Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Summary

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Abstract

Levende pancreasweefselplakken maken de studie van eilandjesfysiologie en -functie mogelijk in de context van een intacte micro-omgeving van eilandjes. Plakjes worden bereid uit levend menselijk en muis pancreasweefsel ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome. Deze methode zorgt ervoor dat het weefsel levensvatbaarheid en functie behoudt, naast het behoud van onderliggende pathologieën zoals type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D). De slice-methode maakt nieuwe richtingen mogelijk in de studie van de pancreas door het onderhoud van de complexe structuren en verschillende intercellulaire interacties die de endocriene en exocriene weefsels van de pancreas omvatten. Dit protocol demonstreert hoe kleuring en time-lapse microscopie van levende endogene immuuncellen in pancreasplakken kunnen worden uitgevoerd, samen met beoordelingen van de eilandjesfysiologie. Verder kan deze benadering worden verfijnd om immuuncelpopulaties te onderscheiden die specifiek zijn voor eilandcelantigenen met behulp van belangrijke histocompatibiliteit complex-multimeerreagentia.

Introduction

Betrokkenheid van de alvleesklier is pathognomonisch voor ziekten zoals pancreatitis, T1D en T2D1,2,3. De studie van de functie in geïsoleerde eilandjes omvat meestal het verwijderen van de eilandjes uit hun ^omgeving4. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel is ontwikkeld om de studie van pancreasweefsel mogelijk te maken met behoud van intacte micro-omgevingen van eilandjes en het vermijden van het gebruik van stressvolle isolatieprocedures ^{voor eilandjes5,6,7}

Protocol

OPMERKINGEN: Alle experimentele protocollen met muizen werden goedgekeurd door de University of Florida Animal Care and Use Committee (201808642). Menselijke pancreassecties van weefseldonoren van beide geslachten werden verkregen via de Weefselbank Netwerk voor Pancreasorgaandonoren met Diabetes (nPOD), Universiteit van Florida. Menselijke pancreata werden geoogst van cadaverische orgaandonoren door gecertificeerde orgaanverwervingsorganisaties die samenwerken met nPOD in overeenstemming met de wet- en regelgeving inzake orgaandonatie en geclassificeerd als "Niet-menselijke proefpersonen" door de University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr. 392-200....

Results

Dit protocol levert levende pancreasweefselplakken op die geschikt zijn voor zowel functionaliteitsstudies als immuuncelopnamen. Het uiterlijk van de segmenten in zowel helder als ondergereflecteerd licht is weergegeven in figuur 1A,B. Zoals besproken, kunnen eilandjes worden gevonden in plakjes met gereflecteerd licht vanwege hun verhoogde granulariteit die optreedt vanwege hun insulinegehalte (figuur 1C) en worden ze duidelijk waargenomen in v.......

Discussion

Het doel van dit protocol is om het genereren van pancreasplakken en de procedures die nodig zijn om de plakjes te gebruiken in functionele en immunologische studies te verklaren. Er zijn veel voordelen aan het gebruik van levende pancreasplakken. Er zijn echter verschillende kritieke stappen die essentieel zijn voor het weefsel om levensvatbaar en nuttig te blijven tijdens de beschreven experimentprotocollen. Het is noodzakelijk om snel te werken. De tijdsduur tussen het injecteren van de alvleesklier en het genereren v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Handle	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish	Corning	430591
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	301029	BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle	BD	BD 305109	BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe	BD	309653
8-well chambered coverglass	Ibidi	80826	µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Calcium chloride	Sigma	C5670	CaCl2
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Confocal laser-scanning microscope	Leica	SP8	Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm tissue culture dish	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Ice bucket	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform	Warner Instruments	PM-1	Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave	GE	JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Paintbrush	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26	Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer	Emory Tetramer Research Core	sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Potassium chloride	Sigma	P5405	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque low melting-point agarose	Lonza	50101	To make agarose for slice generation
Slice anchor	Warner Instruments	64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)	Warner Instruments	640253	Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma	S5886	NaCl
Sodium phosphate monohydrate	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter	Warner Instruments	SA-20MW-AL	To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator	Okolab	H201
Stereoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet	Falcon	357575	Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System	Warner Instruments	VCS-8	System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02