs als volgt, grondig mengend.
      1. 200 μL van 10 mg/ml mPEG (eindconcentratie: 2 mg/ml).
      2. 10 μL van de 1 mg/ml bPEG (eindconcentratie: 10 μg/ml).
      3. 790 μL van de 80% ethanol (pH 2,0) oplossing.
    6. Haal de afdeklipjes uit de oven. Verdeel voorzichtig 100 μL peg-oplossing over het midden van elke afdeklip, zodat alleen het bovenoppervlak nat is. Plaats vervolgens de slips terug in de oven en incubeer gedurende 20 tot 30 minuten.
    7. Wanneer de afdeklips een gatachtig uiterlijk beginnen aan te nemen, met kleine cirkels zichtbaar over het oppervlak, verwijder ze dan uit de oven.
    8. Was elke afdeklip met 100% ethanol, droog met een luchtlijn en zet terug in de oven. Incubeer alleen voor de tijd die nodig is om kamers te maken in stap 2.
  2. Kamervoorbereiding
    1. Reinig een microscoopschuif voor gebruik bij het maken van de kamer. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer 2 cm lang.
    2. Plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif. Zorg ervoor dat de rand van de tape overeenkomt met de rand van de dia. Plaats het tweede stuk tape ongeveer 2 mm onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel en uitgelijnd zijn.
    3. Neem een van de gefunctionaliseerde afdeklipjes uit de oven (gemaakt in 3.1). Plak de afdeklip voorzichtig op de tape zodat de met PEG bedekte zijde naar beneden is gecoat en direct contact maakt met de tape, zoals afgebeeld in figuur 1. Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuifband om er zeker van te zijn dat de afdeklip goed aan de schuif is vastgehecht.
    4. Snijd de overtollige tape die over de glijbaan hangt met een scheermesje. Deze kamers kunnen onmiddellijk worden gebruikt of paarsgewijs in een buis van 50 ml worden geplaatst en in een vriezer van -80 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik. Het is belangrijk om onmiddellijk op te slaan, anders zal het oppervlak afbreken.
  3. Uitvoeren van de myosine 5a TIRF microscopie test
    1. Bereid de oplossingen voor myosine 5a omgekeerde motiliteitstest zoals beschreven in tabel 3 voor en houd ze op ijs.
    2. Was de kamer met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT.
    3. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    4. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Debiet in 10 μL van de NeutrAvidin-oplossing in 50 mM MB met 1 mM DTT en wacht 1 minuut.
    6. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    7. Debiet in 10 μL biotinylated rhodamine actine (bRh-Actin) met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 min. Gebruik voor deze stap een grote verveende pipettip en vermijd pipetten op en neer om het scheren van de fluorescerende actinefilamenten te minimaliseren om ervoor te zorgen dat lange actinefilamenten aan het oppervlak kunnen worden bevestigd (20-30 μm of langer). Een effectief alternatief is het snijden van de kegel van een standaard pipetpunt (met een opening van ≈1-1,5 mm).
    8. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    9. Debiet in 30 μL Final Buffer met 10 nM myosine 5a toegevoegd, laad vervolgens onmiddellijk op de TIRF-microscoop en noteer na het vinden van de optimale focus voor TIRF-beeldvormingsmodaliteit. Blootstellingstijden tussen 100-200 ms zijn geschikt bij 1,4 mW laservermogen voor de actine en GFP-gelabelde myosine. Een geschikte acquisitietijd voor snelheidsanalyse is 3 min.
  4. Uitvoeren van de nonmuscle myosine 2b TIRF microscopie test
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de niet-muscle myosine 2b TIRF-test met behulp van gepolymeriseerde en gefosforyleerde filamenten verstrekt. Gedetailleerd protocol (secties 4.1-4.3) voor het fosforyleren en polymeriseren van de niet-muscle myosine-2b in een buis is opgenomen.
    1. Om de gezuiverde NM2b te fosforyleren, maakt u een kinasemix van 10x met de volgende omstandigheden: 2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK en 0,1 mM ATP. Dit kan op volume gebracht worden met 500 mM MB met 10 mM DTT. Voeg de 10x kinasemix toe aan de myosine in een volumetrische verhouding van 1:10 en laat dit 20-30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Meestal is de myosineconcentratie voor deze stap 1 μM.
    2. Om de gefosforyleerde myosine in filamenten te polymeriseren, verlaagt u de zoutconcentratie van de NM2b tot 150 mM NaCl. Maak hiervoor een 1x motility buffer (1x MB) zonder zout door de 4x MB vier keer in dH2O te verdunnen. Deze 1x MB kan worden gebruikt om de zoutconcentratie te verlagen omdat de NM2b in een zoutbuffer van 500 mM is ingevroren.
    3. Voeg voor elke 3 μL voorraad NM2b 7 μL 1x MB toe om de zoutconcentratie te verlagen tot 150 mM NaCl en incubeer gedurende 20-30 minuten op ijs om NM2b-filamenten te vormen.
      OPMERKING: De volgorde in de punten 4.1-4.3 is niet cruciaal zolang de NM2b is gefosforyleerd en de uiteindelijke zoutconcentratie 150 mM is. Incubatie in de orde van 30 min-1 uur geeft voldoende tijd voor volledige fosforylering en polymerisatie.
    4. Bereid de oplossingen voor nonmuscle myosine 2b omgekeerde motiliteitstest zoals beschreven in tabel 3 voor en houd ze op ijs.
    5. Was de kamer met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT.
    6. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 150 mM MB met 1 mM DTT Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    7. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    8. Debiet in 10 μL van de NeutrAvidin-oplossing in 150 mM MB met 1 mM DTT en wacht 1 minuut.
    9. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 10 μL bRh-Actin en wacht 1 min. Gebruik voor deze stap een grote verveende pipettip en vermijd pipetten op en neer om het scheren van de fluorescerende actinefilamenten te minimaliseren, om ervoor te zorgen dat lange actinefilamenten aan het oppervlak kunnen worden bevestigd (20-30 μm of langer). Een effectief alternatief is het snijden van de kegel van een standaard pipetpunt.
    11. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    12. Debiet in 10 μL van de niet-muscle myosine 2b-oplossing (ongeveer 30 nM) en wacht 1 min.
    13. Wassen met 10 μL van 150 MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    14. Debiet in 30 μL Final Buffer, laad vervolgens onmiddellijk op de TIRF-microscoop en noteer na het vinden van de optimale focus voor TIRF-beeldvormingsmodaliteit. Blootstellingstijden tussen 100-200 ms zijn geschikt bij 1,4 mW laservermogen voor de actine en GFP-gelabelde myosine. Een geschikte acquisitietijd voor snelheidsanalyse is 3 min.

4. Beeldanalyse

  1. Beeldanalyse voor glijdende actine filament assay
    OPMERKING: De afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met behulp vande software en handleidingen die zijn gekoppeld in de lijst met materialen . Het is belangrijk op te merken dat het hier beschreven programma TIFF-stacks vereist voor analyse. Het proces voor het analyseren van de test van de glijactinegloeidraad is als volgt50.
    1. Upload onbewerkte filmstapels naar een opgegeven mapstructuur en voer de bovenste map van de filmmappen in het programma in.
      OPMERKING: Het programma analyseert de bestanden in deze map en submappen en behandelt de mappen op het laagste niveau als replica's. Er worden gemiddelde statistieken voor elke groep replicates geproduceerd. In dit geval werd voor elke myosine één film gebruikt. Bij het karakteriseren van een nieuwe myosine of het onderzoeken van een nieuwe experimentele aandoening, wordt aanbevolen om films te analyseren vanuit drie gezichtsvelden (FOV) per kamer voor een totaal van drie kamers en om deze workflow te herhalen voor drie voorbereidingen van de myosine die wordt onderzocht.
    2. Gebruik het script "stack2tifs" in combinatie met de door de gebruiker ingevoerde framesnelheid om elke TIFF-stack om te zetten in een map met een reeks afzonderlijke TIFF-bestanden en een bijbehorend metagegevensbestand.txt bestand dat de begintijd van elk frame bevat. Voor gegevens die niet in de TIFF-stackindeling zijn, moet eerst een conversie worden toegepast met behulp van software zoals die in de tabel met materialen.
      OPMERKING: Dit script is het onderdeel van het softwarepakket. De informatie van het script is hier te vinden: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Gebruik de parameter -px, de pixelgrootte (in nm) tijdens het verkrijgen. In dit geval is de pixelgrootte 130 nm. Gebruik de parameters -xmax en -ymax voor het schalen van de assen voor de scatterplotuitgangen. Deze komen overeen met de langste geplote filamentlengte en de maximale geplote snelheid (in nm/s).
      OPMERKING: Dit zijn geschatte waarden en kunnen worden ingesteld op waarden die hoger zijn dan verwacht om ervoor te zorgen dat gegevens in het plot worden opgenomen. Na analyse kunnen de onbewerkte gegevens ook worden geëxporteerd voor gebruik in andere statistische of grafische software voor weergave en analyse.
    4. Gebruik de parameter -minv, een minimale snelheidsafsnijdingsparameter, om de filamenten te definiëren die niet bewegen en daarom kunnen worden uitgesloten van de analyse. Voor een langzame myosine zoals NM2b moet deze parameter laag zijn (in dit voorbeeld 5 nm/s) om te voorkomen dat echte glijdende bewegingen worden uitgesneden. Voor een snelle myosine zoals M5a kan deze parameter hoger zijn (in dit voorbeeld 100 nm/s) om een strenger filter toe te passen, met behoud van de werkelijke glijsnelheidsverdeling.
    5. Gebruik de -pt cutoff parameter om vloeiende beweging te identificeren. Voor elk bemonsteringsvenster wordt een waarde berekend die overeenkomt met 100 x standaardafwijking/gemiddelde snelheid van de snelheid. Tracks met hogere waarden dan de cutoff, hebben meer variabele snelheden en zijn uitgesloten van verdere analyse. In dit voorbeeld is een afsluitwaarde van 33 gebruikt. Tracks met hogere waarden hebben meer variabele snelheden en zijn uitgesloten van verdere analyse.
    6. Gebruik -maxd om een maximaal toegestane koppelingsafstand tussen frames in te stellen. Dit is een berekende frame-tot-frame afstand bewogen door het zwaartepunt van de gloeidraad in eenheden van nm. Het kan nuttig zijn voor het uitsluiten van sporadische bewegingen of onjuiste koppeling tussen filamenten. In de voorbeelden hier bleef de parameter achter op de standaardwaarde van 2.000 nm.
  2. Beeldanalyse voor TIRF-microscopietest
    OPMERKING: Het proces voor het analyseren van de TIRF-test met één molecuul op de beeldvormingssoftware die specifiek in de Tabel met materialen is als volgt29.
    1. Klik en sleep de opgenomen microscopievideo naar de werkruimte van de software om deze te openen51. Splits vervolgens de acquisitiekanalen. Klik op Afbeelding > Kleur > Gesplitste kanalen.
      OPMERKING: In het geval van een merkbare faseafwijking tijdens de verwerving, moeten beelden worden gestabiliseerd om de instrumentele drift op het beeldvlak te corrigeren. In dit geval werd geen compensatie voor Z-as drift gebruikt omdat de microscoop die wordt gebruikt om deze gegevens te verkrijgen de Z-focus goed stabiliseert. Als u de afbeelding in het beeldanalyseprogramma wilt stabiliseren, installeert u de juiste stabilisatorplug-in die is gekoppeld aan de lijst met materialen. De afbeeldingsstabilisator neemt vaste posities aan voor de objecten in de afbeelding en gebruikt een voortschrijdend gemiddelde van de vorige frames als referentie. De aanbevolen procedure is daarom om te beginnen met het kanaal met afbeeldingen van gelabeld actine, omdat dit zich in een vaste positie bevindt.
    2. Klik op Plug-insen zoek vervolgens Image Stabilizer; zorg ervoor dat Vertaling is geselecteerd en bewaar de standaardinstellingen. Schakel het selectievakje naast Logboektransformatiecoëfficiënten in. Als u deze logboekstap toepast, kunnen de berekende verschuivingsparameters in de volgende stap op het andere kanaal worden toegepast. Zorg ervoor dat het proces is voltooid.
    3. Open vervolgens het kanaal met het label myosine en pas de stabilisatie toe door te klikken op Plug-ins > Image Stabilizer Log Applier. Als beelden van actine niet tijdens dezelfde verwerving kunnen worden verkregen vanwege een vereiste voor beeldvorming met een hogere snelheid in één kanaal, stabiliseert drift de stapel afbeeldingen door een gebied te selecteren dat statische objecten bevat, zoals een biotinylated fiducial marker of fluoroforen die niet specifiek aan het biotine-PEG-oppervlak zijn gebonden. Dit gebied kan worden bijgesneden van de oorspronkelijke stapel en gestabiliseerd, gevolgd door toepassing van de resulterende verschuivingswaarden op de oorspronkelijke stapel.
      OPMERKING: In de praktijk zal de drift die wordt waargenomen in motiliteitsexperimenten verwaarloosbaar zijn ten opzichte van de beweging van myosines die bij enkele honderden nm/s bewegen, maar voor de langzaamste myosines wordt dit een belangrijke overweging.
    4. Open vervolgens TrackMate, klik op Plug-ins; klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op Volgen en ten slotte op TrackMate. Op dit punt is de beeldanalyse onderhevig aan optimalisatie op basis van de parameters van de fluorofoor- en testomstandigheden. De ideale startparameters zijn echter als volgt.
      1. Kalibratie-instellingen: bewaar alle standaardwaarden.
      2. Detector: LoG detector.
      3. Geschatte blobdiameter: 0,5-1,0 micron.
      4. Drempel: 25-200. (Dit kan worden bepaald door op Preview te klikken nadat u een nummer hebt gekozen om te zien of de gedetecteerde vlekken overeenkomen met de film en op de juiste manier aan te passen.)
      5. Initiële drempelwaarde: niet ingesteld.
      6. Weergave: HyperStack Displayer.
      7. Filters instellen op vlekken: niet ingesteld.
      8. Tracker: Eenvoudige LAP tracker.
        OPMERKING: Deze zijn afhankelijk van framesnelheid en myosinesnelheid en moeten groot genoeg zijn om volgende posities aan te sluiten, terwijl ongewenste verbindingen tussen verschillende deeltjes worden uitgezien.
      9. Koppeling maximale afstand: 1,0 micron.
      10. Gap-closing max afstand: 1,0 micron.
      11. Gap-closing max frame gap: 1.
      12. Filters instellen op tracks: Track Displacement (>0,39-om alleen spots op te nemen die meer dan 3 pixels bewegen), Spots in tracks (>3-to alleen tracks met ten minste 3 spots bevatten). Andere filters zoals Minimal Velocity kunnen worden geïntroduceerd om plekken uit te sluiten die langdurig blijven staan. De resultaten van het filteren moeten worden gecontroleerd door visuele inspectie van sporen om ervoor te zorgen dat valse sporen (d.w.z. myosinebeweging op de achtergrond die zich niet langs een actinespoor bevindt) worden verwijderd met behoud van de sporen die aan actine zijn gekoppeld.
    5. Zodra het scherm Weergaveopties verschijnt, klikt u op Analyse voor de relevante uitgangen. Sla de drie geproduceerde tabellen op (Trackstatistieken, Koppelingen in Trackstatistieken en Vlekken in Trackstatistieken). De tabel Track Statistics bevat de snelheids- en verplaatsingsgegevens die vervolgens kunnen worden geanalyseerd om bijvoorbeeld een nieuw eiwit of de effecten van een bepaalde experimentele aandoening te karakteriseren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zuivering van myosine kan worden geëvalueerd door het verminderen van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-elektroforese zoals weergegeven in figuur 2. Terwijl dit cijfer de definitieve, post-dialysed myosine vertegenwoordigt, kan SDS-PAGE op aliquots van de verschillende stadia van de zuiveringsprocedure worden uitgevoerd om om het even welke producten te identificeren die aan supernatant verloren gaan. Myosin 5a HMM heeft een band in het 120-130 kDa bereik en de full-leng...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een workflow gepresenteerd voor de zuivering en in vitro karakterisering van myosine 5a en niet-amuscle myosine 2b. Deze reeks experimenten is nuttig voor het kwantificeren van de mechanochemische eigenschappen van gezuiverde myosineconstructies op een snelle en reproduceerbare manier. Hoewel de twee myosines die hier worden getoond slechts twee specifieke voorbeelden zijn van de vele mogelijkheden, kunnen de voorwaarden en technieken, met enige aanpassing, worden toegepast op de meeste myosines en op vele and...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Fang Zhang voor technische hulp bij de voorbereiding van de reagentia die worden gebruikt voor het verzamelen van deze gegevens. Dit werk werd ondersteund door de NHLBI/NIH Intramuraal OnderzoekSprogramma fondsen HL001786 aan J.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 Gauge NeedleBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acetic AcidThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor TabletsMillipore Sigma5056489001Dit moet worden bewaard bij 4 °C. De tabletten kunnen direct worden gebruikt of kunnen worden gereconstitueerd als een 25x stamoplossing door 1 tablet op te lossen in 2 mL gedistilleerd water. De resulterende oplossing kan worden bewaard bij 4 °C gedurende 1-2 weken of ten minste 12 weken bij -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024De MWCO van de buis is niet noodzakelijkerwijs 'één maat past voor allen', zolang de MWCO minder is dan het totale molecuulgewicht van het gezuiverde eiwit. De NM2b hierin werd geconcentreerd met een buis van 100.000 MWCO en de M5a werd geconcentreerd met een buis van 30.000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5ADe diameter van de dialysebuis kan variëren, maar de MWCO moet hetzelfde zijn. De NM2b die hierin werd gebruikt, werd gedialyseerd in een dialysebuis van 18 mm. De buizen kunnen worden bewaard in 20% alcoholoplossing bij 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586Dit kan worden opgelost in een buffer met 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 en 10 mM MOPS (pH 7,2) tot een eindconcentratie van 50 mg/mL. Dit kan worden bewaard bij -20 °C als 300 µL aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550Deze kunnen worden hergebruikt. Om te reinigen, spoelt u de kolom met 2-3 kolomvolumes PBS en gedistilleerd water. Koel de kolom voor gebruik op 4° C.
EthanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541G-actin stock kan worden bewaard bij 200 μM in vloeibare N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Unstained Standard LadderThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMillipore SigmaMX0482
MethylcelluloseMillipore

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin Motility AssaysFluorescence MicroscopyGliding Actin FilamentInverted Motility AssayNonmuscle Myosin 2bMyosin 5a PurificationActin Filament TrackingSingle Molecule DynamicsTotal Internal ReflectionAffinity Chromatography

Related Articles