Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Samenvatting

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Samenvatting

Eiwitmethyltransferases (PRMT's) katalyseren de overdracht van een methylgroep naar arginineresiduen van substraateiwitten. De PRMT-familie bestaat uit negen leden die monomethylaat of symmetrisch/asymmetrisch dimethylaat arginineresiduen kunnen maken. Verschillende antilichamen die verschillende soorten argininemethylatie van verschillende eiwitten herkennen, zijn beschikbaar; aldus, het verstrekken van hulpmiddelen voor de ontwikkeling van PRMT activiteit biomarker assays. PRMT-antilichaamgebaseerde assays zijn uitdagend vanwege overlappende substraten en op motieven gebaseerde antilichaamspecifieke kenmerken. Deze kwesties en de experimentele opzet om de arginine methylatie bijgedragen door individuele PRMT's te onderzoeken worden besproken. Door de zorgvuldige selectie van de representatieve substraten die biomarkers zijn voor acht van de negen PRMT's, werd een panel van PRMT-activiteitstesten ontworpen. Hier worden de protocollen voor cellulaire assays kwantitatief meten van de enzymatische activiteit van individuele leden van de PRMT-familie in cellen gerapporteerd. Het voordeel van de beschreven methoden is hun eenvoudige prestaties in elk lab met celcultuur en fluorescerende westerse vlekmogelijkheden. De substraatspecifiekheid en de gekozen antilichaambetrouwbaarheid werden volledig gevalideerd met knockdown- en overexpressiebenaderingen. Naast gedetailleerde richtlijnen voor de testbiomarkers en antilichamen wordt ook informatie verstrekt over het gebruik van een verzameling van remmers voor PRMT's.

Inleiding

Argininemethylatie is een belangrijke post-translationele modificatie die eiwit-eiwit- en eiwit-RNA-interacties reguleert en zo een belangrijke rol speelt in verschillende cellulaire processen zoals pre-mRNA-splicing, DNA-schade, transcriptierespons en groeifactorgemedieerde transductie^1,2. Arginine wordt gemethyleerd door eiwit arginine methyltransferases (PRMTs) resulterend in monomethyl arginine (Rme1), asymmetrisch dimethylarginine (Rme2a), of symmetrische dimethylarginine (Rme2s)³. Op basis van het methyleringstype worden PRMT's ingedeeld in drie groepen: type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 en 8), die mono- en asymmetrisch dimethylatie katalyseren; Type II (PRMT5 en PRMT9), die mono- en symmetrische dimethylatie katalyseren; en type III (PRMT7), die alleen monomethylaat arginine³.

Vanwege een groeiend aantal in de handel verkrijgbaar arginine methylatie-specifieke antilichamen, PRMT activiteit kan worden gemeten met behulp van westerse blotting. Fluorescerende westerse vlek is de voorkeurstechniek boven chemiluminescente detectie vanwege een groter dynamisch bereik en lineariteit, hogere gevoeligheid en het toestaan van multiplexing⁴. Om de eiwitmethylatieniveaus te kwantificeren, is normalisatie van het methyleringssignaal naar totale eiwitniveaus vereist. Door de antilichamen te kiezen voor totaal en gemethyleerd eiwit dat in verschillende gastheersoorten (bv. muis en konijn) wordt gekweekt, kunnen secundaire antilichamen met verschillende fluoroforen worden gebruikt en kan het signaal voor beide antilichamen in dezelfde monsterband worden bepaald. Methyl-arginine antilichamen werden ontwikkeld om monomethylated, asymmetrisch of symmetrisch gedimde eiwitten te identificeren en te karakteriseren waar methyl-arginine in een specifieke context wordt aangetroffen. Aangezien de meerderheid van prmts methylaat glycine- en arginine-rijke motieven binnen hun substraten⁵, verscheidene antilichamen werden opgeheven voor de peptiden die monomethyl of asymmetrisch, symmetrisch dimethyl-arginine-glycine herhalingen zoals D5A12, ASYM24, of ASYM25, en SYM11, respectievelijk bevatten. Andere methyl-arginineantistoffen werden gegenereerd tegen een peptidebibliotheek die asymmetrische, symmetrische dimethyl- en monomethylarginine bevat in een herhaalde context die de detectie van methyl-arginine in deze specifieke contexten vergemakkelijkt⁶. Er is ook een toenemend aantal antilichamen die specifieke arginine merk op een enkel eiwit die selectieve detectie van methylatie zoals histon H4R3me2a of BAF155-R1064me2a mogelijk maken.

Er zijn verschillende in de handel verkrijgde PRMT-remmers, die kunnen worden gebruikt als hulpmiddelen voor PRMT cellulaire assays. Ze zijn echter niet allemaal grondig gekarakteriseerd voor selectiviteit en off-target effecten en sommige moeten met voorzichtigheid worden gebruikt. Het Structural Genomic Consortium heeft, in samenwerking met academische laboratoria en farmapartners, goed gekarakteriseerde krachtige, selectieve en celdoorlatende PRMT-remmers (chemische sondes) ontwikkeld die zonder beperkingen door de wetenschappelijke gemeenschap kunnen worden gebruikt. Informatie over deze remmers is te vinden op https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics en https://www.chemicalprobes.org/. Chemische sondes zijn kleine molecuulremmers met in vitro IC₅₀ of K_d < 100 nM, meer dan 30-voudige selectiviteit ten opzichte van eiwitten in dezelfde familie en significante cellulaire activiteit bij 1 μM. Bovendien heeft elke chemische sonde een nauwe chemische analoog die inactief is tegen het beoogde doel^{7,8,9,10,11,12}.

Het doel van dit protocol is om de cellulaire activiteit van individuele PRMT-familieleden te meten met behulp van de fluorescerende westerse vlekmethode. Hier wordt gedetailleerde informatie verstrekt over gevalideerde assay-biomarkers, antilichamen en krachtige celactieve remmers, evenals waardevolle strategieën voor succesvolle testimplementatie.

Protocol

1. Celculveren en plateren

OPMERKING: Kweek cellen met aanbevolen media en test routinematig op mycoplasmabesmetting. HEK293T-, MCF7- en C2C12-cellen werden als voorbeelden gekozen, omdat deze cellijnen met succes werden gebruikt in PRMT-assays.

1. Kweek HEK293T, MCF7 en C2C12 in DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U ml⁻¹⁾en streptomycine (100 μg ml⁻¹) in met weefselkweek behandelde gerechten van 10 cm (TC).
2. Kweek voor de PRMT8-test PRMT1-inductieve knockdown HEK293T-cellen in media die doxycycline (2 μg/ml) bevatten gedurende 3 dagen voordat de test begint.
3. Om de cellen te borderen, verwijdert u media van de plaat en gooit u deze weg.
4. Voeg 10 ml PBS (zonder Ca⁺² en Mg⁺² ionen) toe om cellen te wassen en de oplossing weg te gooien.
5. Voeg 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%) toe, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) en gooi de oplossing weg. Incubeer totdat de cellen rond worden en loskomen van de plaat. Tik op de plaat om cellen los te maken, indien nodig. Voor moeilijk te trypsiniseren cellen, zoals C2C12, incubeer de plaat gedurende 1-2 minuten bij 37 °C.
   OPMERKING: Vermijd blootstelling van cellen aan trypsineoplossing voor langere periodes (>10 min), omdat dit de levensvatbaarheid van cellen vermindert.
6. Voeg 1 ml voorverwarmde media toe aan de plaat en pipetteer cellen voorzichtig op en neer om celklonters op te breken. Breng cellen over naar een buis van 15 ml en voeg 3-5 ml media toe.
7. Om het celnummer te meten, mengt u 10 μL cellen met 10 μL Trypan blauw en brengt u 10 μL over naar hemocytometer of gebruikt u een andere celtellingsmethode.
8. Verdun cellen tot de aanbevolen celdichtheid en doe 500 μL/put in 24-put TC platen (Tabel 1). Voor endogene assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 en PRMT9) gaat u naar stap 3.1.

2. Celtransfectie

1. Voor exogene assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfect HEK293T cellen met de aanbevolen hoeveelheid DNA (Tabel 2). HEK293T-cellen zijn eenvoudig te transfecteren, zodat elk transfectiereagens kan worden gebruikt, volgens de instructies van de fabrikant.

3. Samengestelde behandeling

OPMERKING: De uiteindelijke dimethylsulfoxideconcentratie (DMSO) in kweekmedia mag niet hoger zijn dan 0,1%. Houd dezelfde DMSO-concentratie in elke put. De selectieve PRMT-remmers (chemische sondes) en hun nauw verwante inactieve analogen zijn te vinden in tabel 3.

1. Voor endogene assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 en PRMT9), verwijder media uit cellen en vervang door 500 μL media met alleen compound of DMSO (controle).
   OPMERKING: Het duurt meestal 2 dagen om meer dan 80% afname van R methylatie niveaus waar te nemen.
2. Voor exogene assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8), verwijder media 4 uur na transfectie, voeg 500 μL media toe met alleen compound of DMSO (controle) en incubeer gedurende 20-24 uur.

4. Cellysaatpreparaat

1. Verwijder alle media uit putten, was met 100 μL PBS om restmedia te verwijderen en voeg 60 μL lysisbuffer toe (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleenaminetetraazijnzuur (EDTA), 10 mM MgCl_2,0,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Triton X-100, 12,5% Tri
   1. Incubeer minder dan 1 minuut bij RT en schommel de plaat om de lysisbuffer over de cellen te verdelen. Voeg vervolgens 3 μL 20% w/v natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan een laatste concentratie van 1 % en meng door zachtjes te schudden. Breng lysaat over in microcentrifugebuizen en houd het op ijs.
      OPMERKING: Voeg benzonase en eiwitremmercocktail vers toe voor gebruik. De toevoeging van benzonase hydrolyseert snel nucleïnezuren die de viscositeit van cellysaat verminderen.
2. Bepaal de eiwitconcentratie van de monsters met behulp van BCA Protein Assay Kit of gebruik een andere methode die 1% SDS in oplossing verdraagt.
   1. Voeg 2 μL lysaat- en eiwitnormen (0, 1, 2, 4 en 8 μg/ml BSA in lysisbuffer) toe aan de putten van de 96-put heldere plaat.
   2. Meng reagens A met reagens B in verhouding 50:1 en voeg 200 μL per put toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C en lees de absorptie.
3. Pas de eiwitconcentratie met lysisbuffer aan om gelijk te zijn over de monsters.
4. Voeg 20 μL 4x laadbuffer toe aan 60 μL cellysaat en verwarm bij 95 °C gedurende 5 min. Na warmtedenaturatie kunnen de lysaten worden opgeslagen bij -20 °C.

5. Westerse vlekanalyse

1. Laad 5-20 μg totaal cellysaat voor analyse van histoneiwitten en 20-100 μg voor andere eiwitten in een 4-12% Bis-Tris eiwitgel.
2. Voer de gel in MOPS SDS loopbuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) ongeveer 2 uur uit bij 100 V of totdat het verffront de onderkant van de gel bereikt.
3. Bij een natte transfer monteert u de transfer sandwich in de ijskoude Tris-Glycine transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% v/v methanol en 0,05% w/v SDS).
   1. Plaats sponzen, filterpapier, PVDF-membraan en gel volgens de instructies van de fabrikant. Activeer het PVDF-membraan door 30 s voor montage in methanol en equilibraatgel in transferbuffer te weken.
      OPMERKING: Gebruik aanbevolen PVDF western blotting membraan omdat het een lage autofluorescentie en geschiktheid heeft voor eiwitten met een laag molecuulgewicht, zoals histonen(Tabel met materialen).
4. Breng eiwitten van de gel naar het PVDF-membraan in Tris-Glycine transferbuffer bij 70 V gedurende 1,5 uur op ijs.
5. Blokkeer membraan gedurende 30 min in blokkeerbuffer (5% w/v melk in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS). Spoel af met wasbuffer (PBST: 0,1% v/v Tween-20 in PBS) en incubeer 's nachts met primaire antilichamen in boviene serumalbumine (BSA) oplossing (5% BSA in PBST) bij 4 °C (Tabel 3).
   OPMERKING: Voor een langere opslag, filter-steriliseer BSA-oplossing, voeg 0,02% w/v natrium azide toe en houd bij 4 °C.
6. Was membraan 3 x 5 min met PBST. Incubeer vervolgens met geiten-anti-konijn (IR800) en ezel anti-muis (IR680) antilichamen in aanbevolen blokkeerbuffer(Tafel van Materialen, Tabel 3) gedurende 30 min bij RT en was 3 x 5 min met PBST.
7. Lees het signaal op een fluorescerende western vlek imager op 800 en 700 nm. Gebruik bij voorkeur het instrument waarmee sterke en zwakke banden duidelijk in één beeld kunnen worden opgenomen met een hoge gevoeligheid en dynamisch bereik, een hoge signaal-ruisverhouding, een waarschuwing wanneer een beeldverzadiging wordt bereikt en multiplexing van twee fluorescerende kleuren in dezelfde monsterband.
8. Bepaal de bandintensiteiten voor western vlekanalyse met behulp van geschikte software voor fluorescerende westerse beeldvorming.

Resultaten

Voorbeelden van westerse vlekkenresultaten voor cellulaire assays van individuele PRMT's worden hieronder weergegeven. De details van de assays zijn ook samengevat in tabel 4.

PRMT1-test
PRMT1 is de belangrijkste bijdrage aan histon 4 arginine 3 asymmetrische dimethylatie (H4R3me2a) in cellen¹³. Bij verlies van PRMT1-activiteit nemen de wereldwijde Rme1 - en Rme2s-niveaus aanzienlijk toe¹³. Zoals weergegeven in figuur 1A en 1B, kunnen verschillende antilichamen worden gebruikt om wereldwijde veranderingen in Rme1, Rme2a, Rme2s en H4R3me2a te volgen. Een significante daling van de wereldwijde Rme2a- en H4R3me2a-niveaus en -stijgingen in Rme1- en Rme2's kan worden waargenomen na 3 dagen PRMT1-knockdown (Figuur 1A, B). Cellijnen verschillen in basaal H4R3me2a-signaal, daarom kunnen cellijnen zoals MCF7 met hoge basale methylatieniveaus worden gebruikt om het monitoren van het verlies van PRMT1-activiteit te vergemakkelijken (figuur 1C). De optimale tijd om het effect van PRMT1-remming waar te nemen, bijvoorbeeld bij behandeling met type I PRMT-remmer MS023^8,is 2 dagen (figuur 1D,1E). Een langere behandeling resulteert in verminderde levensvatbaarheid en groei van de cellen.

PRMT3-test
Voor de PRMT3 cellulaire test, geen selectieve biomarker eiwitten die methylatie veranderingen kunnen worden gedetecteerd in de westelijke vlek op PRMT3 knockdown of overexpressie. PRMT3 bleek in vitroH4R3 asymmetrisch te dimethylaat¹⁴, maar het merk wordt voornamelijk afgezet door PRMT1, en daarom werd een exogene test met overexpressed PRMT3 ontworpen. In overeenstemming met in vitro bevindingen leidde overexpressie van wild-type PRMT3 maar niet de katalytische mutant (E338Q) tot een toename van de H4R3me2a-spiegels (figuur 2A). HEK293T-cellen werden gebruikt omdat ze een lage basale methylatie van dit merk hebben (figuur 1C). De test werd verder gevalideerd met PRMT3 selectieve remmer SGC707⁷, die PRMT3-afhankelijke H4R3 asymmetrische methylatie remde (Figuur 2B).

PRMT4-test
PRMT4 asymmetrisch dimethylaten BAF155 bij arginine 1064¹⁵. Aangezien het antilichaam dat BAF165-R1064me2a detecteert in de handel verkrijgbaar is, kan de PRMT4-activiteit in cellen door westerse vlek worden gecontroleerd door de veranderingen in de R1064me2a-markeringsniveaus te detecteren. Het verlies van PRMT4-eiwit of remming van katalytische activiteit met de PRMT4 selectieve remmer, TP-064¹⁰, resulteert in een daling van de BAF165-R1064me2a-spiegels (Figuur 3). Een behandeling van 2 dagen is meestal voldoende om het grootste deel van het methyleringssignaal te verwijderen.

PRMT5-test
PRMT5 is verantwoordelijk voor het merendeel van de eiwit arginine symmetrische dimethylatie. Eerder werd gemeld dat de verschillende SMN-complexe eiwitten, waaronder SmBB', PRMT5-substraten zijn¹⁶. PRMT5-activiteit kan worden gevolgd door te kijken naar veranderingen in wereldwijde niveaus van symmetrische arginine dimethylatie of symmetrische dimethylatie van smbb'-eiwitten. Knockdown van PRMT5, maar niet PRMT1, 3, 4, 6 en 7 resulteert in een daling van de wereldwijde Rme2s-niveaus (Figuur 4A). In de meeste cellijnen onderdrukte de behandeling van cellen met PRMT5 selectieve remmers LLY-283¹¹ en GSK591 gedurende 2-3 dagen het grootste deel van het SmBB'Rme2s signaal (Figuur 4B). De meeste cellen zijn gevoelig voor PRMT5-remming, wat resulteert in een afname van celproliferatie en celdood bij langdurige blootstelling aan remmers.

PRMT6-test
Er is gemeld dat PRMT6 de belangrijkste bijdrage levert aan histon H3 arginine 2 asymmetrische dimethylatie (H3R2me2a) in cellen¹⁷. In HEK293T-cellen was PRMT6 knockdown gedurende 3 dagen niet voldoende om een significante daling van de H3R2me2a-spiegels waar te nemen. Echter, overexpressie van wild type PRMT6 maar niet de katalytische mutant (V86K/D88A) verhoogt de niveaus van H3R2me2a, evenals H3R8me2a en H4R3me2a (Figuur 5A). Er zijn verschillende remmers die PRMT6-activiteit remmen met verschillende potentie en selectiviteit: selectieve, allosterische PRMT6-remmer SGC6870¹⁸, PRMT type I-remmer MS023⁸en PRMT4/6-remmer MS049⁹. Al deze geremde PRMT6-afhankelijke H3R2(figuur 5B),evenals H4R3 en H3R8 asymmetrische dimethylatie (gegevens niet weergegeven).

PRMT7-test
PRMT7 monomethylaten arginine 469 in zowel constitutieve als inductieve vormen van HSP70 (respectievelijk HSPA8 en HSPA1/6)¹². Hoewel er geen in de handel verkrijgde antilichamen zijn, die HSP70-R469me1-niveaus detecteren, kan het merk worden gedetecteerd met panmonomethylantistoffen. Het verlies van PRMT7-eiwit of remming van katalytische activiteit met de PRMT7 selectieve remmer, SGC3027¹², resulteert in verlaagde HSP70-R469me1 (Figuur 6A, B). SGC3027 is een celdoorlatende prodrug, die in cellen door reductases wordt omgezet in de PRMT7 selectieve remmer SGC8158, daarom kan de cellulaire potentie verschillen tussen cellijnen. Verschillende kankercellijnen drukken induceerbare HSP70-isovormen uit op hoge niveaus, en methylatie kan moeilijk te detecteren zijn als gevolg van een overlappende niet-specifieke band van nucleaire oorsprong (Figuur 6C). Daarom worden voor de PRMT7 cellulaire test cellijnen aanbevolen die meestal HSPA8 uitdrukken, zoals C2C12, of omdat HSP70 voornamelijk in het cytoplasma lokaliseert, bepalen HSP70-R469me1-niveaus in de cytoplasmatische fractie van voorkeurscellijnen.

PRMT8-test
PRMT8 is de enige PRMT met een weefselbeperkt expressiepatroon - grotendeels uitgedrukt in de hersenen¹⁹. Het deelt 80% sequentie-gelijkenis en heeft een vergelijkbare substraatvoorkeur als PRMT1¹⁹. Het verschilt van PRMT1 voornamelijk op het N-eindpunt, waar myristoylatie resulteert in de associatie van PRMT8 met het plasmamembraan²⁰. Er is gemeld dat PRMT8 samen met PRMT1 rna-bindend eiwit EWS²¹methyleert . Omdat de PRMT8-activiteit laag is in niet-neuronale cellijnen en EWS ook kan worden gemethyleerd door PRMT1, is een test ontwikkeld waarbij PMRT8 samen met EWS in PRMT1-knockdowncellen wordt overexpressie. Aangezien PRMT1 een essentieel gen is en het verlies op lange termijn resulteert in celdood, werd een inductief systeem waarbij PRMT1 gedurende 3 dagen wordt neergehaald voordat het in de PRMT8-test werd gebruikt (Figuur 7A). Co-expressie van wild-type PRMT8, maar niet katalytisch inactieve mutant (E185Q), samen met EWS resulteerde in verhoogde niveaus van EWS asymmetrische dimethylatie (Figuur 7B). Verschillende asymmetrische dimethylarginine antilichamen werden getest en de methylatie werd alleen gedetecteerd met Asym25 antilichaam. De test werd verder gevalideerd met een selectieve chemische sonde van PRMT type I, MS023⁸, die prmt8-afhankelijke asymmetrische dimethylatie van exogene EWS verminderde (figuur 7B). Hoewel MS023 zeer krachtig is in het remmen van PRMT8 in in vitro assays, zijn in cellen hoge concentraties MS023 nodig om methylatieremming te zien²¹.

PRMT9-test
PRMT9 bleek sap145 symmetrisch te dimethyleren bij arginine 508²². Helaas kunnen geen in de handel verkrijgde antilichamen het merk herkennen. Voor de PRMT9-test werden antilichamen gebruikt die vriendelijk werden begaafd door Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope). Bij overexpressie wordt het wilde type, maar niet R508K mutant SAP145 gemethyleerd door PRMT9 (figuur 8A). De test is ontworpen om de niveaus van endogene SAP145-R508me2's te monitoren en werd gevalideerd met Compound X, een prototype PRMT9-remmer (werk in uitvoering, nog niet gepubliceerd), die PRMT9 in vitro krachtig remt met nanomolar potentie. Compound X verlaagde sap145-R508me2s niveaus op een dosisafhankelijke manier (Figuur 8B).

Figuur 1. PRMT1 cellulaire test. (A) PRMT1 knockdown resulteert in een afname van globale asymmetrische arginine dimethylatie (Rme2a) en verhoogde niveaus van symmetrische arginine dimethylatie (Rme2s) en monomethylatie (Rme1). De PRMT1 knockdown efficiëntie wordt gepresenteerd in paneel B. (B) PRMT1 knockdown vermindert asymmetrische dimethylatie van histon H4R3 (H4R3me2a). (C) De basale H4R3me2a-niveaus verschillen over verschillende cellijnen. (D) Type I PRMT-remmer MS023 verlaagt de H4R3me2a-spiegels op dosisafhankelijke wijze. MCF7-cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met MS023. (E) De grafiek geeft de niet-lineaire pasvorm van H4R3me2a signaalintensiteiten weer die genormaliseerd zijn tot totale histon H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. PRMT3 cellulaire test. (A) De overexpressie van wild-type (WT) maar niet E338Q katalytische mutant van PRMT3 verhoogt de H4R3me2a-spiegels in HEK293T-cellen. Cellen werden getransfecteerd met FLAG-gelabelde PRMT3 gedurende 24 uur (B) PRMT3 selectieve remmer, SGC707, vermindert ectopische PRMT3 afhankelijke H4R3 asymmetrische demethylatie Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. PRMT4 cellulaire test. (A) PRMT4 knockdown resulteert in een afname van BAF155-R1064 asymmetrische arginine dimethylatie (HEK293T cellen). (B) PRMT4 selectieve remmer, TP-064, verlaagt de BAF155-R1064Rme2a niveaus. HEK293T cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met compound. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. PRMT5 cellulaire test. (A) PRMT5 knockdown resulteert in een afname van wereldwijde symmetrische arginine dimethylatie niveaus (MCF7 cellen). (B) PRMT5 selectieve remmers GSK591 en LLY-283, verminderen smbb' symmetrische arginine dimethylatie (groen), terwijl de totale niveaus van SmBB' onveranderd blijven (rood). MCF7-cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met verbindingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. PRMT6 cellulaire test. (A) De overexpressie van wild type (WT) maar niet V86K/D88A katalytische mutant PRMT6 verhoogt de H4R3me2a, H3R2me2a en H3R8me2a niveaus in HEK293T cellen. Cellen werden getransfecteerd met FLAG-gelabelde PRMT6 gedurende 24 uur (B) PRMT6 selectieve remmer (SGC6870), PRMT type I remmer (MS023) en PRMT4/6 remmer (MS049) verlagen PRMT6 afhankelijke H3R2me2a niveaus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. PRMT7 cellulaire test. (A) PRMT7 knock-out resulteert in een afname van HSP70-R469 monomethylatie (HCT116 cellen). (B) PRMT7 selectieve remmers, SGC3027, vermindert HSP70-R469 monomethylatie in C2C12 cellen. Cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met verbinding. (C) Detectie van HSP70-R469 methylatie van onopleidbare HSP70 (HSPA1/6) met panmonomethyl arginine antilichamen (Rme1) kan moeilijk zijn vanwege een overlappende niet-specifieke band van nucleaire oorsprong. Het wordt aanbevolen om HSP70-methyleringsniveaus in de cytoplasmatische fractie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. PRMT8 cellulaire test. (A) PRMT8 methylatie van EWS kan worden gedetecteerd wanneer PRMT1-activiteit wordt geremd door knockdown. HEK293T cellen werden getransduceerd met een induceerbare PRMT1 knockdown vector. Na 3 dagen behandeling met doxycycline werden de PRMT1-spiegels drastisch verlaagd. (B) Wanneer PRMT1 wordt neergehaald, wordt exogene EWS asymmetrisch gedimd door overexpressie van het wilde type PRMT8, maar niet door katalytische mutant (E185Q) van PRMT8. De methylatie wordt verminderd door een hoge concentratie PRMT type I-remmer (MS023). HEK293T PRMT1KD-cellen werden geco-getransfecteerd met FLAG-gelabeld PRMT8 wild type of katalytische mutant en GFP-gelabelde EWS en behandeld met MS023 gedurende 20 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8. PRMT9 cellulaire test. (A) Wild type maar niet R508K mutant SAP145 wordt gemethyleerd door PRMT9. HEK293T-cellen werden gedurende 1 dag getransfecteerd met SAP145 met GFP-tag. (B) Het prototype PRMT9-remmer (Compound X) vermindert prmt9-afhankelijke R508 symmetrische dimethylatie van SAP145 op een dosisafhankelijke manier. HEK293T cellen werden behandeld met de verbinding gedurende 2 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

PRMT	Cellen	Dichtheid per ml
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*behandel cellen met doxycycline (2 μg/ml) 3 dagen voor het plateren voor PRMT8-test

Tabel 1. Celtypen en dichtheden aanbevolen voor PRMT-assays.

PRMT	μg DNA/24-put	Addgene #	Aanvullende opmerkingen
PRMT3	0.5 VLAG-PRMT3	164695
	of 0.5 VLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 VLAG-PRMT6	164697
	of 0.5 VLAG-PRMT6 (V86K/D88A)	164698
PRMT8	0.05 EWS-GFP	164701
	0.45 PRMT8-VLAG	164699
	of 0.45 PRMT8 (E185Q)-VLAG	164700
PRMT9	0.05 SAP145-GFP	NA	geschenk van Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
	of 0.05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 lege vector

Tabel 2. De DNA-concentratie aanbevolen voor transfectie-experiment.

PRMT	antistof	Chemische sonde (Celactiviteit IC50)	Negatieve controle
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT type I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = respectievelijk 9, 56, 1000, 5000 nM)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-actin (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	VLAG (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	Lly-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT type I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = respectievelijk 9, 56, 1000, 5000 nM)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (RESPECTIEVELIJK PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	VLAG ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	VLAG (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -vriendelijk geschenk van Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Secundaire antilichamen	geit-anti-konijn IgG-IR800 (1:5000)
	ezel anti-muis IgG-IR680 (1:5000)
*- antilichaam herkent HSPA8, HSPA1 en HSPA6 (getest met overexpressed GFP-gelabelde eiwitten), *prodrug – de IC50 kan verschillen tussen verschillende cellijnen

Tabel 3. Aanbevolen antilichamen en PRMT chemische sonde/negatieve controle gereedschap verbindingen.

PRMT

Biomarker

Uitlezing van de test

Validatie van assay

Aanbevolen cellijn

Ref.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

H4R3me2a-niveaus genormaliseerd tot totale H4 globale Rme1-, Rme2a- of Rme2s-niveaus genormaliseerd naar B-actine.

Knockdown van PRMT1 verlaagde basale H4R3me2a en wereldwijde Rme2a niveaus en verhoogde wereldwijde Rme1 en Rme2s niveaus in cellen (Fig.1A, B). Prmt Type I chemische sonde MS023 verlaagde de niveaus van H4R3me2a op een dosisafhankelijke manier (Fig. 1D).

Cellen verschillen in basale H4R3me2a-niveaus (fig. 1C). MCF7-cellen hebben hoge basale H4R3me2a-niveaus, waardoor het de voorkeur heeft voor assays die de afname van prmt1-activiteit controleren.

8

PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a methyleringsniveaus veroorzaakt door exogene FLAG-gelabelde PRMT3 WT of katalytische E338Q mutant (achtergrond) genormaliseerd tot totale histon H4

Overexpressie van wild type PRMT3, maar niet de katalytische mutant (E338Q) verhoogde H4R3me2a (Fig. 2A). PRMT3 selectieve remmer SGC707 verminderde PRMT3 afhankelijke toename van H4R3me2a niveaus (Fig. 2B)

HEK293T-cellen hebben lage basale H4R3me2a-spiegels (fig. 1C), wat de voorkeur heeft voor het monitoren van exogene PRMT3-activiteit

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

BAF155-R1064me2a niveaus genormaliseerd tot totaal BAF155

PRMT4 knockdown verminderde asymmetrische dimethylatie van BAF155 (Fig. 3A). 2-daagse behandeling met PRMT4 selectieve chemische sonde (TP-064) verminderde asymmetrische dimethylatie van BAF155 (Fig. 3B).

Elke cellijn

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

SmBB'-Rme2s-niveaus gedetecteerd met pan Rme2s antilichamen (CST) genormaliseerd tot totaal SmBB'

Knockdown van PRMT5 resulteerde in verlaagde SmBB' symmetrische dimethylatieniveaus (Fig. 4A). 2-daagse behandeling met PRMT5 selectieve chemische sondes, GSK591 en LLY285, verlaagde SmBB'-Rme2s niveaus (Fig. 4B).

Elke cellijn

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a, H3R2me2a of H3R8me2a methylatieniveaus worden verhoogd door exogene PRMT6 WT met vlag, maar niet met katalytische V86K, D88A mutant (achtergrond) genormaliseerd tot respectievelijk totale histon H4 of H3

Overexpressie van wild type PRMT6, maar niet de katalytische mutant (V86K,D88A) verhoogde H3R2me2a, H3R8me2a en H4R3me2a niveaus (Fig. 5A). Allosterische PRMT6-remmer (SGC6870), PRMT type I-remmer MS023 , PRMT4/6-remmer MS049 verminderde PRMT6-afhankelijke toename van H3R2me2a-spiegels (Fig. 5B).

HEK293T-cellen hebben lage basale H4R3me2a-, H3R2me2a- en H3R8me2a-niveaus, wat de voorkeur heeft voor het monitoren van exogene PRMT6-activiteit

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

HSP70-Rme1 methyleringsniveaus genormaliseerd tot totaal HSP70

PRMT7 knock-out of knockdown verminderde HSP70 monomethylatie (Fig. 6A). 2-daagse behandeling met PRMT7 selectieve chemische sonde SGC3027 verminderde PRMT7-afhankelijke HSP70 monomethylatie op een dosisafhankelijke manier (Fig. 6B).

C2C12, HT180 Verschillende kankercellijnen drukken een optoonbare vorm van HSP70 uit waarvan het methyleringssignaal overlapt met een niet-specifiek eiwit van nucleaire oorsprong (fig. 6C). In dit geval raden we aan om HSP70-methyleringsniveaus in de cytoplasmatische fractie te analyseren.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Exogene EWS-methylatieniveaus met GFP-tag, veroorzaakt door exogene PRMT8 WT- of E185Q-katalytische mutant (achtergrond), genormaliseerd tot totaal GFP-signaal in PRMT1 KO-cellen.

Overexpressie van het wilde type PRMT8, maar niet katalytisch E185Q mutant gemethyleerd ectopisch EWS alleen in PRMT1 KD-cellen (Fig. 7A). PRMT type I chemische sonde MS023 remde asymmetrische dimethylatie van exogene EWS door PRMT8 (Fig. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (inductief). PRMT1 knockdown resulteert in celdood daarom raden we aan om een inductief systeem te gebruiken.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

PRMT9 afhankelijk SAP145 symmetrische dimethylatie bij R508 genormaliseerd naar SAP145

Het verlies PRMT9 maar niet PRMT5 leidt tot verminderde symmetrische dimethylatie van SAP145. SAP145 WT met GFP-tag, maar niet SAP145mut (R508K), werd gemethyleerd door PRMT9 (fig. 8A). 2-daagse behandeling met Copound X, het prototype PRMT9-remmer, verlaagde sap145-R508me2s niveaus op een dosisafhankelijke manier Fig 8B).

Elke cellijn

21

Tabel 4. PRMT-testoverzicht.

Discussie

Hier worden de gedetailleerde cellulaire testprotocollen voor leden van de PRMT-familie beschreven die fluorescerende westerse blaasmethoden gebruiken. Unieke substraten waarvoor de veranderingen in argininemethylatie gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd bij individueel PRMT-verlies of katalytische remming en niet kunnen worden gecompenseerd door andere familieleden. Sommige eiwitten worden gemethyleerd door meerdere PRMT's^21,23, wat wijst op een overlap in substraatspecifiekheid waarbij sommige PRMT's slechts een kleine hoeveelheid cellulaire markering in een bepaald eiwitsubstraat^24,25,26,27bijdragen, bijvoorbeeld zowel PRMT8 als PRMT1 dragen bij aan methylatie van EWS. Daarom vereiste elke test een grondige validatie van substraten en antilichamen met knockdown- en/of overexpressie-experimenten en verdere validatie met goed gekarakteriseerde selectieve remmers. Prmt-specifieke substraten werden geïdentificeerd waarvoor methyleringsmerkveranderingen binnen 2-3 dagen na PRMT-verlies/-remming konden worden gedetecteerd om samengestelde effecten van verminderde levensvatbaarheid en proliferatie van cellen te voorkomen die indirect van invloed kunnen zijn op de methyl-arginine-merkniveaus. Hoewel het mogelijk was om unieke substraten te vinden voor PRMT1, 4, 5, 7 en 9; voor PRMT3, 6 en 8 moest de gain of function-benadering worden toegepast. Verschillende arginine methylspecifieke antilichamen werden getest op verschillende cellulaire doelen, maar geen enkele was in staat om significante veranderingen te detecteren binnen 3 dagen na PRMT3 en PRMT6 knockdown; daarom werden biomarkertesten ontwikkeld met behulp van ectopisch uitgedrukte enzymen samen met katalytisch inactieve mutanten, die dienden als een controle voor de basissubstraatmethylatie. PRMT8 is een nauwe PRMT1 homolog en deelt vergelijkbare substraatvoorkeuren. Omdat een PRMT8 selectieve biomarker niet kon worden geïdentificeerd, werd een test in PRMT1 knockdowncellen ontwikkeld, waarbij PRMT8 samen met EWS werd uitgedrukt. PRMT1 is ook een belangrijk enzym dat verantwoordelijk is voor H4R3 asymmetrische methylatie, daarom werden cellen met lage basale H4R3me2a-niveaus gekozen om H4R3me2a te gebruiken als biomarker voor PRMT3- en PRMT6-cellulaire assays, cellen met lage basale H4R3me2a-niveaus en katalytisch inactieve mutanten werden gebruikt als achtergrondcontrole. Hoewel endogene tests de voorkeur hebben , blijken exogene tests van onschatbare waarde voor het testen van de cellulaire potentie van verschillende selectieve PRMT-remmers^7,8,9. Met groeiende kennis van PRMT-biologie verwachten we de test te verbeteren door meer specifieke biomarker-eiwitten te vinden voor PRMT3, PRMT6 en PRMT8.

Het gebruik van gevalideerde antilichamen en passende controles zijn van cruciaal belang voor de prestaties van de PRMT-test. Alle antilichamen die hier worden aanbevolen, zijn grondig gevalideerd door knockdown- en overexpressie-experimenten, maar batch-to-batch-verschillen, vooral in het geval van polyklonale antilichamen, kunnen hun prestaties nog steeds beïnvloeden. Daarom is het cruciaal om genetische methoden en chemische sondes samen met hun nauw verwante negatieve controles te gebruiken om de betrouwbaarheid van de test te bevestigen. Bovendien is het voor PRMT-assays die eiwitoverexpressie vereisen cruciaal om katalytisch inactieve mutanten samen met wild-type eiwit te gebruiken om de basale methylatieniveaus te bepalen.

Deze verzameling kwantitatieve testmiddelen voor het profileren van de activiteit van PRST's in cellen kan in grote lijnen nuttig zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap, omdat het snel en gemakkelijk kan worden geïmplementeerd met minimale apparatuur en beperkte technische expertise, waarbij alleen basiscelculering en fluorescerende westerse blaastechnieken betrokken zijn. De aanbevolen antilichamen en chemische sondes voor PRMT's kunnen ook worden gebruikt voor activity-based protein profiling (ABPP)-tests om de geschiktheid van een bepaalde ABPP-sonde vast te stellen, de doelbetrokkenheid te monitoren en off-target effecten te beoordelen met behulp van het competitieve ABPP-formaat. De hier besproken ontwikkelingsbenaderingen kunnen ook worden geëxtrapoleerd voor andere enzymfamilies zoals eiwitlysine-methyltransferases en acetyltransferases.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 cm TC dishes	Greiner bio-one	664160
24-well TC plates	Greiner bio-one	662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anti-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	Active Motif	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore,, 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			PRODUCED IN-HOUSE
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680	Licor	926-68072
doxycycline	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
glycine	Bioshop	GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22™
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) Blocking Buffer kan ook worden gebruikt # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	Licor	model number 9140
PBS (tissue culture)	Wisent	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
skim milk powder	Bioshop	SKI400.500
TC20 automated cell counter	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypan blue	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500