Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijke uitdaging voor de succesvolle levering van medicijnen aan de hersenen. Ultrasone blootstelling in de aanwezigheid van microbubbels is naar voren gekomen als een effectieve methode om de permeabiliteit van de BBB tijdelijk en lokaal te verhogen, waardoor para- en transcellulair transport van geneesmiddelen over de BBB wordt vergemakkelijkt. Het in beeld brengen van de vasculatuur tijdens echo-microbubbelbehandeling zal waardevolle en nieuwe inzichten opleveren over de mechanismen en dynamiek van ultrasone microbubbelbehandelingen in de hersenen.

Hier presenteren we een experimentele procedure voor intravitale multifotonenmicroscopie met behulp van een schedelvenster uitgelijnd met een ringtransducer en een 20x objectieflens. Deze opstelling maakt beeldvorming van de hersenen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk tijdens ultrasone microbubbelbehandelingen. Optische toegang tot de hersenen wordt verkregen via een schedelraam met open schedel. Kortom, een stuk van de schedel met een diameter van 3-4 mm wordt verwijderd en het blootgestelde gebied van de hersenen wordt afgesloten met een glazen afdekplaat. Een 0,82 MHz ringomvormer, die is bevestigd aan een tweede glazen afdekplaat, is bovenop gemonteerd. Agarose (1% w/v) wordt gebruikt tussen de coverslip van de transducer en de coverslip die het schedelvenster bedekt om luchtbellen te voorkomen, die ultrasone voortplanting belemmeren. Wanneer steriele chirurgische procedures en ontstekingsremmende maatregelen worden genomen, kunnen echografie-microbubbelbehandelingen en beeldvormingssessies herhaaldelijk gedurende meerdere weken worden uitgevoerd. Fluorescerende dextran-conjugaten worden intraveneus geïnjecteerd om de vasculatuur te visualiseren en echografie-microbubbel geïnduceerde effecten te kwantificeren (bijv. lekkagekinetiek, vasculaire veranderingen). Dit artikel beschrijft de plaatsing van het schedelvenster, de plaatsing van de ringomvormer, de beeldvormingsprocedure, veelvoorkomende stappen voor probleemoplossing, evenals de voordelen en beperkingen van de methode.

Inleiding

Een belangrijke uitdaging bij de behandeling van neurologische aandoeningen is de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB). De BBB beperkt hydrofiele, geladen, polaire en grote (> 400 Da) moleculen van het binnendringen van het hersenparenchym1. Een methode die momenteel wordt gebruikt om therapieën over de BBB in het hersenparenchym te leveren, is het gebruik van stereotactische intracraniale ^injecties2. Andere minder invasieve methoden die worden onderzocht, worden gehinderd door de complexiteit van de gebruikte technieken, zoals het ontwerpen van geneesmiddelen voor receptorgemedieerde toediening over de ^BBB3, of zijn beperkt in de ruimtelijke precisie van gerichte gebieden, zoals intranasale ^injecties4 of toediening van hyperosmotische ^oplossingen5.

Het gebruik van echografie in combinatie met systemisch geïnjecteerde microbubbels, een echografiecontrastmiddel, is ontwikkeld als een niet-invasief middel om de permeabiliteit van de ^BBB6 tijdelijk te verhogen. Door gebruik te maken van een gerichte ^transducer7 of een bestuurbare gefaseerde reeks transducers8,9, kan echografie met millimeterniveau precisie worden gericht op geselecteerde gebieden in de hersenen, waardoor off-target effecten worden geminimaliseerd. Ultrasone microbubbelbehandelingen kunnen worden aangepast aan de hersenanatomie van elk onderwerp met behulp van magnetische resonantiebeeldvormingsbegeleiding7,10,11,12,13,14 of stereotactische ^frames15. Bovendien kan de mate van toename van de BBB-permeabiliteit in realtime worden gecontroleerd door akoestische emissies van microbubbels ^te monitoren16,17,18. Klinische onderzoeken naar de veiligheid en haalbaarheid van ultrasone microbubbelbehandelingen zijn momenteel wereldwijd aan de gang (bijv. ClinicalTrials.gov-identificatiecode NCT04118764).

Echografie-microbubbel BBB-behandelingen worden meestal geëvalueerd door het bevestigen van door de behandeling geïnduceerde toenames in BBB-permeabiliteit, gevisualiseerd in contrastversterkte magnetische resonantie beeldvorming, of door kleurstofexvasatie in in vivo beeldvorming of ex vivo histologie. De meeste microscopische analyses zijn echter ex vivo uitgevoerd, na de voltooiing van ultrasone microbubbelbehandelingen11,19, waardoor de dynamische biologische reacties tijdens en onmiddellijk na echografieblootstelling ontbreken. Real-time beeldvorming uitgevoerd tijdens ultrasone blootstelling kan helpen bij het begrijpen van de mechanismen die echografie-microbubbel BBB-behandelingen aansturen, evenals stroomafwaartse reacties, wat ons begrip van de therapeutische toepassingen ervan kan vergroten. Bovendien zou het gebruik van chronische schedelvensters met in vivo beeldvormingstechnieken longitudinale studies mogelijk maken om temporele aspecten van ultrasone microbubbelbehandelingen te evalueren.

Het doel van dit protocol is om de chirurgische en technische procedures te beschrijven die nodig zijn om real-time multifotonen beeldvorming uit te voeren van ultrasone microbubbelbehandelingen voor acute en chronische studies bij knaagdieren (figuur 1). Dit wordt in twee delen bereikt: ten eerste om een schedelvenster te creëren om in vivo beeldvorming mogelijk te maken, en ten tweede om een ringtransducer aan de bovenkant te monteren om gelijktijdige ultrasoonapparaat en beeldvorming mogelijk te maken. Craniale vensters zijn op grote schaal gebruikt door neurowetenschappers voor in vivo beeldvorming van neurovasculaire ^koppeling20, β-amyloïde pathogenese21 en neuro-immunologie22, onder anderen. In dit protocol worden chirurgische procedures beschreven voor het creëren van acute (niet-herstel) en chronische (herstel) schedelvensters in de schedel van muis en rat. Craniale venstermethodologieën, met name voor chronische experimenten, zijn goed gedocumenteerd23,24,25. Om in overeenstemming te zijn met de bestaande literatuur, zullen de termen 'acuut' en 'chronisch' in dit protocol worden gebruikt. Het ontwerp van ringtransducers voor in vivo beeldvorming is ook eerder ^beschreven26. Ondanks de beschikbaarheid van deze technieken en de inzichten die kunnen worden verkregen uit real-time beeldvorming van ultrasone microbubbelbehandelingen, zijn er maar weinig onderzoekslaboratoria die met succes literatuur hebben gepubliceerd met behulp van deze techniek26,27,28,29,30,31,32 . Als zodanig worden in dit protocol de chirurgische en technische details van het uitvoeren van deze real-time echografie-microbubbelexperimenten beschreven. Hoewel de gespecificeerde ultrasoonapparaat- en beeldvormingsparameters zijn geoptimaliseerd voor BBB-experimenten, kunnen andere effecten van ultrasone blootstelling aan de hersenen, zoals ^{neuromodulatie33,34}, β-amyloïde plaquemonitoring31 en immuuncelresponsen32, ook worden onderzocht met behulp van deze techniek.

Protocol

Alle volgende experimentele procedures werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de Noorse Autoriteit voor Voedsel en Veiligheid, het Animal Care Committee van het Sunnybrook Research Institute en de Canadian Council on Animal Care.

1. Materiaalvoorbereiding

1. Bereid de materialen voor die nodig zijn voor de craniale raamchirurgie en ultrasone microbubbelbehandelingen. Voor chronische schedelvensters, gesteriliseerde gereedschappen en materialen zijn een steriele chirurgische ruimte en pre- en postoperatieve toediening van geneesmiddelen noodzakelijk23,24,25.
2. Voorbereiding van transducer en coverslip
   1. Controleer de fysieke integriteit van de transducer: zoek naar scheuren en deuken. Zorg ervoor dat de elektroden aan de boven- en zijkant van de transducer intact zijn.
   2. Deponeer cyanoacrylaatlijm in een kleine schaal. Gebruik een applicator om een dunne laag lijm op het oppervlak van de transducer te smeren.
   3. Plaats de transducer op de glazen afdekplaat. Druk stevig aan voor 20-30 s.
      OPMERKING: Een 3D-geprinte mal kan worden gebruikt om de uitlijning van de glazen afdekplaat met de ringomvormer te vergemakkelijken, waardoor een stevige en gelijkmatige druk op de afdekplaat en ringomvormer wordt gegarandeerd (figuur 2).
   4. Controleer op bubbels tussen de transducer en de coverslip. Als er bubbels zijn, haal dan de coverslip eraf en herhaal vanaf stap 1.2.3., omdat lucht de ultrasone voortplanting belemmert. Laat 's nachts uitharden bij kamertemperatuur.
   5. Zodra u op een glazen afdekplaat bent bevestigd, past u de transducer af (figuur 3).
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een in eigen huis vervaardigde lood zirkonaat titanaat ringomvormer (10 mm buitendiameter, 1,4 mm dikte, 1,2 mm hoogte)³⁵, afgestemd op een 50 Ω impedantie en 0° fasebelasting met een aangepast matching circuit. De transducer wordt aangedreven op 0,82 MHz in diktemodus, waardoor een cirkelvormige brandpuntspunt ontstaat op ongeveer 1 mm onder de afdekplaat. Ringomvormers met vergelijkbare eigenschappen (10 mm buitendiameter, 1,5 mm dikte, 1,1 mm hoogte) zijn gekarakteriseerd26 en op grote schaal gebruikt voor multifotonenmicroscopie-experimenten27,28,29,31,32,36.
3. Hergebruik van de transducer en vervanging van de afdekplaat
   1. Vervang de afdekplaat als deze is gebarsten of vuil bevat (bijv. Bont, lijm) van het vorige experiment. Om de coverslip te verwijderen, lost u de lijm op door de transducer en coverslip gedurende 20 minuten in aceton onder te dompelen.
      OPMERKING: Aceton kan de integriteit van de transducer en/of elektroden aantasten. Neem contact op met de fabrikant voordat u doorgaat met deze stap.
   2. Controleer of de aceton de lijm heeft opgelost door voorzichtig met een tang aan de deklip te trekken. Controleer eenmaal per 10 minuten om langdurige blootstelling aan aceton te voorkomen.

2. Dierlijke bereiding

1. Verdoof het dier met behulp van een mix van medische lucht, zuurstof en isofluraan in een inductiekamer.
   OPMERKING: Van het gebruik van zuurstof als dragergas is gemeld dat het de halfwaardetijd van microbubbels ^{beïnvloedt37,38} en de omvang van door echografie-microbubbels geïnduceerde toenames van BBB-permeabiliteit ^vermindert27, maar kan ook het risico op hypoxie en mortaliteit ^{verminderen39}. Kies dragergassen op basis van projectdoelen en advies van dierenartsen. Injecteerbare anesthetica zoals een ketamine / xylazine cocktail kunnen ook worden gebruikt; het is echter gemakkelijker om het niveau van anesthesie en bloedzuurstofniveaus te regelen bij het gebruik van inhaleerbare anesthetica.
2. Controleer of het dier een voldoende niveau van anesthesie heeft bereikt door een teenknijp uit te voeren. Weeg het dier om de dosering van dextran, microbubbels en medicijnen te bepalen. Verwijder de vacht van het hoofd van het dier en plaats het dier op een stereotactisch frame.
3. Voor acute experimenten moet toegang tot de systemische circulatie worden vastgesteld voor dextran- en microbubbelinjecties. Om dit te bereiken, plaatst u een katheter van 27 g in een staartader.
   OPMERKING: Hoewel retro-orbitale injecties ook mogelijk zijn, worden staartaders aanbevolen vanwege de beperkte werkruimte in het hoofdgebied tijdens multifoton-beeldvorming.
4. Breng het dier over op het stereotactische frame en schakel de anesthesie naar de neuskegel. Houd de kerntemperatuur van het dier op 37 °C met behulp van een warmtebron, zoals een verwarmingskussen of een handschoen gevuld met warm water.
5. Bewaak de temperatuur van het dier met behulp van een rectale sonde en de dierfysiologie met behulp van een pulsoximeter. Breng oogheelkundige zalf aan. Injecteer geschikte pijnstillende en/of ontstekingsremmende geneesmiddelen vóór de operatie (zie Materiaaltabel).
6. Controleer voordat u met de schedelvensteroperatie begint het niveau van anesthesie en de hartslag, _{O2-verzadiging} , ademhalingsfrequentie en temperatuur van het dier.
7. Om de schedelraamoperatie te beginnen, verwijdert u de vacht op het hoofd door een ontharingscrème aan te brengen en / of bontknippers te gebruiken. Verwijder de vacht van tussen de ogen naar de voorste helft van de nek (figuur 4A).
   OPMERKING: Langdurig contact met de ontharingscrème zal de huid verbranden. Voor chronische craniale raamoperaties, was de hoofdhuid met afwisselende doekjes van betadine en 70% EtOH na het verwijderen van de vacht. Bereid de chirurgische ruimte voor op steriele chirurgie. De steriliteit moet worden gehandhaafd tot stap 2.15.
8. Om de hoofdhuid te verwijderen, tilt u de huid tussen de ogen op met behulp van een tang die in de niet-dominante hand wordt gehouden, langs de sagittale hechting. Verwijder met een gebogen schaar de huid om de pariëtale botten bloot te leggen (figuur 4B). Oefen stevige druk uit met een wattenstaafje als er bloedingen zijn uit de schedel of hoofdhuid; het bloeden moet worden gestopt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
   OPMERKING: Voor acute operaties kan de huid naar achteren worden geduwd en aan de schedel worden gehecht met behulp van vloeibare cyanoacrylaatlijm of weefsellijm.
9. Verwijder het botvlies dat het buitenoppervlak van de schedel bedekt met wattenstaafjes.
10. Schets met behulp van een operatiemicroscoop (6-25x) en een tandartsboor (0,5 mm boorbraam, gemiddelde snelheid) een cirkel op het pariëtale bot om de gewenste locatie van het schedelvenster op de schedel te markeren (figuur 5). Vermijd de sagittale hechting, lambda en bregma, omdat deze gebieden dunner zijn en grote bloedvaten bedekken.
    OPMERKING: Om het boren te vergemakkelijken, kan een omtrek van het schedelvenster op de schedel worden getekend met behulp van een marker en stencil (figuur 5A). Voor ratten kan het gemakkelijker zijn om een rechthoekig, in plaats van een cirkelvormig, schedelvenster te boren. Vanwege de dikte van het schedelbot van de rat, gebruikt u een boor van 0,7 mm om het schedelvenster in het compacte bot te schetsen voordat u een boor van 0,5 mm gebruikt om het boorproces te voltooien.
11. Oefen zachte druk uit met de boor; overmatige druk verhoogt het risico op het veroorzaken van schade aan hersenweefsel. Om te voorkomen dat de schedel oververhit raakt tijdens het boren, druppelt u zoutoplossing op de schedel met behulp van een spuit of brengt u een stuk chirurgische spons aan dat is gedrenkt in zoutoplossing.
12. Wissel af tussen het boren en afkoelen van de schedel totdat het resulterende boteiland zich scheidt van de rest van de schedel. Controleer de voortgang van het boren door zachte druk uit te oefenen op het boteiland met behulp van een tang of de boor. Ga door met boren totdat het boteiland zich scheidt van de rest van de schedel.
    OPMERKING: Kleine scheuren in de dunste delen van de schedel zijn een goede indicatie dat het boren bijna voltooid is. Een poging om het boteiland voortijdig te verwijderen, kan ervoor zorgen dat stukjes bot in het hersenweefsel doordringen, de dura beschadigen en ontstekingen en bloedingen veroorzaken.
13. Verwijder het boteiland door met een fijne tang de randen of de bovenste compacte botlaag van het boteiland vast te pakken (figuur 6A). Zorg ervoor dat de hersenen vochtig worden gehouden door een stuk chirurgische spons aan te brengen dat vooraf is gedrenkt in zoutoplossing. Als bloeding wordt waargenomen, plaats dan de chirurgische spons op het gebied dat bloedt. Ga niet verder met de volgende stap totdat het bloeden is gestopt.
    OPMERKING: Als de bloeding na 5 minuten aanhoudt, kan het dier niet worden gebruikt voor multifotonenbeeldvormingsexperimenten. Voor ratten kan het nodig zijn om de dura te verwijderen als deze dik is. Om de dura te verwijderen, gebruikt u een hoge vergroting op de operatiemicroscoop en een fijne tang.
14. Om een schedelraam te plaatsen, pakt u een glazen afdekplaat met een tang, plaatst u een druppel zoutoplossing aan één kant en manoeuvreert u deze over het gat in de schedel. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de deklip zitten.
    OPMERKING: Gebruik een glazen afdekplaat van 5 mm voor muizen en 8 mm voor ratten. Voor ratten, vanwege de dikte van het schedelbot, gebruik een agarose-oplossing in plaats van zoutoplossing om de ruimte tussen de coverslip en de hersenen op te vullen. De transducer en zijn coverslip kunnen ook direct op de schedel worden geplakt, in plaats van een aparte coverslip voor het schedelvenster te gebruiken. Ga voor deze optie verder met stap 3.1. Raadpleeg figuur 1 voor meer informatie.
15. Verdeel een laag cyanoacrylaatlijm rond de omtrek van de deklip (figuur 6B) om deze aan de schedel te bevestigen. Zorg ervoor dat er geen lijm onder de deklip zit. Oefen druk uit op de coverslip om ervoor te zorgen dat lijm niet in contact komt met de hersenen.
16. Zodra de lijm volledig droog is, egaliseert u het oppervlak van de lijm met behulp van de tandartsboor. Zorg ervoor dat al het lijmresten uit het operatiegebied worden verwijderd.
    OPMERKING: Injecteer voor chronische schedelvensters de nodige postoperatieve geneesmiddelen (zie Tabel met materialen), zorg voor zalf voor wondverzorging en zacht voedsel en herstel het dier onder een warmtelamp.

3. Plaatsing van de ringomvormer

1. Bereid de 1% (w/v) agarose-oplossing. Voeg in een klein bekerglas of erlenmeyer 0,1 g agarose en 10 ml PBS (1x) of zoutoplossing toe. Kook de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost door het bekerglas op een kookplaat te plaatsen of de oplossing in een magnetron (30-45 s) te verwarmen.
2. Stap 3.2-3.5 zijn tijdgevoelig omdat de agarose-oplossing snel afkoelt. Zuig ~ 0,5 ml agarose op in een spuit van 1 ml.
   OPMERKING: Om de integriteit van de hersenen te beschermen, moet u ervoor zorgen dat de temperatuur van de agarose de lichaamstemperatuur vóór gebruik benadert.
3. Deponeer de agarose royaal op de deklip van het schedelraam.
   OPMERKING: Als het weefsel blancheert, was de temperatuur van de agarose te hoog; het dier moet worden geëuthanaseerd. Als er geen afzonderlijke coverslip is die de hersenen bedekt (d.w.z. de transducer en zijn coverslip worden rechtstreeks op de hersenen geplaatst, zie stap 2.14), dan moet agarose in deze stap op het oppervlak van de hersenen worden afgezet.
4. Plaats de transducer over het schedelvenster (figuur 6C). Oefen stevige druk uit zodat er minimale agarose is tussen de transducer en het schedelvenster. Zorg ervoor dat de transducer gecentreerd (XY-vlak) en parallel (Z-vlak) is aan het schedelvenster en dat er geen luchtbellen in de agarose zijn.
5. Wanneer de agarose is afgekoeld tot een jello-achtige consistentie, snijdt u overtollige agarose weg van de omtrek van de deklip van de transducer met behulp van een spatel of scalpel. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de afdekplaat van de transducer zitten.
6. Verspreid met behulp van een spatel een laag cyanoacrylaatlijm over de omtrek van de deklip van de transducer, die zich uitstrekt tot de schedel, zodat de transducer stevig aan de schedel is gehecht.
7. Houd stevige druk op de transducer totdat de lijm volledig is opgedroogd (10-15 min).

4. Multifoton microscopie beeldvorming

1. Plaats het dier onder de objectieflens (figuur 7A). Zorg ervoor dat de objectieflens gecentreerd is in de ringomvormer en evenwijdig aan de transducer (figuur 7B). Als een objectief in water wordt gebruikt, vult u het midden van de ringomvormer met gedeïoniseerd en ontgast water.
   OPMERKING: Ontgast water is belangrijk voor een goede ultrasone voortplanting.
2. Begin met de objectieflens in de hoogste positie en laat de objectieflens langzaam zakken totdat deze zich in de ringomvormer bevindt (figuur 7A, B). Zorg ervoor dat de objectieflens niet botst met de transducer of coverslip.
   OPMERKING: Wissel af tussen het oculair om te controleren of de Z-positie van de objectieflens zich in het vlak met het oppervlak van de hersenen bevindt, en met het oog om ervoor te zorgen dat de objectieflens niet botst met de transducer of coverslip. Het kan gemakkelijker zijn om de piale vaten door het oculair te visualiseren na injectie van fluorescerende dextran door de staartader (figuur 7C).
3. Bereid de multifotonenmicroscoop voor op beeldvorming.
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een rechtopstaande multifotonenmicroscoop en een 20-25x objectieflens met een werkafstand van 2 mm, wat voldoende is om voorbij de coverslip (en) scherp te stellen in het hersenparenchym.
4. Bereid de dextran voor. Voeg de juiste hoeveelheid PBS toe aan de injectieflacon met dextran, volgens de instructies van de fabrikant. Vortex de dextran-oplossing gedurende 1-3 minuten om ervoor te zorgen dat het dextranpoeder volledig is opgelost. Injecteer de dextran-oplossing in de staartader.
5. Een afbeeldingsscan instellen
   1. Zorg er met behulp van de oculairs voor dat de objectieflens evenwijdig is aan de hersenen. Kantel het dier om te corrigeren voor XZ- en YZ-uitlijningen.
   2. Selecteer een gezichtsveld in een multifotonenmicroscoop. Stel een XYZ-scan in vóór blootstelling aan echografie om een basislijnbeeld van de vasculatuur te hebben voorafgaand aan echografieblootstelling.
      OPMERKING: Typische beeldvormingsparameters zijn als volgt: 300-800 μm diep, 2-5 μm stapgrootte en 10-20 tijdstacks. Zorg ervoor dat de objectieflens niet in contact komt met de transducer of coverslip op het laagste punt tijdens de beeldsequentie.

5. Blootstelling aan echografie

1. Zorg ervoor dat alle BNC-kabels correct zijn aangesloten (figuur 3).
2. Stel een XYZT-beeldscan in die lang genoeg is om beeldstapels vast te leggen voor, tijdens en na ultrasone microbubbelbehandelingen.
3. Bereid de microbubbels voor door de instructies van de fabrikant te volgen. Injecteer de microbubbels in de staartader en begin met beeldvorming.
   OPMERKING: Microbubbelinjecties kunnen worden gedaan met een infusiepomp om een consistente injectiesnelheid te garanderen en om gelijktijdige microbubbelinjectie en beeldvorming mogelijk te maken. Als microbubbels tijdens het afbeelden moeten worden geïnjecteerd, moet u ervoor zorgen dat de staartader gemakkelijk toegankelijk is zonder de detectoren bloot te stellen aan omgevingslicht.
4. Begin met ultrasoonapparaat.
   OPMERKING: Typische ultrasoonapparaatparameters zijn als volgt: cycli van 10 ms, mechanische index van 0,2-0,4 en pulsherhalingsfrequenties tussen 1-4 Hz. Sonicatie- en microbubbelparameters die worden gebruikt in preklinische echografie-microbubbelstudies zijn uitgebreid bestudeerd en zijn goed gedocumenteerd in de literatuur (zie bijvoorbeeld ⁴⁰ voor een overzicht).
5. Ga door met multifoton-beeldvorming gedurende de duur van de ultrasoonapparaat en na het einde van de ultrasoonapparaat. Wees oplettend voor dextran extravasatie uit bloedvaten, omdat dit wijst op een toename van de BBB-permeabiliteit.
   OPMERKING: Als dextran wordt gedetecteerd in de extravasculaire ruimte, maar in de periferie van het gezichtsveld, kunnen er aangetaste bloedvaten buiten het gezichtsveld zijn. Dit kan het gevolg zijn van een verkeerde uitlijning van de transducer met de focus van de objectieflens. In dit scenario is het gemakkelijker om het gezichtsveld aan te passen door de objectieflens te bewegen of door het dier te verplaatsen, dan om de transducer opnieuw uit te lijnen.
6. Zodra de beeldvorming is voltooid, euthanaseer het dier cervicale dislocatie onder diepe anesthesie of CO2-verstikking. Voor chronische schedelvensters verspreidt u een laag tandcement op de blootgestelde schedel.
   OPMERKING: Voor chronische schedelvensters kan de huid rond het venster worden gehecht, hoewel dit niet nodig is, vanwege het verwijderen van de hoofdhuid in stap 2.8.

6. Beeldanalyse

1. Afbeeldingsstapels exporteren.
2. Analyseer afbeeldingen met beeldanalysesoftware (bijv. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) en/of programmeertools (bijv. Python, MATLAB).

Resultaten

Succesvolle ultrasone microbubbelbehandelingen kunnen worden gedetecteerd door de extravasatie van fluorescerend dextran van het intravasculair naar de extravasculaire ruimte (figuur 8), wat wijst op een toename van de BBB-permeabiliteit. Afhankelijk van het drukveld van de ringomvormer worden piale vaten en/of haarvaten aangetast.

Om de vasculaire veranderingen geïnduceerd door ultrasone microbubbelbehandelingen te evalueren, kan de diameter van het vat van belang worden gemeten voor, tijdens en na echografie-microbubbelbehandeling (figuur 9). Dit kan handmatig worden gedaan in een in de handel verkrijgbare software (bijv. Olympus Fluoview-software). Tijdens beeldacquisitie kunnen bolus dextran-injecties en lijnscans ook worden gebruikt om de bloedstroom te ^{beoordelen30,41}. Om de kinetiek van dextranlekkage te evalueren als een representatief model voor medicijnafgifte, kan de signaalintensiteit tussen de intra- en extravasculaire ruimten worden geëvalueerd met behulp van hulpmiddelen zoals MATLAB26,27,29,41 (figuur 10).

Verdere beeldverwerking kan worden bereikt met behulp van ImageJ / FIJI. ImageJ/FIJI is een open-source software die compatibel is met MATLAB en zeer geschikt is om algemene analyses uit te voeren in biologische beeldanalyse, zoals het meten van vasculaire veranderingen, of de lengte van of afstand tussen fluorescerende objecten (bijvoorbeeld β-amyloïde plaques aan bloedvaten). Beeldverwerkingspijplijnen die in ImageJ/FIJI zijn gemaakt, kunnen worden geautomatiseerd door aangepaste macro's te schrijven.

Complexere analyses, zoals 3D-segmentatie van bloedvaten en celtracking, kunnen worden bereikt met behulp van meer geavanceerde, semi-geautomatiseerde software (figuur 11). Na segmentatie kunnen meer specifieke analyses worden uitgevoerd, zoals het classificeren van bloedvaten als arteriolen, venules of haarvaten, op basis van diameter, vertakking, tortuositeitspatronen en ^{stroomrichting42,43}. Machine learning-algoritmen zijn ook ontwikkeld om bloedvatsegmentatie te ^{automatiseren22,44}.

Figuur 1: Algemene workflow van intravitale multifoton echografie-microbubbel hersenexperimenten. Een algemene workflow van de intravitale multifoton echografie-microbubbel hersenexperimenten beschreven in dit protocol wordt getoond. Er zijn 6 stappen: (A) Diervoorbereiding voor (A1) muizen en (A2) ratten, (B) Dextran injectie, (C) Microbubbel injectie, (D) Pre-treatment imaging, (E) Treatment and imaging, (F) Post-treatment imaging en data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Doorsnede en bovenaanzicht van 3D-geprinte mal. (A) Doorsnede van de mal. Een dunne laag cyanoacrylaatlijm wordt aangebracht op het bovenoppervlak van de ringomvormer en er wordt een coverslip bovenop geplaatst. Een stempel kan worden gebruikt om stevige, gelijkmatige druk uit te oefenen op de deklip en ringomvormer. (B) Bovenaanzicht van de mal. Een inkeping kan in de mal worden toegevoegd om het verwijderen van de voorbereide transducer te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Echografie opstelling. Typische hardware voor ultrasone experimenten worden getoond. Ultrasone parameters worden ingesteld en geactiveerd door de signaalgenerator en versterkt door de versterker. Een vermogensmeter kan worden gebruikt om voorwaartse en gereflecteerde vermogens op te nemen voordat het signaal naar de bijpassende box wordt verzonden, die is afgestemd op de transducer. Alle verbindingen worden bereikt met behulp van BNC-kabels, tenzij anders vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gebied van vachtverwijdering en hoofdhuidverwijdering. (A) Vachtverwijdering moet beginnen tussen de ogen en zich uitstrekken tot de voorste helft van de nek. (B) Hoofdhuidverwijdering moet voldoende zijn om de pariëtale botten bloot te leggen. Het bloeden moet worden gestopt voordat u doorgaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Omtrek van het schedelvenster. Het schedelraam bevindt zich op een pariëtaal bot. (A) Een omtrek van het schedelvenster kan op de schedel worden getekend om te helpen bij het boorproces. (B) De omtrek van het schedelvenster is te zien na het boren door het compacte bot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Craniale venster en transducer uitlijning. (A) Het schedelvenster wordt gemaakt op een pariëtaal bot. Het boteiland is verwijderd, waardoor de hersenen eronder bloot komen te liggen. (B) Het schedelvenster is compleet wanneer een glazen afdekkingslip op de schedel wordt afgedicht met cyanoacrylaatlijm. (C) De transducer is gecentreerd op het schedelvenster en gehecht met behulp van cyanoacrylaatlijm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Positionering van objectieflens en transducer. (A,B) De objectieflens is gecentreerd op de ringomvormer. (C) Bloedvaten gevuld met fluorescerend dextran zijn zichtbaar door de oculairs, onder epifluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Maximale projectie multifoton beelden van echo-microbubbel geïnduceerde verhogingen van BBB permeabiliteit. Maximale projectiebeelden van vasculatuur (A) voor en (B) na echo-microbubbelbehandelingen. Succesvolle ultrasone microbubbelbehandelingen kunnen worden bevestigd door het observeren van toenames in BBB-permeabiliteit na behandeling, gevisualiseerd als fluorescerende dextran-extravasatie (pijlen). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Analyse van vasomodulatie geïnduceerd door ultrasone microbubbelbehandelingen. Maximale projectiebeelden van cerebrale bloedvaten voor, tijdens en na echo-microbubbelbehandelingen. Microbubbels zijn aanwezig in alle afbeeldingen. In vergelijking met (A) voorbehandelingsomstandigheden kan duidelijke vasomodulatie worden waargenomen (B) tijdens ultrasone microbubbelbehandelingen (rode pijlen). Echo-microbubbel gemedieerde verhogingen van de BBB-permeabiliteit zijn ook duidelijk na behandeling van de lekkage van fluorescerend dextran van het intravasculaire naar de extravasculaire ruimte (gele pijlen). (C) Wanneer echografie is uitgeschakeld, keren de vasculaire diameters terug naar de voorbehandeling, basislijngroottes. (D) Vasculaire veranderingen kunnen worden geanalyseerd door de diameter van het vat van belang voor, tijdens en na echografie-microbubbelbehandeling uit te zetten. Schaalbalk: 100 μm. (Ongepubliceerd werk). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Analyse van de lekkinetiek na ultrasone microbubbelbehandelingen. Toename van de BBB-permeabiliteit wordt gevisualiseerd als lekkage van fluorescerend dextran van de intravasculaire naar de extravasculaire ruimte. Veranderingen in BBB-permeabiliteit zijn duidelijk bij het vergelijken van beeldstapels die zijn verkregen (A) vóór en (B) na ultrasone microbubbelbehandelingen. (C) Lekkinetiek kan worden geanalyseerd door de intensiteit, het volume en de snelheid van dextran in extravasculaire compartimenten (gele rechthoek) te volgen. Schaalbalk: 50 μm. (Ongepubliceerd werk.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Bloedvatsegmentatie van multifotonenmicroscopie XYZ-stack. (A) Diepte (XYZ) stapel bloedvaten in een transgene EGFP-rat. Bloedvaten worden gevisualiseerd via intraveneuze injectie van fluorescerende Texas Red 70 kDa dextran (rood). Het groene kanaal toont fluorescerende cellen en weefselautofluorescentie. (B) 3D-reconstructies van bloedvaten worden gemaakt en vervolgens kleurgecodeerd volgens het bloedvattype om typespecifieke analyses te vergemakkelijken. Aderen/venules zijn blauw, slagaders/arteriolen zijn rood en haarvaten zijn cyaan. Schaalbalk: 50 μm. Reconstructies gemaakt met Bitplane Imaris. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Intravitale multifoton microscopie monitoring van de hersenen is een waardevol hulpmiddel om hersenreacties te bestuderen tijdens echografie blootstelling. Voor zover wij weten, is het hier beschreven protocol de enige methode voor het uitvoeren van multifoton microscopie beeldvorming van het hersenparenchym tijdens echo-microbubbelbehandelingen. De creatie van schedelvensters en het gebruik van ringtransducers maken real-time monitoring mogelijk van vasculaire, cellulaire en andere stroomafwaartse reacties op ultrasone microbubbelbehandelingen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Andere groepen hebben multifotonenmicroscopiebeeldvorming uitgevoerd na de voltooiing van echografie-microbubbelbehandelingen, waardoor de real-time respons van het hersenparenchym op behandelingen ^{wordt gemist19}. De beschreven procedure biedt verbeterde temporele controle, waardoor gegevens kunnen worden verzameld die kunnen helpen bij het verlichten van de acute mechanismen achter ultrasone microbubbelbehandelingen. Kwantitatieve en kwalitatieve gegevens kunnen worden geëxtraheerd en geanalyseerd uit de verkregen beeldstapels, zoals extravasatiekinetiek27,29,30, veranderingen in β-amyloïde ^{plaquevolume31} en ^{celdynamica32}.

Verschillende stappen voor probleemoplossing zijn in het hele protocol gemarkeerd. Ten eerste werden chirurgische stappen benadrukt die bijzonder gevoelig zijn voor bedieningsfouten, zoals het gebruik van agarose tijdens craniale raamchirurgie en plaatsing van de transducer. Stappen om ongemak en dood bij dieren te voorkomen werden ook verstrekt, waaronder het monitoren van de dierfysiologie tijdens de operatie en het grondig vortexen van de dextran voorafgaand aan de injectie. Ten tweede werden ook fysieke specificaties van de transducer en de uitlijning van de objectieflens, transducer en schedelvenster benadrukt. De specificaties van de ringomvormer en de akoestische eigenschappen ervan moeten worden bepaald met inachtneming van de gebruikte objectieflens en het diermodel. In het bijzonder moet de binnendiameter van de ringomvormer groot genoeg zijn om de objectieflens te omringen, maar klein genoeg om veilig op de schedel van het dier te worden gemonteerd. Bovendien moet het brandpuntsgebied van de transducer worden uitgelijnd met het bereik van de gebruikte objectieflens.

Een veel voorkomende uitdaging is dat het schedelvenster en de ringomvormer onder een hoek staan ten opzichte van de objectieflens. Een goede centrering (XY) en uitlijning (Z) van de objectieflens met het schedelvenster en de transducer zorgt ervoor dat het brandpuntsgebied van de transducer, en dus het gebied van behandeld hersenweefsel, uitlijnt met het beeldveld van de beeldvorming en vermindert het risico op botsing tussen de objectieflens en de transducer tijdens het fotograferen. Uitlijning kan worden bereikt door de koppositie van het dier aan te passen en/of door het stereotactische frame waarin het is bevestigd te draaien.

Microscoopcomponenten (bijv. detectoren, bundelsplitsers) en beeldacquisitieparameters moeten worden geselecteerd op basis van het doel van het onderzoek. Hierbij wordt een objectieflens met een lange brandpuntsafstand (> 2 mm) gebruikt vanwege de aanwezigheid van de coverslip(s) en ringomvormer tussen de objectieflens en de hersenen. Een rechtopstaande microscoop wordt ook aanbevolen omdat deze meer ruimte biedt om het dier te manoeuvreren, met name voor hersenexperimenten. Om de kinetiek van door echografie-microbubbel geïnduceerde lekkage van de intravasculaire kleurstof vast te leggen, is een hoge temporele resolutie gunstig, die kan worden bereikt met behulp van een resonantiescansysteem. Door dit te combineren met een detectiesysteem met hoge gevoeligheid, zoals galliumarsenidefosfide (GaAsP) detectoren, zullen ook gunstigere beelden worden verkregen.

De gepresenteerde experimentele procedure heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is de chirurgische procedure vrij invasief en is gemeld dat het ontsteking ^{veroorzaakt45}, hoewel ontsteking kan worden geminimaliseerd46. Bovendien werd waargenomen dat immuunresponsen geïnduceerd door craniale raamoperaties 2-4 weken na de operatie verdwenen23,24,25. Bovendien kan het boorproces, vooral wanneer het met overmatige kracht of snelheid wordt uitgevoerd, schade aan het onderliggende weefsel veroorzaken als gevolg van de opwekking van warmte, trillingen en uitgeoefende druk. Craniale raamoperaties en multifoton beeldvorming zijn ook waargenomen om de hersentemperatuur te ^{beïnvloeden47}. Deze beperkingen kunnen tot op zekere hoogte worden verminderd door zorgvuldige creatie van ongerepte schedelramen, een goed herstel van dieren met chronische schedelramen en handhaving van de normotherme lichaamstemperatuur met behulp van een verwarmingsbron met feedbackregeling. Ten tweede wordt de beelddiepte beperkt door de gebruikte microscoop en objectieflens. Het effect van ultrasone microbubbelbehandeling in diepere hersenstructuren, zoals de hippocampus, kan bijvoorbeeld niet worden bestudeerd zonder meer invasieve maatregelen, zoals het verwijderen van bovenliggend corticale ^weefsel48, of het gebruik van microlenzen in combinatie met corticale ^penetratie49. Het gebruik van een objectieflens met een lange werkafstand zou dit probleem tot op zekere hoogte kunnen oplossen, maar de lichtpenetratie is ook beperkt op grotere diepten.

Hoewel de representatieve beelden van dit protocol zijn verkregen van wildtype knaagdieren, kan de gepresenteerde experimentele procedure ook worden toegepast op transgene dieren en ziektemodellen, zoals de ziekte van ^Alzheimer31. Ultrasone experimenten die geen verband houden met BBB-modulatie, zoals echografie-geïnduceerde neuromodulatie, kunnen ook worden gevolgd met behulp van dit ^{protocol33,34}. Andere mogelijke toepassingen kunnen worden bereikt door verschillende microscoop- of detectoropstellingen te gebruiken, zoals het koppelen van een confocale microscoop met een ultrasnelle ^camera50. Hoewel fotobleaching en fototoxiciteit relatief slechter zijn in confocale microscopen vanwege het grote excitatievolume, kan ultrasnelle beeldvorming visualisatie van hersencapillaire endotheelcel-microbubbelinteracties met hoge temporele resolutie mogelijk maken, wat de mechanismen die echografie-microbubbel BBB-behandelingen aansturen verder zou kunnen verlichten. Tot slot biedt het beschreven protocol een methode om vasculaire en cellulaire effecten geïnduceerd door echo-microbubbel BBB-experimenten in realtime te volgen, een hulpmiddel om de mechanismen die deze behandelingen aansturen verder te bepalen, evenals het verlichten van de stroomafwaartse reacties van het hersenparenchym op ultrasone-microbubbelbehandelingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ring transducer plaatsing
Agarose (poeder)	Sigma-Aldrich	A9539
Beker of Erlenmeyer kolf (50 ml)	VWR	213-0462 of 214-1130
Cyanoacrylaatlijm (gel)	Loctite	1363589
Glazen dekglasjes (13 mm)	Thermo Fisher Scientific	CB00130RA120MNT0	Dekglas voor ring transducer.
Heet plaat of magnetron	Corning	PC-400D	Om agarose-oplossing te verwarmen.
PBS (1X)	Sigma-Aldrich	P4417
Ring transducer	Op maat gemaakt	Op maat gemaakt	Op maat gemaakt. Bijv. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518
Rubberen stop	VWR	217-0867
Voorbereiding van dieren en medicijnen
Bupivacaïne*A	Aspen	169912	Dosis: 1 mg/kg, s.c., lokaal verdovingsmiddel geïnjecteerd op de incisieplaats.
Buprenorfine*A	Indivior	521634	Muisdosis: 0,05-0,1 mg/kg, s.c., opioïde, toedienen voor de operatie.
Buprenorfine*A	Indivior	521634	Rattendosis: 0,01-0,05 mg/kg, s.c.
Carprofen*C	Pfizer	DIN 02255693	Dosis: 5 mg/kg, s.c., NSAID, toedienen na de operatie.
Ontharingscreme	Veet	N/A	Voor volledige pelsverwijdering na trimmen.
Dexamethason*C	Sandoz	DIN 00664227, 2301	Dosis: 3 mg/kg, i.m., corticosteroïde, vermindert hersenoedeem, toedienen voor de operatie.
Enrofloxacine*C	Bayer	DIN: 02249243	Dosis: 5 mg/kg, i.p., antibioticum, toedienen na de operatie.
Pelstrimmers	Aesculap	90200714	Exacta/Isis.
Verwarmingskussen	Physitemp Instruments INC	HP-1M
Isofluraan	Baxter	ESDG9623C	Dosis: 3% inductie, 1% onderhoud; verdovingsmiddel.
Meloxicam*A	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	25388	Muisdosis: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, toedienen voor de operatie.
Meloxicam*A	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	25388	Rattendosis: 1 mg/kg, s.c.
Pulsoximeter	STARR Life Sciences Corp	N/A	MouseOx.
Stereotactisch frame	Kopf	Kopf 900
Steriele oftalmische zalf	Théa	597562	Viscotears.
Zwaantjeskatheter (24 G)	BD Neoflon	391350
* Bespreek dosering en type toediening met dierenarts voor gebruik. A Voor acute vensteroperaties, C Voor chronische vensteroperaties. Dosis voor muizen en ratten is hetzelfde, tenzij anders gespecificeerd.
Materiaal en apparatuur voor plaatsing van hersenvenster
Alcoholwatten	BD	326895
Geboogde fijne chirurgische schaar	Fine Science Tools	14002-12
Katoenen of vezelvrije watten	Chemtronics	CX50
Cyanoacrylaatlijm (gel)	Loctite	1594457 (gel), 230992 (vloeibaar)	Indien niet beschikbaar, kan vloeibare cyanoacrylaatlijm worden gemengd met extra-fijn acrylaatpoeder.
Tandartslijm	Lang Dental	Jet Set-4 Denture Repair Package
Tandarts micromotor handboor	FOREDOM	K.1070-2	Hogesnelheids roterende micromotorset met 2,35 mm collet.
Pincet	Fine Science Tools	11152-10, 11370-40
Glazen dekglasjes	Thermo Fisher Scientific	CB00050RA120MNT0 (5 mm)	Muis hersenvensters.
Glazen dekglasjes	Thermo Fisher Scientific	CB00080RA120MNT0 (8 mm)	Ratten hersenvensters.
Microboortje (0,5 mm)	Meisinger	HM71005 (0,5 mm)
Microboortje (0,7 mm)	Meisinger	HM71007 (0,7 mm)
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ645
Chirurgische gelatine spons	Ethicon	MS0005
Vetbond weefselkleefstof	3M	1469SB
Weegschalen / -bakken	VWR	10803-148
* Autoclave doeken, gereedschappen, materialen en jassen, en gebruik steriele chirurgische handschoenen, voor chronische hersenvensteroperaties.
Multifotonmicroscopie
20x water-immersie objectief	Olympus	XLUMPLFLN20 XW	Numerieke opening 1,0, werkafstand 2,0 mm.
Fluorescent dextran (bijv. FITC 70 kDa)	Sigma Aldrich	46945	Aanbevolen 10 kDa-2 MDa.
MaiTai DeepSee Ti:Saffier laser oscillator	Spectra-Physics	N/A
SliceScope microscoop	Scientifica	N/A
Ultrasone behandeling
50 dB RF Versterker