Gepresenteerd is een methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie van de longen die de locatie van cellen in luchtwegen, longblaasjes en interstitium behoudt voor structuur-functieanalyses. Constante luchtwegdruk wordt gehandhaafd met een luchtinflatiekamer, terwijl fixatief wordt toegediend via de rechter ventrikel. Longen worden verwerkt voor histologische studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longhestologie wordt vaak gebruikt om de bijdragen van luchtruimcellen tijdens longhomeostase en pathogenese van ziekten te onderzoeken. Veelgebruikte fixatiemethoden op basis van instillatie kunnen echter luchtruimcellen en slijm in terminale luchtwegen verplaatsen en de weefselmorfologie veranderen. Ter vergelijking: vasculaire perfusie-fixatietechnieken zijn superieur in het behoud van de locatie en morfologie van cellen in luchtruimen en de mucosale bekleding. Als positieve luchtwegdruk echter niet tegelijkertijd wordt toegepast, kunnen delen van de longen instorten en kunnen haarvaten uitpuilen in de alveolaire ruimtes, wat leidt tot vervorming van de longanatomie. Hierin beschrijven we een goedkope methode voor luchtinflatie tijdens vasculaire perfusie-fixatie om de morfologie en locatie van luchtweg- en alveolaire cellen en interstitium in muizenlongen te behouden voor downstream histologische studies. Constante luchtdruk wordt via de luchtpijp aan de longen afgegeven vanuit een afgesloten, met lucht gevulde kamer die de druk handhaaft via een instelbare vloeistofkolom terwijl het fixatief door de rechter ventrikel wordt geperfundeerd.
Inleiding
Longhestologie vertegenwoordigt de gouden standaard voor het beoordelen van longarchitectuur tijdens gezondheid en ziekte en is een van de meest gebruikte hulpmiddelen door longonderzoekers1. Een van de meest kritische aspecten van deze techniek is de juiste isolatie en behoud van longweefsel, omdat variabiliteit in deze stap kan leiden tot slechte weefselkwaliteit en onjuiste resultaten1,2,3. Bij levende dieren wordt het longvolume bepaald door de balans tussen de naar binnen gerichte elastische terugslag van de long en de naar buiten gerichte krachte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van National Jewish Health.
OPMERKING: Het protocol is georganiseerd in drie componenten. Het eerste onderdeel beschrijft de constructie van de luchtinflatie met perfusie-/fixatieapparatuur. In een tweede sectie wordt beschreven hoe u de apparatuur voor een experiment instelt. In het laatste gedeelte wordt beschreven hoe het dier moet worden voorbereid en het experiment moet worden uitgevoerd.
1. Constructie van het waterkolomapparaat (figuur 1B)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In een intacte thorax worden de longen opengehouden door naar buiten gerichte krachten die door de borstwand worden uitgeoefend via de pleurale ruimte6,14. Wanneer het diafragma tijdens de dissectie wordt betreden, wordt de integriteit van de pleurale ruimte opgeheven en moeten de longen instorten (Figuur 2A, 2B). Om de longen opnieuw uit te zetten, wordt luchtinflatie uitgevoerd. Als eerste stap wordt 25 cm waterdru.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel vaak gebruikt, verdringen intratracheale fixatiemethoden leukocyten uit de luchtwegen en kunnen ze de normale longarchitectuur veranderen. De methode van luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie die in dit protocol wordt gegeven, overwint deze valkuilen en behoudt nauwkeuriger de longanatomie. De sleutels tot het verkrijgen van hoogwaardig weefsel uit de vasculaire perfusie-fixatiemethode omvatten zorgvuldige monitoring van luchtinflatiedrukken, het vermijden van luchtlekken en het zorgen voor een adequate pe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) subsidies HL140039 en HL130938. De auteurs willen Shannon Hott en Jazalle McClendon bedanken voor hun technische expertise.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Spuit gebruikt voor het maken van de waterkolom |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Naald voor vasculaire perfusie/fixatie |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparine oplossing. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixatieoplossing. Verdund tot 4% met fosfaatgebufferde zoutoplossing |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Siliconomlegging voor luchtdicht afdichten van kamers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Fles gebruikt voor het maken van de lucht-opblaaskamer en buffer gebruikt voor heparine en fixatieoplossingen |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Container voor dierverwerking |
Referenties
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bach....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
