Onderzoek naar m6A en m5C epitranscriptomen bij virale infectie: een voorbeeld met HIV

Samenvatting

De rol van RNA-modificaties in virale infecties begint net te worden onderzocht en zou nieuwe interactiemechanismen tussen virussen en gastheren kunnen benadrukken. In dit werk bieden we een pijplijn om ^m6A- en m5C-RNA-modificaties te onderzoeken in de context van virale infecties.

Samenvatting

De rol van RNA-modificaties in biologische processen is de afgelopen jaren de focus geweest van een toenemend aantal studies en staat tegenwoordig bekend als epitranscriptomics. Onder andere N6-methyladenosine (^m6A) en 5-methylcytosine (^m5C) RNA-modificaties zijn beschreven op mRNA-moleculen en kunnen een rol spelen bij het moduleren van cellulaire processen. Epitranscriptomics is dus een nieuwe laag van regulatie die naast transcriptomische analyses moet worden overwogen, omdat het ook kan worden gewijzigd of gemoduleerd door blootstelling aan een chemisch of biologisch agens, inclusief virale infecties.

Hier presenteren we een workflow die analyse mogelijk maakt van het gezamenlijke cellulaire en virale epitranscriptomische landschap van de ^m6A- en ^{m5C-markeringen} tegelijkertijd, in cellen die al dan niet zijn geïnfecteerd met het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Bij mRNA-isolatie en fragmentatie van HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen, gebruikten we twee verschillende procedures: MeRIP-Seq, een op RNA-immunoprecipitatie gebaseerde techniek, om te verrijken voor RNA-fragmenten die het ^m6A-merk bevatten en BS-Seq, een op bisulfietconversie gebaseerde techniek, om de ^{m5C-markering} te identificeren met een enkele nucleotideresolutie. Bij methylatiespecifieke vangst worden RNA-bibliotheken voorbereid op high-throughput sequencing. We hebben ook een speciale bioinformatica-pijplijn ontwikkeld om differentieel gemethyleerde (DM) transcripties onafhankelijk van hun basale expressieprofiel te identificeren.

Over het algemeen maakt de methodologie het mogelijk om meerdere epitranscriptomische tekens tegelijkertijd te verkennen en biedt een atlas van DM-transcripten bij virale infectie of andere celverstoring. Deze aanpak biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe spelers en nieuwe mechanismen van celrespons te identificeren, zoals cellulaire factoren die virale replicatie bevorderen of beperken.

Inleiding

Het is al lang bekend dat RNA-moleculen kunnen worden gemodificeerd en tot op heden zijn er meer dan 150 post-transcriptionele modificaties ^beschreven1. Ze bestaan uit de toevoeging van chemische groepen, voornamelijk methylgroepen, aan vrijwel elke positie van de pyrimidine- en purineringen van ^{RNA-moleculen2}. Van dergelijke post-transcriptionele modificaties is al aangetoond dat ze sterk verrijkt zijn in transfer RNA (tRNA) en ribosomaal RNA (rRNA) en zijn onlangs ook beschreven op mRNA-moleculen.

De opkomst van nieuwe technologieën, zoals Next Generation Sequencing (NGS), en de productie van specifieke antilichamen die bepaalde chemische modificaties herkennen, maakten voor het eerst het onderzoek naar de locatie en de frequentie van specifieke chemische modificaties op transcriptoombreed niveau mogelijk. Deze ontwikkelingen hebben geleid tot een beter begrip van RNA-modificaties en tot het in kaart brengen van verschillende modificaties op mRNA-moleculen3,4.

Terwijl epigenetica de rol van DNA en histonmodificaties in transcriptoomregulatie onderzoekt, richt epitranscriptomics zich op een vergelijkbare manier op RNA-modificaties en hun rol. Het onderzoek naar epitranscriptomische modificaties biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe reguleringsmechanismen te benadrukken die een verscheidenheid aan cellulaire processen kunnen afstemmen (d.w.z. RNA-splicing, export, stabiliteit en translatie)⁵. Het was dus geen grote verrassing dat recente studies veel epitranscriptomische modificaties bij virale infectie in zowel cellulaire als virale ^RNA's6 blootlegden. Virussen die tot nu toe zijn onderzocht, omvatten zowel DNA- als RNA-virussen; onder hen kan HIV worden beschouwd als een baanbrekend voorbeeld. Al met al kan de ontdekking van RNA-methylatie in de context van virale infecties het onderzoek naar nog onbeschreven mechanismen van virale expressie of replicatie mogelijk maken, waardoor nieuwe hulpmiddelen en doelen worden geboden om ze te ^beheersen7.

Op het gebied van HIV-epitranscriptomica zijn modificaties van virale transcripten op grote schaal onderzocht en hebben aangetoond dat de aanwezigheid van deze modificatie gunstig was voor virale replicatie8,9,10,11,12,13. Tot op heden kunnen verschillende technieken worden gebruikt om epitranscriptomische tekens op transcriptoombreed niveau te detecteren. De meest gebruikte technieken voor ^{m6A-identificatie} zijn gebaseerd op immuunprecipitatietechnieken zoals MeRIP-Seq en miCLIP. Terwijl MeRIP-Seq vertrouwt op RNA-fragmentatie om fragmenten met gemethyleerde residuen te vangen, is miCLIP gebaseerd op het genereren van α-m6A-antilichaamspecifieke signatuurmutaties op RNA-antilichaam UV-crosslinking, waardoor een nauwkeurigere mapping mogelijk is.

Detectie van ^{m5C-modificatie} kan worden bereikt door op antilichamen gebaseerde technologieën die vergelijkbaar zijn met ^m6A-detectie (^m5C RIP), of door bisulfietconversie of door AZA-IP of door miCLIP. Zowel Aza-IP als ^m5C miCLIP gebruiken een specifiek methyltransferase als lokaas om RNA te targeten terwijl ze door RNA-methylatie gaan. In Aza-IP worden doelcellen blootgesteld aan 5-azacytidine, wat resulteert in de willekeurige introductie van cytidine-analoge 5-azacytidine-sites in ontluikend RNA. In miCLIP is het NSun2-methyltransferase genetisch gemodificeerd om de C271A-mutatie te ^{herbergen14,15}.

In dit werk richten we ons op de dubbele karakterisering van ^m6A- en ^{m5C-modificaties} in geïnfecteerde cellen, met HIV als model. Op methodologische optimalisatie hebben we een workflow ontwikkeld die gemethyleerde RNA-immunoprecipitatie (MeRIP) en RNA-bisulfietconversie (BS) combineert, waardoor de gelijktijdige verkenning van ^m6A- en m5C-epitranscriptomische markeringen op transcriptoombreed niveau mogelijk is, in zowel cellulaire als virale contexten. Deze workflow kan worden geïmplementeerd op cellulaire RNA-extracten en op RNA geïsoleerd uit virale deeltjes.

De Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)^{16-benadering} die onderzoek van ^m6A op transcriptoombreed niveau mogelijk maakt, is goed ingeburgerd en een reeks ^{m6A-specifieke} antilichamen zijn tot op heden commercieel ^{beschikbaar17}. Deze methode bestaat uit het selectief vastleggen van ^{m6A-bevattende} RNA-stukjes met behulp van een ^{m6A-specifiek} antilichaam. De twee belangrijkste nadelen van deze techniek zijn (i) de beperkte resolutie, die sterk afhankelijk is van de grootte van RNA-fragmenten en dus een geschatte locatie en regio biedt die het gemethyleerde residu bevat, en (ii) de grote hoeveelheid materiaal die nodig is om de analyse uit te voeren. In het volgende geoptimaliseerde protocol hebben we de fragmentgrootte gestandaardiseerd tot ongeveer 150 nt en de hoeveelheid uitgangsmateriaal teruggebracht van 10 μg poly-A-geselecteerd RNA, wat momenteel de geadviseerde hoeveelheid uitgangsmateriaal is, tot slechts 1 μg poly-A-geselecteerd RNA. We hebben ook de herstelefficiëntie van m6A-RNA-fragmenten die gebonden zijn aan specifieke antilichamen gemaximaliseerd met behulp van een elutie door een concurrentiebenadering met een ^m6A-peptide in plaats van meer conventionele en minder specifieke elutiemethoden met behulp van fenolgebaseerde technieken of proteïnase K. De belangrijkste beperking van deze rip-gebaseerde test blijft echter de suboptimale resolutie die de identificatie van het precieze gemodificeerde A-nucleotide niet mogelijk maakt.

Analyse van het ^{m5C-merkteken} kan momenteel worden uitgevoerd met behulp van twee verschillende benaderingen: een op RIP gebaseerde methode met ^{m5C-specifieke} antilichamen en RNA-bisulfietconversie. Omdat RIP slechts een beperkte resolutie biedt voor de identificatie van het gemethyleerde residu, hebben we bisulfietconversie gebruikt die een enkele nucleotideresolutie kan bieden. RNA-blootstelling aan bisulfiet (BS) leidt tot cytosine-deaminering, waardoor het cytosineresidu wordt omgezet in uracil. Tijdens de RNA-bisulfietconversiereactie wordt dus elke niet-gemethyleerde cytosine gedeamineerd en omgezet in uracil, terwijl de aanwezigheid van een methylgroep op positie 5 van de cytosine een beschermend effect heeft, waardoor de BS-geïnduceerde deaminering wordt voorkomen en het cytosineresidu behouden blijft. De BS-gebaseerde benadering maakt de detectie van een ^{m5C-gemodificeerd} nucleotide bij enkelvoudige baseresolutie mogelijk en voor de beoordeling van de methylatiefrequentie van elk transcript, waardoor inzicht wordt verkregen in m5C-modificatiedynamiek18. De belangrijkste beperking van deze techniek is echter gebaseerd op de fout-positieve snelheid van gemethyleerde residuen. Inderdaad, BS-conversie is effectief op enkelstrengs RNA met toegankelijke C-residuen. De aanwezigheid van een strakke secundaire RNA-structuur kan echter de N5C-positie maskeren en BS-conversie belemmeren, wat resulteert in niet-gemethyleerde C-residuen die niet worden omgezet in U-residuen en dus valse positieven. Om dit probleem te omzeilen en het fout-positieve percentage te minimaliseren, hebben we 3 rondes van denaturatie- en bisulfietconversiecycli ^toegepast19. We hebben ook 2 controles in de monsters geïntroduceerd om de efficiëntie van bisulfietconversie te kunnen schatten: we spike-in ERCC-sequencingcontroles (niet-gemethyleerde gestandaardiseerde en commercieel beschikbare sequenties)²⁰ evenals poly-A-uitgeputte RNA's om enerzijds de bisulfietconversiesnelheid te beoordelen en om door RT-PCR de aanwezigheid van een bekende en goed geconserveerde gemethyleerde locatie, C4447, te verifiëren, op 28S ribosomaal RNA ^{daarentegen21}.

Op het gebied van virologie maakt het koppelen van deze twee epitranscriptomische onderzoeksmethoden met next generation sequencing en nauwkeurige bioinformatische analyse de diepgaande studie van ^m6A- en ^m5C-dynamica mogelijk (d.w.z. RNA-modificatie temporele veranderingen die kunnen optreden bij virale infectie en een reeks nieuwe therapeutisch relevante doelen voor klinisch gebruik kunnen blootleggen).

Protocol

1. Celvoorbereiding

OPMERKING: Afhankelijk van het celtype en het RNA-gehalte kan het startaantal cellen variëren.

1. Zorg voor voldoende cellen om tussen 200-500 μg totaal RNA of 5-7 μg poly-A-geselecteerd RNA te verkrijgen. 50 x ¹⁰⁶ SupT1-cellen moeten bijvoorbeeld ongeveer 500 μg totaal RNA opleveren bij extractie met op fenol gebaseerde reagentia en zijn dus vereist voor elke individuele geteste aandoening.
2. Bereid het vereiste aantal cellen voor volgens het experimentele ontwerp en dus volgens het aantal geteste omstandigheden (infectie, tijdpunten, behandeling). Als het experiment gericht is op het verkrijgen van niet-geïnfecteerde cellen en HIV-geïnfecteerde cellen op 24 uur na infectie, is een totaal van 100 x ¹⁰⁶ cellen nodig, de helft voor niet-geïnfecteerde toestand en de helft voor geïnfecteerde toestand.

2. RNA-extractie

1. Van cellen: RNA-extractie met fenol-chloroform
   1. Verzamel voor elke aandoening cellen (bijv. 50 x ¹⁰⁶) door centrifugering en gooi het supernatant weg.
   2. Voeg 5 ml reagens op basis van fenol toe aan elke pellet van 50 x ¹⁰⁶ cellen en meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.
   3. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om volledige lysis mogelijk te maken. Gelyseerde cellen kunnen worden opgeslagen bij -80 °C of direct worden verwerkt.
      OPMERKING: Indien nodig kunnen cellen ook worden verdeeld in aliquots van 10 x ¹⁰⁶ cellen per buis in buizen van 1,5 ml en worden gelyseerd in 1 ml op fenol gebaseerd reagens voor gemakkelijkere opslag.
   4. Voeg 1 ml chloroform toe en meng door inversie.
   5. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.
   7. Pipetteer de waterige fase (bovenste fase) en breng over naar een nieuwe buis. Voltooi het overbrengen van de waterige fase door de buis op 45° te hengelen en de oplossing voorzichtig uit te pipetteren.
      OPMERKING: De hoeveelheid waterige fase kan variëren tussen monsters, maar moet dicht bij de hoeveelheid chloroform liggen die aan het monster wordt toegevoegd (d.w.z. 1 ml). Breng geen interfase of organische laag over! Het gebruik van fasevergrendelings- of fasemakerbuizen kan dit proces vergemakkelijken.
   8. Voeg 0,5 ml 100% isopropanol van moleculaire kwaliteit toe aan de waterige fase.
   9. Incubeer gedurende 1 uur bij -80 °C om RNA-neerslag mogelijk te maken.
   10. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g en 4 °C om het neergeslagen RNA te pelleteren.
   11. Gooi het supernatant weg en resuspend de RNA-pellet in 1 ml 75% ethanol van moleculair biologische kwaliteit. Vortex kort.
   12. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.500 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
   13. Droog de pellet gedurende 15 min aan de lucht.
   14. Resuspend de pellet in 20 μL RNase-vrij water en breng over in een nieuwe buis.
   15. Was de lege buis met nog eens 20 μL water om het RNA-herstel te maximaliseren en pool met het eerste volume van 20 μL.
   16. Kwantificeer het totale RNA met een spectrofotometer en beoordeel de RNA-kwaliteit met een fragmentanalysator.
2. Van virale deeltjes: RNA-extractie met kolomgebaseerde virale RNA-extractiekit
   OPMERKING: RNA-extractie uit virale deeltjes met op fenol gebaseerd reagens resulteert in viraal RNA van lage kwaliteit en in bibliotheken van lagere kwaliteit. Een kolomgebaseerde RNA-extractie zou dus de voorkeur moeten krijgen. RNA-extractiekits met drager RNA voor RNA-elutie en -herstel zijn niet geschikt voor deze procedure en moeten worden vermeden. Aangezien HIV-RNA poly-adenylated is, is directe RNA-extractie zonder verdere mRNA-isolatie voldoende om de MeRIP-Seq- en BS-Seq-pijpleidingen binnen te gaan. Normaal gesproken zou 1-2 ml viraal supernatant uit universeel geïnfecteerde cellen voldoende RNA moeten leveren om de hele workflow uit te voeren.
   1. Bereid de buffer voor door 150 μL bèta-mercaptoethanol toe te voegen aan 30 ml lysisbuffer. Reconstitueer de virale wasbuffer door 96 ml 100% ethanol toe te voegen.
   2. Verzamel virusbevattende supernatanten en centrifugeer om celresten te pelleteren om cellulaire RNA-besmetting te minimaliseren.
   3. Breng 1 ml viraal supernatant over op een buis van 15 ml.
   4. Voeg 3 ml virale RNA-buffer toe aan 1 ml viraal monster en meng door vortexing.
   5. Breng 700 μL monster over in een kolom, ingebracht in een verzamelbuis.
   6. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.000 x g bij kamertemperatuur.
   7. Gooi de flowthrough weg.
   8. Herhaal de 3 voorgaande stappen totdat het hele monster is verwerkt en dus al het RNA is opgevangen op de op silica gebaseerde matrixkolom.
   9. Voeg 500 μL virale wasbuffer toe aan de kolom.
   10. Centrifugeer gedurende 1 min bij 10.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi de flowthrough weg.
   11. Voeg 200 μL virale wasbuffer toe aan de kolom.
   12. Centrifugeer gedurende 1 min bij 10.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi de flowthrough weg.
   13. Plaats de kolom in een lege opvangbuis.
   14. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij kamertemperatuur om eventuele resterende wasbufferverontreiniging verder weg te gooien.
   15. Breng de kolom voorzichtig over in een buis van 1,5 ml.
   16. Voeg 20 μL DNase/RNase-vrij water rechtstreeks toe aan het midden van de kolommatrix en centrifugeer met 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
   17. Voeg een extra 10 μL DNase/RNase-vrij water direct toe aan het midden van de kolommatrix en centrifugeer opnieuw gedurende 30 s.
   18. Kwantificeer het totale RNA met een spectrofotometer en beoordeel de RNA-kwaliteit met een fragmentanalysator.
       OPMERKING: RNA-extractie kan met elke methode worden uitgevoerd, als de kwaliteit van het opgehaalde RNA hoog is, met een RNA-integriteit / kwaliteitsnummer > 9. Totaal RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C tot verdere verwerking.

3. mRNA-isolatie door poly-A-selectie met Oligo(dT)₂₅

OPMERKING: Vanwege de aanwezigheid van sterk gemethyleerd ribosomaal RNA in cellulaire extracten, wordt het ten zeerste aanbevolen om poly-A-RNA te isoleren door rRNA-depletie of bij voorkeur door poly-A-positieve selectie. Deze stap is optioneel en moet alleen worden uitgevoerd voor cellulaire RNA-monsters om sequencingresultaten met een hogere resolutie te verkrijgen. Bij het analyseren van methylatie van niet-poly-geïdenyleerde virale RNA's, geef dan de voorkeur aan rRNA-depletie in plaats van poly-A-selectie of voer uiteindelijk de analyse uit op totaal RNA.

1. Kraalvoorbereiding voor poly-A-opname
   1. Resuspend de Oligo(dT)₂₅ magnetische kralen voorraadflacon door vortexing gedurende >30 s.
   2. Breng 200 μL magnetische kralen over op een buis van 1,5 ml. Bereid het aantal buisjes met magnetische kralen voor op basis van de totale hoeveelheid te verwerken RNA-monsters.
      OPMERKING: Eén buis met 200 μL Dynabead-stamoplossing komt overeen met 1 mg kralen en is geschikt voor een monster van 75 μg totaal RNA.
   3. Plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder de buizen van de magneet.
   4. Voeg 1 ml bindingsbuffer toe (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 2 mM EDTA) en resuspend door vortexing. Plaats de buisjes gedurende 1 minuut op de magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder de buizen van de magneet. Herhalen.
   5. Resuspend de gewassen magnetische kralen in 100 μL bindingsbuffer.
2. Totale RNA-voorbereiding
   1. Verdun het totale RNA tot een eindconcentratie van 0,75 μg/μL met RNase-vrij water, wat overeenkomt met 75 μg/100 μL.
      OPMERKING: Als RNA zich in een lagere concentratie bevindt, ga dan verder zoals hieronder beschreven zonder de volumes te wijzigen.
   2. Aliquoteer het totale RNA in meerdere buizen door 100 μL RNA-monster per buis af te geven.
   3. Voeg 100 μL bindingsbuffer toe aan elk RNA-monster.
   4. Verwarm het totale RNA tot 65 °C gedurende 2 minuten om secundaire structuren te verstoren.
   5. Plaats onmiddellijk op ijs totdat u klaar bent om door te gaan naar de volgende stap.
      OPMERKING: Incubatietijd kan variëren afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden verwerkt, maar mag niet langer zijn dan 1 uur om RNA-degradatie te voorkomen.
3. Poly-A selectie
   1. Voeg aan elke RNA-buis (vanaf stap 3.2) 100 μL gewassen magnetische kralen toe (vanaf stap 3.1).
   2. Meng grondig door op en neer te pipetteren en laat gedurende 15 minuten op een roterend wiel bij kamertemperatuur binden.
   3. Open alle buizen, plaats ze gedurende 1 minuut op de magneet en verwijder voorzichtig al het supernatant.
   4. Herstel het supernatant in een nieuwe buis en houd het apart voor een tweede ronde RNA-opname (stap 3.3.14), om het poly-A eindherstel te verbeteren.
   5. Verwijder de buis van de magneet en voeg 200 μL wasbuffer toe (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA). Mix door 4 tot 5 keer voorzichtig te pipetteren.
   6. Plaats de buis gedurende 1 minuut op de magneet en gooi het supernatant weg.
   7. Herhaal de wasstap eenmaal (herhaal stap 3.3.5 en 3.3.6).
   8. Voeg 20 μL ijskoude 10 mM Tris-HCl toe om poly-A RNA uit de kralen te elueren.
   9. Incubeer bij 80 °C gedurende 2 min.
   10. Plaats de buis op de magneet en breng het supernatant met het poly-A-RNA snel over naar een nieuwe RNase-vrije buis. Plaats de tube op ijs.
   11. Herhaal de elutiestap (stappen 3.3.8 tot en met 3.3.10) om de opbrengst te verhogen.
   12. Was dezelfde kralen één keer met 200 μL wasbuffer. Mix door 4 tot 5 keer voorzichtig te pipetteren.
   13. Plaats 1 minuut op de magneet en gooi de wasbuffer weg.
   14. Voeg de doorstroming van stap 3.3.4 toe aan de kralen en herhaal de procedure van binding tot elutie (stappen 3.3.2 tot en met 3.3.10). Bewaar de RNA-eluaten voorlopig in aparte buisjes.
       OPMERKING: Bewaar optioneel het supernatant equivalent van stap 3.3.4 in een nieuwe buis, omdat deze als controlemiddel kan worden gebruikt. Aan het einde van de procedure zuivert en concentreert u het RNA door ethanolprecipitatie of met een kolomgebaseerde methode naar keuze (d.w.z. RNA-reiniging en concentrator). Dit monster komt overeen met een poly-A-uitgeput RNA-monster en kan worden gebruikt als controlemiddel voor bisulfietconversie (stap 8.2.2).
   15. Kwantificeer het geëlueerde RNA met een spectrofotometer en houd een aliquot van 2 μL bij om de RNA-kwaliteit verder te beoordelen met een fragmentanalysator.
       OPMERKING: Poly-A RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C totdat het nodig is.

4. RNA-workflow

1. Verdeel de cellulaire poly-A RNA (mRNA) en virale RNA-monsters in 2 aliquots, gewijd aan de respectieve epitranscriptomische analysepijplijn:
   (i) 5 μg cellulair mRNA of 1 μg viraal RNA voor MeRIP-Seq en input controls (ga naar stap 5 tot en met 7 en stap 9).
   ii) 1 μg cellulair mRNA of 500 ng viraal RNA voor BS-Seq (ga naar stap 8 en 9).

5. RNA-fragmentatie

OPMERKING: RNA-fragmentatie wordt uitgevoerd met het RNA-fragmentatiereagens en is bedoeld voor MeRIP-Seq en controle-RNA-monsters. Dit is een zeer belangrijke stap die zorgvuldige optimalisatie vereist om fragmenten te verkrijgen die variëren tussen 100-200 nt.

1. Verdeel het totale volume mRNA in 0,2 ml PCR-buizen met 18 μL mRNA/buis.
   OPMERKING: Werk snel. Werk niet met meer dan 8 monsters tegelijk om reproduceerbare resultaten te hebben. Het opschalen van het volume garandeert geen reproduceerbare en uniforme fragmentatie.
2. Warm een thermocycler op bij 70 °C.
3. Voeg 2 μL fragmentatiereagens toe aan de rand van elke PCR-buis.
4. Sluit de buis en draai naar beneden (zodat het reagens tegelijkertijd in contact komt met RNA voor de 8 buisjes).
5. Incubeer de monsters 15 min bij 70 °C in de voorverwarmde thermocycler.
6. Zodra de incubatie voorbij is, voegt u snel 2 μL Stop-oplossing toe aan elke buis.
7. Draai naar beneden en laat op ijs zitten totdat je klaar bent om door te gaan naar de volgende stap.
   OPMERKING: Incubatietijd kan variëren afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden verwerkt, maar mag niet langer zijn dan 1 uur om RNA-degradatie te voorkomen.
8. Herhaal de procedure voor alle monsters (als er meer dan 8 aliquots zijn).
9. Bundel de buizen samen en ga verder met RNA-zuivering met een RNA-reinigings- en concentratorkit (stap 6) of een aangepaste kolomgebaseerde kit om de buffers te verwijderen en schoon gefragmenteerd RNA in water te herstellen.

6. RNA-zuivering

OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd door ethanolprecipitatie of met elke vorm van kolomgebaseerde RNA-zuiverings- en concentratiemethode (d.w.z. RNA Clean en Concentrator).

1. Eluteer of resuspend het gezuiverde RNA in een totaal volume van 50-75 μL DNase/RNase-vrij water.
   OPMERKING: Als een kolomgebaseerde methode wordt gebruikt, worden twee elutierondes sterk aanbevolen om maximaal herstel te garanderen.
2. Kwantificeer het gezuiverde gefragmenteerde mRNA met een spectrofotometer en beoordeel de RNA-kwaliteit met een fragmentanalysator.
3. Bewaar 100 ng gefragmenteerd mRNA als invoercontrole voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing (ga naar stap 9). Het resterende gefragmenteerde mRNA (minimaal 2,5 μg) kan worden gebruikt voor MeRIP (ga naar stap 7.2).

7. MeRip

OPMERKING: Voor elke immunoprecipitatie (IP) is minimaal 2,5 μg gefragmenteerd mRNA vereist, hetzij met behulp van een specifiek anti-m6A-antilichaam (testconditie) of met behulp van een anti-IgG-antilichaam (negatieve controle).

1. Magnetische kraalvoorbereiding voor immunoprecipitatie
   1. Bereid voor elk monster 4 ml 1x IP-buffer in een nieuwe conische buis door 800 μL mRNA IP-buffer 5x (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630 en nucleasevrij water) te verdunnen met 3,2 ml nucleasevrij water.
      OPMERKING: Er zijn ten minste 2 reacties nodig (één test en één IgG-controle).
   2. Plaats de tube op ijs.
   3. Label het juiste aantal microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor het aantal gewenste IP-reacties:
      n buisjes (test) voor anti-m6A antilichaam.
      n buizen (negatieve controle) voor Normale Muis IgG.
   4. Resuspend de magnetische kralen (bijv. Magna ChIP Protein A / G ) door omkeren en vortexen. Er mogen geen klontjes kralen zichtbaar zijn.
   5. Breng voor elke geplande reactie 25 μL magnetische kralen over naar een microcentrifugebuis.
   6. Voeg tien keer meer 1x IP-buffer (vanaf stap 7.1.1) toe ten opzichte van het oorspronkelijke volume gebruikte kralen (d.w.z. 250 μL 1x IP-buffer per 25 μL magnetische kralen).
   7. Meng de kralen door een paar keer voorzichtig op en neer te pipetteren voor volledige resuspensie.
   8. Plaats de buis gedurende 1 min op de magneetscheider.
   9. Verwijder en gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat u geen magnetische kralen opzuigt. Verwijder de buis uit de magneet.
   10. Herhaal de wasstap (stappen 7.1.6 tot en met 7.1.9).
   11. Resuspend de kralen in 100 μL 1x IP Buffer per 25 μL van het oorspronkelijke volume magnetische kralen.
   12. Voeg 5 μL antilichaam (1 μg/μL) toe per 25 μL oorspronkelijk volume magnetische kralen.
       n buisjes (test) met anti-m6A-antilichaam (kloon 17-3-4-1) [1 μg/μL].
       n buizen (negatieve controle) met Normale Muis IgG (1 μg/μL).
   13. Incubeer op het roterende wiel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om conjugatie van de antilichamen met de magnetische kralen mogelijk te maken.
   14. Plaats de buis gedurende 1 min op de magneetscheider. Gooi het supernatant weg. Verwijder de buis uit de magneet en resuspend het antilichaam-kraalmengsel in 100 μL 1x IP Buffer.
2. RNA Immunoprecipitatie (RIP)
   1. Bereid 500 μL RIP-reactiemengsel voor elk mRNA-monster van 2,5 μg als volgt: 2,5 μg in 100 μL gefragmenteerd RNA (vanaf stap 6.12); 295 μL nucleasevrij water; 5 μL 40 E/μL RNase-remmer; en 100 μL 5x IP-buffer.
   2. Voeg 500 μL RIP-reactiemengsel toe aan elk antilichaam-kraalmengsel (~100 μL uit stap 7.1.14). Meng door meerdere keren voorzichtig te pipetteren om de kralen volledig te reuspenderen. Plaats op ijs.
   3. Incubeer alle RIP-buizen op een roterend wiel gedurende 2 uur bij 4 °C.
   4. Centrifugeer de MeRIP-reacties kort om vloeistofdruppels van de dop- en buiszijden naar beneden te laten draaien. Plaats de buizen gedurende 1 min op een magneetscheider.
   5. Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis en zorg ervoor dat de magnetische kralen niet worden verstoord .
      OPMERKING: Flowthrough kan als controle worden gehouden om de RIP-efficiëntie te controleren (ga naar stap 7.3.9).
   6. Verwijder de buizen van de magneet. Was de kralen door 500 μL koude 1x IP-buffer toe te voegen. Meng de kralen door meerdere keren voorzichtig te pipetteren om de kralen volledig opnieuw te vullen.
   7. Plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetische afscheider en gooi supernatant weg.
   8. Herhaal de wasprocedure (stappen 7.2.6-7.2.7) tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten.
   9. Plaats de buizen op ijs en ga onmiddellijk over tot elutie.
3. Elutie
   1. Bereid 20 mM ^{m6A-oplossing} door 10 mg N6-methyladenosine, 5′-monofosfaat natriumzout (^m6A) op te lossen in 1,3 ml nucleasevrij water. Bereid 150 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
   2. Voor elk monster (test en controles): Bereid 225 μL elutiebuffer door de volgende componenten te mengen: 45 μL 5x IP-buffer, 75 μL 20 mM ^m6A, 3,5 μL 40U/μL RNase-remmer en 101,5 μL nucleasevrij water.
   3. Voeg 100 μL elutiebuffer (vanaf stap 7.3.2) toe aan de kralen (uit stap 7.2.9). Meng door meerdere keren voorzichtig te pipetteren tot volledig geresuspendeerde kralen.
   4. Incubeer alle buizen gedurende 1 uur met continu schudden op een wip bij 4 °C.
   5. Centrifugeer de RIP-reacties kort om vloeistofdruppeltjes van de dop- en buiszijden naar beneden te laten draaien. Plaats de buizen gedurende 1 min op een magneetscheider.
   6. Breng het supernatant met geëlueerde RNA-fragmenten over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pas op dat u de kralen niet opzwelt, omdat dit het achtergrondgeluid zal verhogen.
   7. Herhaal de elutiestappen (7.3.3 tot en met 7.3.6) door opnieuw 100 μL elutiebuffer toe te voegen, 1 uur bij 4 °C te incuberen en het eluaat na magnetische scheiding op te vangen.
   8. Combineer alle eluaten uit hetzelfde monster (het totale elutievolume moet 200 μL zijn).
   9. Zuiver het geëlueerde RNA en de doorstroming (optioneel, vanaf stap 7.2.5) door ethanolprecipitatie of door een kolomgebaseerde methode naar keuze (d.w.z. RNA Clean and Concentrator).
   10. Beoordeel de RNA-kwantiteit en -kwaliteit van doorstroom- en geëlueerde monsters met behulp van een fragmentanalysator met behulp van een detectiekit met hoge gevoeligheid. Als de kwaliteit van het RNA bevredigend is, ga dan verder met bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing (stap 9).
       OPMERKING: De hoeveelheid RNA die op MeRIP wordt opgehaald, is zeer laag en vereist absoluut detectiekits met een hoge gevoeligheid om kwantificering te garanderen. Als er geen bioanalyzer beschikbaar is, is het mogelijk om blindelings door te gaan met de voorbereiding van de bibliotheek.

8. RNA Bisulfiet Conversie

1. Controle en reagensvoorbereiding
   1. ERCC-mix spike-in control: Voeg ERCC-mix toe volgens de instructies van de fabrikant, die de toevoeging van 0,5 μL onverdund ERCC-mix aan 500 ng mRNA aanbeveelt. Deze controle kan helpen om de efficiëntie van bisulfietconversie te beoordelen.
   2. Spike Poly-A-depleted RNA (vanaf stap 3.3.14) in een verhouding 1/1000 (d.w.z. 500 pg poly-A-depleted RNA voor 500 ng mRNA). Dit monster is verrijkt met ribosomaal RNA en zou dus het 28S-rRNA moeten bevatten, een positieve controle voor bisulfietconversie.
      OPMERKING: Totaal RNA kan ook worden gebruikt als positieve controle in plaats van poly-A-uitgeput RNA.
   3. Voer bisulfietconversie uit met een RNA-methylatiekit (bijv. Zymo EZ).
   4. RNA-wasbuffer: voeg voor gebruik 48 ml 100% ethanol (of 52 ml 95% ethanol) toe aan 12 ml RNA-wasbufferconcentraat.
2. Bisulfiet conversie
   OPMERKING: Bisulfietconversie werd uitgevoerd met een in de handel verkrijgbare RNA-bisulfietconversiekit volgens de procedure van de fabrikant zoals hieronder vermeld.
   1. Voeg in 0,2 ml PCR-buizen 1000 ng mRNA toe (of tussen 300 en 1000 ng). Spike-in controles toevoegen: 1 μL ERCC-mix (stap 8.1.1) en 1000 pg poly-A-depleted RNA (stap 8.1.2). Volledig volume tot 20 μL met DNase/RNase-vrij water.
   2. Voeg 130 μL RNA-conversiereagens toe aan elk RNA-monster van 20 μL.
   3. Meng het monster door op en neer te pipetteren.
   4. Draai kort naar beneden om ervoor te zorgen dat er geen druppels in de dop of zijkanten van de buis zitten.
   5. Plaats de PCR-buizen in een thermische cycler en voer de volgende stappen uit: denaturatie bij 70 °C gedurende 5 minuten; omzetting bij 54 °C gedurende 45 minuten; herhaal denaturatie- en conversiestappen voor een totaal van 3 cycli; en vervolgens voor onbepaalde tijd bij 4 °C te houden.
      OPMERKING: Drie cycli van denaturatie en bisulfietconversie zorgen voor volledige bisulfietconversie van het monster. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 °C of direct worden verwerkt.
   6. Ga verder met in-column desulfonatie. Plaats een kolom in een lege opvangbuis en voeg 250 μL RNA Binding Buffer toe aan de kolom.
   7. Laad het monster (~150 μL uit stap 8.2.5) in de kolom met de RNA Binding Buffer en meng door op en neer te pipetteren.
   8. Voeg 400 μL 95-100% ethanol toe aan het monster-RNA Binding Buffer mengsel in de kolom. Sluit de dop en meng onmiddellijk door de kolom meerdere keren om te keren.
   9. Centrifugeer op volle snelheid (≥ 10.000 x g) gedurende 30 s. Gooi de flowthrough weg.
   10. Voeg 200 μL RNA-wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer op volle snelheid gedurende 30 s.
   11. Voeg 200 μL RNA-desulfonatiebuffer toe aan de kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na de incubatie centrifugeer je op volle snelheid gedurende 30 s. Gooi de flowthrough weg.
   12. Voeg 400 μL RNA-wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer op volle snelheid gedurende 30 s. Herhaal de wasstap met nog eens 400 μL RNA-wasbuffer. Gooi de flowthrough weg.
   13. Centrifugeer de kolom in de geleegde opvangbuis gedurende 2 minuten op volle snelheid. Breng de kolom over in een RNase-vrije buis.
   14. Voeg ≥ 10 μL DNase/RNase-vrij water rechtstreeks toe aan de kolommatrix en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 30 s.
       OPMERKING: We elueren meestal in een volume van 20 μL. Het geëlueerde RNA kan onmiddellijk worden gebruikt of gedurende maximaal 3 maanden worden bewaard bij -20 °C. Voor langdurige opslag, houd op -80 °C.
   15. Neem 2,5 μL voor fragment analyzer beoordeling van RNA kwaliteit en kwantiteit en ga verder met bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing (stap 9).
   16. Neem 4 μL geconverteerd RNA voor bisulfietconversiecontrole van efficiëntie (stap 8.3).
3. Bisulfiet conversie controle door RT-PCR
   OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat bisulfietconversie succesvol was voordat u overging tot sequencing. 28S ribosomaal RNA van Homo sapiens zal worden gebruikt als positieve controle voor RNA-methylatieanalyse, aangezien het C-residu op positie 4447 (GenBank-toetreding # NR_003287) is beschreven als 100% gemethyleerd.
   Primer Sequenties:
   H 28SF primer: 5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTGATTTTTTTTGGG-3'
   H 28SR primer: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
   1. Bereid reverse transcriptie (RT) reactiemix voor met behulp van een high-capacity cDNA reverse transcription kit. Ontdooi de kitcomponenten op ijs en bereid de RT-mastermix als volgt op ijs voor:
      4 μL bisulfiet geconverteerd RNA (uit stap 8.2.14):
      2 μL 10xRT Buffer
      0,8 μL van 25x dNTP Mix [100 mM]
      2 μL van 10x RT Random Primers
      1 μL MultiScribe Reverse Transcriptase
      1 μL RNase-remmer
      9,2 μL nucleasevrij _H2O
      OPMERKING: Elke RT-reactie moet een eindvolume van 20 μL bevatten in PCR-buizen van 0,2 ml.
   2. Plaats de buizen in de thermische cycler met het volgende RT-programma: 25 °C gedurende 10 minuten; 37 °C gedurende 120 min; 85 °C gedurende 5 minuten; dan bij 4 °C voor onbepaalde tijd.
   3. Bereid de PCR-reactie voor om specifiek het 28S-rRNA te versterken met een PCR-proefleesenzym. Ontdooi de onderdelen van de kit op ijs, vortex voorzichtig en centrifugeer kort. Bereid de PCR-mastermix als volgt op ijs of op een ijskoude metalen plaathouder:
      0,6 μL van 10 μM H 28SF primer
      0,6 μL van 10 μM H 28SF primer
      6,5 μL template cDNA
      22,5 μL DNA Polymerase master mix
      OPMERKING: Elke PCR-reactie moet een eindvolume van 20 μL bevatten in PCR-buizen van 0,2 ml.
   4. Plaats de buizen in de thermische cycler met het volgende PCR-programma: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten; 45 cycli van denaturatie (95 °C gedurende 15 s), gloeien (57 °C gedurende 30 s) en rek (72 °C gedurende 15 s), laatste rek bij 72 °C gedurende 10 minuten en vervolgens voor onbepaalde tijd bij 4 °C.
   5. Voer 10 μL van de reactie uit op een 2% agarose-gel. De verwachte bandgrootte is 130 - 200 bp.
4. Sequencing van PCR-producten
   1. Zuiver de PCR-producten met een kolomgebaseerde methode naar keuze om enzymen en dNTP-residuen te verwijderen en het geamputeerde DNA te elueren in ten minste 20 μL DNase / RNase-vrij water.
   2. Kwantificeer het gezuiverde DNA met een spectrofotometer.
   3. Sequencing reactie
      1. Gebruik 40 ng PCR-product/sequencingreactie.
      2. Volgorde in beide richtingen met de H 28SF en H 28SR primers.
      3. Lijn de sequenties uit met de bekende niet-geconverteerde sequentie (28S ribosomaal N5 (RNA28SN5). Controleer op de aanwezigheid van een C-residu op positie C4447 en op T-residuen in plaats van C elders.

9. Bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing

1. Bereid bibliotheken voor op sequencing met behulp van mRNA-kits (bijv. Illumina TruSeq Stranded), start het protocol bij de Elute-Prime-Fragment-stap en volg de instructies van de fabrikant.
   1. Voor de input RNA-Seq en MeRIP-Seq monsters, incubateer de monsters echter bij 80 °C gedurende 2 minuten om ze alleen te primen, maar niet verder te fragmenteren.
2. Voer sequencing uit met behulp van Illumina-platforms. Sequencingreacties kunnen worden uitgevoerd volgens voorkeuren en experimenteel ontwerp, hetzij enkele of gepaarde uiteinden, met een minimum van 100 nt lengte.

10. Bioinformatica Analyses

1. ^m6A Gegevensverwerking
   1. Voer ^FASTQC24 uit om de leeskwaliteit in ^m6A te beoordelen en FASTQ-bestanden in te voeren vanuit sequencing.
   2. Voer ^Atropos25 uit om end- en adaptersequenties van lage kwaliteit uit de reads bij te snijden. Stel de volgende parameters in bij het uitvoeren van Atropos.
      1. Verwijder de volgende adaptersequenties: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT.
      2. Gebruik de volgende Phred-kwaliteitsafsnijding: 5, voor het trimmen van uiteinden van lage kwaliteit zoals gespecificeerd door de fabrikant (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. Gebruik de volgende minimale leeslengte na het trimmen: 25 baseparen.
   3. Voeg het GRh38 menselijk genoom en HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] referentie samen in FASTA-formaat.
   4. Indexeer de samengevoegde referentie met ^HISAT226.
   5. Voer HISAT2 uit op bijgesneden leesbewerkingen om uit te lijnen met de geïndexeerde verwijzing. Gebruik standaard HISAT-parameters.
   6. Sorteer en indexeer de uitgelijnde reads met ^SAMtools27.
   7. Voer SAMtools stat en Qualimap ^{228 uit voor een} kwaliteitscontrole na uitlijning van de gesequentieerde bibliotheken.
   8. Verzamel en vat desgewenst kwaliteitsmetingen uit de vorige stap samen met ^multiQC29.
   9. Hiv-genoom heeft homologe 634 bp-sequenties in de 5' LTR en 3' LTR: Realign multimapping leest van 5' LTR naar het overeenkomstige 3' LTR-gebied met SAMtools.
   10. Om de ^m6A-pieken te identificeren, voert u de piekoproepsoftware MACS230 (v 2.1.2) uit. Selecteer zorgvuldig MACS2-actieve parameters om ervoor te zorgen dat de juiste werking op RNA-Seq-gegevens correct functioneert, aangezien piekoproepen kunnen worden beïnvloed door het genexpressieniveau en korte exonen ten onrechte als pieken kunnen worden genoemd. Daarom moet het ingangssignaal worden afgetrokken van het ^m6A-signaal, zonder de afvlakking die ROUTINEMATIG door MACS2 wordt toegepast op DNA-gebaseerde gegevens. Pas de volgende parameters toe op het subcommando 'callpeak' van MACS2:
       -keep-dup auto (regelt het MACS2-gedrag naar dubbele reads, 'auto' stelt MACS in staat om het maximale aantal reads op exact dezelfde locatie te berekenen op basis van binomiale verdeling met behulp van 1e-5 als p-waarde cutoff)
       -g 2,7e9 (grootte van het menselijk genoom in bp)
       -q 0,01 (minimale FDR-cutoff om significante pieken aan te roepen)
       -nomodel (om het bouwen van het schakelmodel te omzeilen, dat is afgestemd op ChIP-Seq-experimenten)
       -slokaal 0
       -llocal 0 (door deze en de vorige parameter op 0 in te stellen, kan MACS2 direct aftrekken, zonder af te vlakken, de invoer leest van de ^m6A-leest)
       -extsize 100 (gemiddelde lengte van fragmenten in bp)
       -B
   11. Voer het differentiële piekaanroepende subcommando van MACS2, 'bdgdiff' uit om geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters te vergelijken. 'bdgdiff' neemt als invoer de bedGraph-bestanden gegenereerd door 'callpeak' in de vorige stap. Voer voor elk tijdstip de vergelijking uit van geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters met 'bdgdiff', trek het respectieve ingangssignaal af van het ^m6A-signaal en geef de aanvullende parameters: -g 60 -l 120.
2. ^m5C Gegevensverwerking
   1. Voer ^Cutadapt31 uit om adapterreeksen uit de raw-reads bij te snijden, met de volgende parameters:
      adapter "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      -minimumlengte=25.
   2. Vul de bijgesneden reads omgekeerd aan met ^seqkit32, omdat het sequencingprotocol reads produceert van de omgekeerde streng.
   3. Voer FastQC uit om de leeskwaliteit te onderzoeken.
   4. Voeg GRh38 menselijk genoom en HIV [Geïntegreerde lineaire pNL4-3Env-GFP] referentie samen in FASTA-formaat.
   5. Indexeer de samengevoegde referentie met de toepassing meRanGh uit het meRanTK-pakket33.
   6. Lijn uit met meRanGh met de volgende parameters:
      -UN waardoor niet-toegewezen leesbewerkingen naar uitvoerbestanden kunnen worden geschreven
      -MM waardoor multi-mapped reads naar het uitvoerbestand kunnen worden geschreven
      -bg voor uitvoer in bedGraph
      -mbgc 10 filter gerapporteerde regio per dekking (ten minste 10 keer lezen van de dekking)
   7. Hiv-genoom heeft homologe 634 bp-sequenties in de 5' LTR en 3' LTR: reign multimapping reads from 5' LTR to the corresponding 3' LTR region with SAMtools.
   8. Voer methylatieoproepen uit via de meRanCall-tool, geleverd door meRanTK, met de volgende parameters:
      -rl = 126, leeslengte
      -ei = 0,1, foutinterval voor de berekening van de methylatiesnelheid p-waarde
      -cr = 0,99, verwachte conversie
   9. Voer het hulpprogramma van de MeRanTK estimateSizeFactors.pl uit voor het schatten van groottefactoren van elk monster. De groottefactoren worden gebruikt als parameters in de volgende stap.
   10. Voer MeRanCompare uit voor differentiële methylatieanalyse van niet-geïnfecteerde versus geïnfecteerde in tijdpunten 12, 24 en 36 uur. De volgende parameters worden toegepast: een significantiewaarde van .01 als minimale drempelwaarde voor rapportage en groottefactoren uit de vorige stap.

Resultaten

Deze workflow is nuttig gebleken om de rol van ^m6A- en ^{m5C-methylatie} in de context van HIV-infectie te onderzoeken. Hiervoor gebruikten we een CD4+ T cellijnmodel (SupT1) dat we ofwel infecteren met HIV of onbehandeld lieten. We begonnen de workflow met 50 miljoen cellen per aandoening en verkregen gemiddeld 500 μg totaal RNA met een RNA-kwaliteitsgetal van 10 (figuur 1A-B). Bij poly-A selectie haalden we tussen de 10 en 12 μg mRNA per conditie op (wat ongeveer 2% van het totale RNA vertegenwoordigt) (figuur 1B). Op dit punt gebruikten we 5 μg poly-A-geselecteerd RNA voor de MeRIP-Seq-pijplijn en 1 μg voor de BS-Seq-pijplijn. Omdat HIV-RNA gepoly-geïdenyleerd is, is er geen verdere actie nodig en kunnen MeRIP-Seq- en BS-Seq-procedures direct worden toegepast.

Figuur 1: RNA-voorbereiding voor downstreamtoepassingen. A) Workflow met RNA-voorbereiding en -distributie voor gelijktijdige MeRIP-Seq- en BS-Seq-pijplijnen. Elke gevulde zeshoekige vorm vertegenwoordigt een RNA-modificatietype, zoals ^m6A (groen) of ^m5C (roze). Hoeveelheden RNA-materiaal die nodig zijn om het experiment uit te voeren, worden aangegeven. B) Representatieve resultaten die de verwachte RNA-distributieprofielen (grootte en hoeveelheid) weergeven bij totale RNA-extractie (bovenste paneel) en poly-A-selectie (onderste paneel). Monsters werden op de fragmentanalysator geladen met standaard gevoeligheidskit om de RNA-kwaliteit te beoordelen voordat specifieke MeRIP-Seq- en BS-Seq-procedures werden ingevoerd. RQN: RNA-kwaliteitsnummer; nt: nucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MeRIP-Seq-pijplijn is een op RNA-immunoprecipitatie gebaseerde techniek die onderzoek naar ^{m6A-modificatie} langs RNA-moleculen mogelijk maakt. Hiervoor wordt RNA eerst gefragmenteerd en vervolgens geïncubeerd met ^{m6A-specifieke} antilichamen gekoppeld aan magnetische kralen voor immunoprecipitatie en -vangst. MeRIP-verrijkte RNA-fragmenten en de onaangeroerde (input) fractie worden vervolgens gesequenced en vergeleken om ^{m6A-gemodificeerde} RNA-gebieden en dus ^{m6A-gemethyleerde} transcripten te identificeren (figuur 2A). De resolutie van de techniek is afhankelijk van de efficiëntie van RNA-fragmentatie. Kortere fragmenten zorgen inderdaad voor een nauwkeurigere lokalisatie van het ^m6A-residu. Hier werden cellulaire poly-A-geselecteerde RNA's en virale RNA's onderworpen aan iongebaseerde fragmentatie met RNA-fragmentatiebuffer gedurende 15 minuten in een eindvolume van 20 μL om RNA-fragmenten van 100-150 nt te verkrijgen. Beginnend met 5 μg mRNA, herstelden we 4,5 μg gefragmenteerd RNA, wat overeenkomt met een herstelpercentage van 90% (figuur 2B). We gebruikten 100 ng gefragmenteerd, gezuiverd RNA als inputcontrole, direct onderworpen aan bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Het resterende RNA (~4,4 μg) werd verwerkt volgens de MeRIP-Seq-pijplijn, die begint met incubatie van gefragmenteerd RNA met kralen gebonden aan anti-m6A-specifieke antilichamen of aan anti-IgG-antilichamen als controle. m6A-specifieke RIP (MeRIP) van 2,5 μg gefragmenteerd RNA maakte het mogelijk om ongeveer 15 ng ^m6A-verrijkt materiaal op te halen dat bibliotheekvoorbereiding en sequencing onderging (figuur 2B). RIP met anti-IgG-controle leverde, zoals verwacht, niet genoeg RNA op om verdere analyse mogelijk te maken (figuur 2B).

Figuur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Schematische weergave van MeRIP-Seq workflow en input control. Na poly-A-selectie werden monsters gefragmenteerd in 120-150 nt-stukken en ofwel direct onderworpen aan sequencing (100 ng, inputcontrole), of gebruikt voor RNA-immunoprecipitatie (2,5 μg, RIP) met anti-m6A-specifiek antilichaam of anti-IgG-antilichaam als negatieve controle voorafgaand aan sequencing. B) Representatieve resultaten met verwachte RNA-distributieprofielen (grootte en hoeveelheid) bij fragmentatie (bovenste paneel) en RIP (onderste panelen, MeRIP: links, IgG-controle: rechts). Monsters werden geladen op fragmentanalysator om de RNA-kwaliteit en -concentratie te evalueren voordat ze verder werden verwerkt tot bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Gefragmenteerde RNA-analyse werd uitgevoerd met behulp van de RNA-standaardgevoeligheidskit, terwijl immunoprecipiteerd RNA de hoge gevoeligheidskit gebruikte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BS-Seq-pijplijn maakt exploratie van m5C-RNA-modificatie bij nucleotideresolutie mogelijk en leidt tot de identificatie van ^{m5C-gemethyleerde} transcripten. Bij bisulfietconversie worden niet-gemethyleerde cytosines omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde cytosines onveranderd blijven (figuur 3A). Vanwege de zware omstandigheden van de bisulfietconversieprocedure (d.w.z. hoge temperatuur en lage pH), worden geconverteerde mRNA's sterk afgebroken (figuur 3B), maar dit interfereert niet met bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Bisulfietconversie is alleen efficiënt op enkelstrengs RNA en kan dus mogelijk worden belemmerd door secundaire dubbelstrengs RNA-structuren. Om de efficiëntie van C-U conversie te evalueren, hebben we twee controles geïntroduceerd. Als positieve controle maakten we gebruik van de eerder beschreven aanwezigheid van een sterk gemethyleerde cytosine in positie C4447 van het 28S ^rRNA23. Na RT-PCR-amplificatie en sequencing van een 200 bp-fragment rond de gemethyleerde site konden we waarnemen dat alle cytosines met succes werden omgezet in uracils, waardoor ze als thymidines in de DNA-sequentie verschenen, behalve de cytosine op positie 4447 die onveranderd bleef. Als controle voor de conversiesnelheid van bisulfiet gebruikten we in de handel verkrijgbare synthetische ERCC-RNA-sequenties. Dit mengsel bestaat uit een pool van bekende, niet-gemethyleerde en poly-gedenyleerde RNA-sequenties, met een verscheidenheid aan secundaire structuren en lengtes. Bij de voorbereiding en sequencing van de bibliotheek hebben we ons gericht op deze ERCC-sequenties om de conversieratio te berekenen, die kan worden uitgevoerd door het aantal geconverteerde C te tellen onder de totale C-residuen in alle ERCC-sequenties en in elk monster. We verkregen een conversiepercentage van 99,5%, wat de efficiëntie en het succes van de bisulfietconversiereactie bevestigt (figuur 3D).

Figuur 3: BS-Seq pijplijn. A) Schematische weergave van bs-seq workflow. Bij poly-A-selectie worden monsters blootgesteld aan bisulfiet, wat resulteert in C naar U-conversie (als gevolg van deaminering) voor niet-gemethyleerde C-residuen. Gemethyleerde C-residuen (^m5C) worden daarentegen niet beïnvloed door bisulfietbehandeling en blijven ongewijzigd. B) Representatief resultaat van bisulfiet geconverteerd RNA-distributieprofiel (grootte en hoeveelheid) na analyse op fragmentanalysator met een standaard gevoeligheidskit. C) Elektroferogram met representatief sequencingresultaat van RT-PCR-amplicon van het gebied rond de 100% gemethyleerde C op positie 4447 in 28S-rRNA (blauw gemarkeerd). Daarentegen werden C-residuen van de referentiesequentie geïdentificeerd als T-residuen in de ampliconsequentie als gevolg van bisulfietconversiesucces. D) Evaluatie van de C-U-conversieratio door analyse van ERCC-spike-in-sequenties in HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. De gemiddelde conversieratio is 99,5%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

M6A-verrijkte monsters, bisulfiet geconverteerde monsters en inputcontroles worden verder verwerkt voor bibliotheekvoorbereiding, sequencing en bioinformatische analyse (figuur 4). Volgens het experimentele ontwerp en de biologische vraag(en) die aan bod komen, kunnen meerdere bioinformatische analyses worden toegepast. Als bewijs van principe tonen we hier representatieve resultaten van één mogelijke toepassing (d.w.z. differentiële methylatieanalyse), die zich richt op de identificatie van differentieel gemethyleerde transcripten geïnduceerd bij HIV-infectie. In het kort onderzochten we het ^m6A- of m5C-methylatieniveau van transcripten, onafhankelijk van hun genexpressieniveau, in zowel niet-geïnfecteerde als HIV-geïnfecteerde cellen, om de rol van RNA-methylaties tijdens de virale levenscyclus verder te begrijpen. Bij normalisatie van de genexpressie identificeerden we dat het ZNF469-transcript differentieel m6A-gemethyleerd was volgens de infectiestatus, inderdaad was dit transcript niet gemethyleerd in niet-geïnfecteerde cellen terwijl het verschillende gemethyleerde pieken vertoonde bij HIV-infectie (figuur 5A). Een vergelijkbare differentiële methylatieanalyse op ^m5C onthulde dat het PHLPP1-transcript verschillende gemethyleerde residuen bevatte, die vaker worden gemethyleerd in de HIV-toestand (figuur 5B). In deze context suggereren beide analyses dat HIV-infectie het cellulaire epitranscriptoom beïnvloedt.

Figuur 4: Schematische weergave van de bioinformatische workflow voor de analyse van ^m6A- en ^m5C-gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Voorbeeld van differentieel gemethyleerde transcripten bij infectie. A) Representatief resultaat dat ^{m6A-methylatie} van ZNF459-transcript in HIV-geïnfecteerde (groene) en niet-geïnfecteerde (grijze) cellen laat zien. Piekintensiteit (bij aftrek van invoerexpressie) wordt weergegeven op de y-as en positie in het chromosoom langs de x-as. Differentiële methylatieanalyse onthult dat het ZFN469-transcript hypermethyleerd is bij HIV-infectie. B) Representatief resultaat van ^m5C gemethyleerd gen in HIV-geïnfecteerde (bovenste rijstrook) en niet-geïnfecteerde (onderste rijstrook) cellen. De hoogte van elke staaf vertegenwoordigt het aantal aflezingen per nucleotide en maakt een dekkingsbeoordeling mogelijk. Elk C-residu wordt weergegeven in rood en het aandeel gemethyleerde C wordt weergegeven in blauw. De exacte methylatiesnelheid (%) wordt boven elk C-residu gerapporteerd. Pijlen markeren statistisch significant differentieel gemethyleerd C. Monsters werden gevisualiseerd met behulp van IGV-viewer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De rol van RNA-modificaties bij virale infecties is nog grotendeels onbekend. Een beter begrip van de rol van epitranscriptomische modificaties in de context van virale infectie zou kunnen bijdragen aan de zoektocht naar nieuwe antivirale behandelingsdoelen.

In dit werk bieden we een complete workflow die onderzoek van de ^m6A- en m5C-epitranscriptomen van geïnfecteerde cellen mogelijk maakt. Afhankelijk van de biologische vraag adviseren wij om poly-A-geselecteerd RNA als uitgangsmateriaal te gebruiken. Hoewel optioneel, omdat de pijplijn kan worden gebruikt met totaal RNA, is het belangrijk om in gedachten te houden dat rRNA's en kleine RNA's sterk gemodificeerd zijn en een belangrijk aantal gemethyleerde residuen bevatten. Dit kan resulteren in een verminderde kwaliteit en kwantiteit van zinvolle sequencinggegevens.

Als de focus van de studie echter niet-poly-geïdenyleerd RNA is, moet de RNA-extractiestap worden aangepast om te voorkomen dat klein RNA wordt weggegooid (in het geval van kolomgebaseerde RNA-extractie) en om ribosoom-depletietechnieken te bevoordelen in plaats van poly-A-selectie om de pijplijn binnen te gaan.

Om te zorgen voor RNA van hoge kwaliteit, correcte fragmentatie en geschikte ^{m6A-verrijkte} en BS geconverteerde RNA-kwaliteit voor bibliotheekvoorbereiding, raden we ten zeerste aan om een fragmentanalysator of een bioanalysator te gebruiken. Deze apparatuur is echter niet altijd beschikbaar. Als alternatief kunnen de kwaliteit van RNA, mRNA en de grootte van gefragmenteerd RNA ook worden beoordeeld door visualisatie op agarosegel. Als alternatief kan bibliotheekvoorbereiding worden uitgevoerd zonder voorafgaande beoordeling van de RNA-hoeveelheid.

We gebruikten de op antilichamen gebaseerde MeRIP-Seq16-techniek om het ^m6A epitranscriptomische landschap te verkennen. Deze techniek is gebaseerd op RNA-immunoprecipitatie en is succesvol; sommige stappen vereisen echter zorgvuldige optimalisatie en kunnen van cruciaal belang zijn. Hoewel ^{m6A-methylatie} voornamelijk binnen de consensussequentie RRA*CH voorkomt, komt dit motief zeer vaak voor langs mRNA-moleculen en maakt het geen nauwkeurige identificatie van de gemethyleerde plaats mogelijk. Het is dus van cruciaal belang om een reproduceerbare en consistente RNA-fragmentatie te bereiken, waarbij kleine RNA-fragmenten worden gegenereerd, om de op RIP gebaseerde resolutie te verbeteren. In dit protocol bevelen we een geoptimaliseerde procedure aan, die reproduceerbare en consistente resultaten oplevert in onze experimentele omgeving; Deze fragmentatiestap moet echter mogelijk verder worden geoptimaliseerd op basis van specifieke voorbeeldfuncties.

Onlangs werd een nieuwe techniek beschreven die ^m6A directe sequencing mogelijk maakt. Het is gebaseerd op het gebruik van specifieke reverse transcriptasevarianten die unieke RT-handtekeningen vertonen als reactie op het tegenkomen van ^{m6A RNA-modificatie24}. Deze technologie zou, na zorgvuldige optimalisatie, de belangrijkste beperking van MeRIP-Seq kunnen omzeilen (het verminderen van de hoeveelheid initieel materiaal en het toestaan van een hogere resolutie). Om de ^{m5C-modificatie} te onderzoeken, hebben we besloten om de bisulfietconversietechniek te gebruiken om bij nucleotideresolutie de gemodificeerde C-residuen te detecteren. Om de fout-positieve snelheid als gevolg van de aanwezigheid van secundaire RNA-structuren te verminderen, voerden we 3 cycli van denaturatie / bisulfietconversie uit en controleerden we de prestaties van de bisulfietconversie dankzij het gebruik van ERCC-spike-in-controles. Een van de beperkingen die aan deze techniek zijn gekoppeld, is dat bisulfietconversie zeer hard is en dat drie cycli van denaturatie / bisulfietconversie een deel van het RNA kunnen afbreken en dus de resolutie kunnen verminderen. In onze setting hebben we er echter voor gekozen om genoegen te nemen met een mogelijk iets lagere resolutie om de kwaliteit van de dataset te verhogen.

Dankzij deze optimalisaties en controles waren we in staat om een betrouwbare en degelijke workflow te bieden die kan worden gebruikt om het epitranscriptomische landschap en de verandering ervan te onderzoeken in de context van virale infecties, gastheer-pathogeen interacties of blootstelling aan specifieke behandelingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AccuPrime Pfx SuperMix	Invitrogen	12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1	Millipore	MABE1006
Chloroform	Merck	67-66-3
ERCC	Invitrogen	4456740
EZ RNA Methylation Kit	Zymo Research	EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit	Agilent	DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit	Agilent	DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA	Illumina	20020594
Magnetic Beads A/G Blend	Merck	16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A)	Sigma Aldrich	M2780-10MG
Normal Mouse IgG	Merk	12371
Oligo(dT)25	Life Technologies	61005,
PCRapace	Stratec	1020220300
Quick RNA Viral Kit	Zymo Research	1034
RNA Clean & Concentrator	Zymo Research	R1015
RNA Fragmentation Reagent	Ambion	AM8740
RNase Inhibitor	Ambion	AM2684
Trizol	TRIzol Reagent	15596026