Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van PCLS-muizenlongweefsel, wat resulteert in een geavanceerd driedimensionaal beeld van de pulmonale vasculatuur en de luchtwegen, die tot 10 dagen kunnen worden bewaard en die vatbaar zijn voor tal van procedures.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Precisie gesneden longplakken als een efficiënt hulpmiddel voor ex vivo longvatstructuur en contractiliteitsstudies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De visualisatie van murine longweefsel biedt waardevolle structurele en cellulaire informatie over de onderliggende luchtweg en vasculatuur. Het behoud van longvaten dat echt fysiologische omstandigheden vertegenwoordigt, brengt echter nog steeds uitdagingen met zich mee. Bovendien resulteert de delicate configuratie van muizenlongen in technische uitdagingen bij het voorbereiden van monsters voor beelden van hoge kwaliteit die zowel de cellulaire samenstelling als de architectuur behouden. Evenzo kunnen cellulaire contractiliteitstests worden uitgevoerd om het potentieel van cellen te bestuderen om in vitroop vasoconstrictoren te reageren , maar deze testen reproduceren niet de complexe omgeving van de intacte long. In tegenstelling tot deze technische problemen, kan de precisie-cut lung slice (PCLS) -methode worden toegepast als een efficiënt alternatief om longweefsel in drie dimensies te visualiseren zonder regionale vertekening en dienen als een live surrogaatcontractiliteitsmodel voor maximaal 10 dagen. Weefsel bereid met behulp van PCLS heeft een behouden structuur en ruimtelijke oriëntatie, waardoor het ideaal is om ziekteprocessen ex vivo te bestuderen. De locatie van endogene tdTomato-gelabelde cellen in PCLS geoogst uit een induceerbare tdTomato reporter murine model kan met succes worden gevisualiseerd door confocale microscopie. Na blootstelling aan vasoconstrictoren demonstreert PCLS het behoud van zowel vessel contractiliteit als longstructuur, die kan worden vastgelegd door een time-lapse module. In combinatie met de andere procedures, zoals western blot- en RNA-analyse, kan PCLS bijdragen aan het uitgebreide begrip van signaalcascades die ten grondslag liggen aan een breed scala aan aandoeningen en leiden tot een beter begrip van de pathofysiologie bij longvasculaire aandoeningen.
Inleiding
Vooruitgang in de voorbereiding en beeldvorming van longweefsel dat cellulaire componenten behoudt zonder de anatomische structuur op te offeren, biedt een gedetailleerd inzicht in longziekten. Het vermogen om eiwitten, RNA en andere biologische verbindingen te identificeren met behoud van fysiologische structuur biedt essentiële informatie over de ruimtelijke ordening van cellen die het begrip van de pathofysiologie bij tal van longziekten kan verbreden. Deze gedetailleerde beelden kunnen leiden tot een beter begrip van pulmonale vaatziekten, zoals pulmonale arterie hypertensie, wanneer toegepast op diermodellen, wat mogelijk kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Ondanks de technologische vooruitgang blijft het verkrijgen van hoogwaardige beelden van muizenlongweefsel een uitdaging. De ademhalingscyclus wordt aangedreven door een negatieve intrathoracale druk die wordt gegenereerd tijdens inademing1. Bij het traditioneel verkrijgen van biopsieën en het voorbereiden van longmonsters voor beeldvorming, gaat de negatieve drukgradiënt verloren, wat resulteert in de ineenstorting van de luchtweg en vasculatuur, die zichzelf niet langer in zijn huidige staat vertegenwoordigt. Om realistische beelden te krijgen die de huidige omstandigheden weerspiegelen, moeten de pulmonale luchtwegen opnieuw worden opgeblazen en de vasculatuur worden doordrenkt, waardoor de dynamische long in een statisch armatuur verandert. De toepassing van deze verschillende technieken maakt het behoud van structurele integriteit, pulmonale vasculatuur en cellulaire componenten mogelijk, inclusief immuuncellen zoals macrofagen, waardoor longweefsel zo dicht mogelijk bij zijn fysiologische toestand kan worden bekeken.
Precision cut lung slicing (PCLS) is een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van de anatomie en fysiologie van pulmonale vasculatuur2. PCLS biedt gedetailleerde beeldvorming van het longweefsel in drie dimensies met behoud van structurele en cellulaire componenten. PCLS is gebruikt in dier- en menselijke modellen om levende beelden met hoge resolutie van cellulaire functies in drie dimensies mogelijk te maken, waardoor het een ideaal hulpmiddel is om potentiële therapeutische doelen te bestuderen, kleine luchtwegcontractie te meten en de pathofysiologie van chronische longziekten zoals COPD, ILD en longkanker te bestuderen3. Met behulp van vergelijkbare technieken kan de blootstelling van PCLS-monsters aan vasoconstrictoren de longstructuur en vatcontractiliteit behouden, waardoor in vitro omstandigheden worden gerepliceert. Naast het behoud van contractiliteit, kunnen voorbereide monsters aanvullende analyses ondergaan, zoals RNA-sequencing, Western blot en flowcytometrie wanneer ze correct worden bereid. Ten slotte kunnen reporter kleur gelabelde cellen gemarkeerd met tdTomato-fluorescentie na longoogst de etikettering behouden na het bereiden van microslices, waardoor het ideaal is voor celvolgstudies. De integratie van deze technieken biedt een geavanceerd model met behoud van de ruimtelijke ordening van cellen en vatcontractiliteit die kan leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de signaalcascades en potentiële therapeutische opties bij pulmonale vasculatuurziekte.
In dit manuscript wordt PCLS-muizenlongweefsel blootgesteld aan vasoconstrictoren, wat een behouden structurele integriteit en vatcontractiliteit aantoont. De studie toont aan dat het weefsel dat op de juiste manier is voorbereid en behandeld, 10 dagen levensvatbaar kan blijven. De studie toont ook het behoud van cellen met endogene fluorescentie (tdTomato), waardoor monsters beelden met hoge resolutie van de pulmonale vasculatuur en architectuur kunnen leveren. Ten slotte zijn manieren beschreven om weefselplakken te hanteren en voor te bereiden voor RNA-meting en Western blot om onderliggende mechanismen te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van het Boston Children's Hospital en de door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocollen. De muizen die in deze studie worden gebruikt, zijn wilde type C57 / B6-muizen en Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato gekruiste muizen.
1. Bereiding van oplossingen
- Bereid fosfaatbufferoplossing (1x PBS) en 2% agarose-oplossing die nodig zijn tijdens het experiment van tevoren.
- Meng 2 g agarosepoeder in 100 ml geautoclaveerd water. Verwarm het een paar seconden per keer in de magnetron totdat de oplossing helder is.
- Plaats de oplossing in een waterbad bij 42 °C tot gebruik.
OPMERKING: Zowel PBS als 2% agarose kunnen wekenlang bij kamertemperatuur worden bewaard.
2. Extractie van de muizenlong
- Euthanaseer de muis door een overdosis isofluraan. Bereik een overdosis isofluraan door een kleine hoeveelheid isofluraan op tissuepapier in het onderste niveau te plaatsen en de muis op het bovenste niveau in een siccator te plaatsen. De muis blijft in desiccator tot hij bewusteloos is.
- Zorg voor de dood van de muis door inferieure druk op de nek uit te oefenen en caudaal op de staart te trekken. Breng de muis naar het ontleedoppervlak.
- Plaats de muis in rugligging en zet hem op zijn plaats met plakband op de poten en neus op tafel.
- Spuit het ventrale oppervlak van de muis in met 70% ethanol en veeg de overtollige ethanol af.
- Til de buikhuid van de muis op met een tang op de locatie van de blaas en knip op de middellijn met een chirurgische schaar, beweeg superieur naar het cervicale gebied en leg de luchtpijp bloot.
- Til de onderliggende fasciale laag op met een pincet en knip met een chirurgische schaar om viscerale organen en mediastinale compartiment bloot te leggen, opnieuw inferieur aan superieur snijdend.
- Snijd het borstbeen aan de middellijn om het hart en de longen bloot te leggen.
- Met behulp van stompe dissectie, maakt u het diafragma los van de lever en het buikcompartiment.
- Lokaliseer de inferieure vena cava (IVC) onder de darmen en snijd de IVC.
- Zoek de juiste ventrikel.
OPMERKING: De rechter ventrikel zal een lichter uiterlijk hebben in vergelijking met de linker ventrikel en het intraventriculaire septum moet worden gevisualiseerd, waarbij de rechter ventrikel van de linker ventrikel wordt gescheiden. - Injecteer 0,5 ml 1% gefractioneerde heparine in de rechter ventrikel met een vlindernaald van 25-30 G en spoel vervolgens langzaam maar gestaag met 10-15 ml 1x PBS(figuur 1A).
- Wees voorzichtig om de naald niet door het hart te steken en heparine in de mediastinale holte te injecteren.
OPMERKING: De injectie van 1x PBS maakt het longweefsel wit. De vloeistof die uit de abdominale aorta extravaseert, moet helder en kleurloos zijn en de lever kan er wit uitzien na succesvol blozen.
- Wees voorzichtig om de naald niet door het hart te steken en heparine in de mediastinale holte te injecteren.
- Lokaliseer het strottenhoofd en ontleed de omliggende fascia en het weefsel met behulp van een stomp pincet.
- Plaats de chirurgische hechting onder de luchtpijp en knoop losjes een chirurgische knoop.
- Plaats een klein gaatje in de luchtpijp dat superieur is aan touw en kanulaat met 20 G stompe naald.
- Span de hechtdraad rond de naald en luchtpijp aan met behulp van een chirurgische knoop.
- Injecteer 2,5-4 ml agarose in de luchtpijp en controleer op inflatie van de longen.
- Nadat agarose is ingebracht, giet koud, gekoeld 1x PBS over de long om agarose te stollen.
- Snijd de luchtpijp superieur aan chirurgische hechting en ontleed de long en het hart van het mediastinum door eventuele verklevingen en fascia te verwijderen.
- Plaats na het stolde 1x DMEM (genoeg om weefsel onder te dompelen) in een petrischaaltje om op ijs te blijven. Snijd onmiddellijk één lob met behulp van een vibratomemachine(figuur 1B).
3. Nauwkeurig gesneden longplakken
- Bevestig het monster met secondelijm aan het platform, waarbij de mediale zijde van het monster naar boven gericht blijft.
- Vul de monstercontainer met 1x PBS en zorg ervoor dat het monster volledig onder water staat.
- Vul de container rond de monstercontainer met ijs om pbs en monster koud te houden.
- Schakel de vibratome in en pas deze aan de gewenste instellingen hieronder aan.
- Stel de dikte in op 300um.
- Stel de frequentie in op 100 Hz.
- Stel de amplitude in op 0,6 mm.
- Stel de snelheid in op 5 μm/s.
- Gebruik een inbussleutel om de bladhouder in de veilige positie te draaien en de kaken te openen om een mes in te brengen.
- Span de kaken aan met een inbussleutel en draai de meshouder in de juiste positie om te snijden.
- Plaats het monster en het platform op de doos en schuif voor het blad.
- Vul de doos rond het monsterplatform met 1x PBS totdat het monster is ondergedompeld.
- Breng het trilmes tot aan de rand van het blok en laat het mes handmatig zakken totdat het gelijk is met de bovenkant van het monster.
- Bevestig de juiste instellingen en voer de vibratome uit(Figuur 2).
- Terwijl verse plakjes worden gesneden, verwijdert u de monsters uit de PBS en plaatst u ze in een steriel petrischaaltje met 10 ml 1x DMEM met 1x antibioticum-antimycotisch.
- Als u klaar bent, trekt u het blad volledig in en gebruikt u vervolgens de inbussleutel om het blad in een veilige positie te brengen.
- Bewaar de monsters in 1x DMEM in een incubator bij 37 °C met levensvatbaarheid bewaard gedurende maximaal 10 dagen (zie levensvatbaarheidsexperiment hieronder).
4. Voorbeeld vasoconstrictor experiment
- Plaats een trilschijfje op een microscoopglaasje.
- Voordat u het op de dia plaatst, gebruikt u een reinigingsdoekje om het overtollige medium (PBS) te verwijderen.
- Plaats het monster onder fasecontrastmicroscopie en gebruik 10-20x vergroting om een vat te identificeren.
- Plaats 500 μL vasoconstrictoren, zoals 60 mM KCl of 1 μM Endotheline-1 om de dia volledig onder te dompelen.
- Observeer en leg de video vast door op te nemen voor 30 s-60 s(Video 1).
5. Het weefsel voorbereiden op RNA- of eiwitlyse op PCLS
- Voordat u met het experiment begint, vult u een kleine doos met polystyreenschuim met 1 L vloeibare stikstof.
- Plaats twee kleine microcentrifugebuisjes (1,5 ml) in de container met vloeibare stikstof voordat u begint.
OPMERKING: Vloeibare stikstof moet buiten de buizen afkoelen, maar niet binnenin. Zorg ervoor dat u voorzichtig omgaat met vloeibare stikstof en stel de huid niet bloot aan vloeibare stikstof. Gebruik een tang en handschoenen om buizen uit de doos te plaatsen en te verwijderen. - Doe 4-5 verse plakjes vibratome in een vijzelkom.
- Giet 5-10 ml vloeibare N2 op de plakjes in de mortelkom.
- Gebruik de stamper snel om de flash freeze-plakjes tot poeder te malen voordat vloeibare stikstof verdampt.
OPMERKING: Weefsel moet condenseren tot een fijn poeder. Zo niet, voeg dan extra vloeibare stikstof toe totdat dit is bereikt. - Schep het poeder met behulp van een stalen laboratoriumschepper (vooraf geprechilled met vloeibare stikstof) in de twee gekoelde microcentrifugebuizen.
- Lyse het poeder door 500 μL RNA-extractiereagens toe te voegen om door te gaan met RNA-isolatie of 500 μL RIPA-buffer (bevat 1x proteaseremmers) om door te gaan met eiwitlysis.
- Bewaar de monsters bij -80 °C tot extra RNA-isolatie, BCA-meting en western blot.
6. Bepalen van de levensvatbaarheid
- Plaats na de tribratome-bereiding twee longplakken in een 24-well kweekplaat met 450 μL DMEM-media en 50 μL cel levensvatbaarheidsreagens (zorg ervoor dat het weefsel volledig wordt ondergedompeld).
- Plaats de monsters 's nachts terug in een incubator van 5% CO2 bij 37 °C met minimale blootstelling aan licht.
- Observeer 's ochtends de oplossing voor kleurverandering. De blauwe oplossing wordt roze wanneer het weefsel levensvatbaar is.
7. Behoud van celetikettering
- Behandel een transgene Cdh5-CreERT2 gekruist met Ai14 tdTomato muis met een IP-injectie van Tamoxifen (2 mg/dag) gedurende een totaal van 5 dagen (totale dosis 10 mg Tamoxifen) om tdTomato label Cre positieve cellen te induceren.
- Bereid de longen een week na de injectie voor met behulp van de bovenstaande stappen 1 tot en met 3.
- Na de bereiding van de nauwkeurig gesneden longschijf, plaatst u het weefsel op een microscoopglaasje en plaatst u een dekplaatje bovenop het weefsel.
- Gebruik een confocale microscoop om tdTomato-kleuring te detecteren (met behulp van excitatiegolflengte 555 nm).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer het aan cellen of weefsel wordt toegevoegd, wordt het levensvatbaarheidsreagens gewijzigd door de reducerende omgeving van levensvatbaar weefsel en wordt het roze / rood en wordt het zeer fluorescerend. De representatieve kleurveranderingen gedetecteerd vanaf dag 0-1 en dag 9-10 worden gedemonstreerd in figuur 3. Zoals opgemerkt, begon de oplossing 's nachts blauw en werd roze, wat de levensvatbaarheid aantoonde. Kleurverandering vindt meestal plaats binnen 1-4 uur; een langere tijd ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit manuscript wordt een verbeterde methode beschreven om hoge resolutie beelden van murien longweefsel te produceren die de vasculaire structuur behoudt en experimentele flexibiliteit optimaliseert, met name met behulp van de toepassing van PCLS om microslices van longweefsel te verkrijgen die in drie dimensies kunnen worden bekeken met behoud van contractiliteit van de vasculatuur. Met behulp van het levensvatbaarheidsreagens toont het protocol aan dat zorgvuldig bereide en bewaarde plakjes de levensvatbaarheid lang...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Drs. Yuan Hao en Kaifeng Liu bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een NIH 1R01 HL150106-01A1, de Parker B. Francis Fellowship en de Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award aan Dr. Ke Yuan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5cc van gefractioneerde heparine in spuit | BD | 100 USP eenheden per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge botuiteind naald voor trachea canuletie | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc spuit | BD | 309650 | |
| Anti Anti oplossing | Gibco | 15240096 | |
| Geautomatiseerd vibrerend mes microtoom | Leica | VT1200S | |
| Cellevensvatbaarheid Reagens (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagles Medium en GLutaMAX, aangevuld met 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endotheline-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortier en stamper | Amazon | ||
| RIPA lysis en extractie buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Chirurgische hechtdraad 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagens | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Vleugelbloedafnameset (Butterfly naald) 25-30G | BD | 25-30G |
Referenties
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902(2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698(2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128(2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
