Methodenartikel

Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique

DOI:

10.3791/62468

⸱

26 mei 2021

 ,  , 
1Laboratory of Physiology, Graduate School of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darmepitheel verleent niet alleen opname van voedingsstoffen, maar ook bescherming tegen schadelijke stoffen. De apicale meest epitheliale intercellulaire junctie, d.w.z. de tight junction, reguleert paracellulaire opgeloste stof en ionenpermeabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de bereiding van mucosale vellen en beoordeling van de ionenselectiviteit van tight junctions met behulp van Ussing-kamertechniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Ussing-kamertechniek werd voor het eerst uitgevonden door de Deense wetenschapper Hans Ussing in 1951 om het transcellulaire transport van natrium over kikkerhuid te bestuderen. Sindsdien is deze techniek op veel verschillende weefsels toegepast om de fysiologische parameters van transport over membranen te bestuderen. De Ussing-kamermethode heeft de voorkeur boven andere methoden omdat inheems weefsel kan worden gebruikt, waardoor het meer van toepassing is op wat er in vivo gebeurt. Omdat echter inheems weefsel wordt gebruikt, is de doorvoer laag, is de tijd beperkt en vereist weefselvoorbereiding vaardigheid en training. Deze kamers zijn gebruikt om specifieke transporteiwitten in verschillende weefsels te bestuderen, ziektepathofysiologie zoals bij Cystic Fibrosis te begrijpen, het transport en de opname van geneesmiddelen te bestuderen en vooral bij te dragen aan het begrip van het transport van voedingsstoffen in de darm. Gezien het hele epitheliale transportproces van een weefsel, zijn niet alleen transepitheliale paden, maar ook paracellulaire paden belangrijk. Tight junctions zijn een belangrijke determinant van weefselspecifieke paracellulaire permeabiliteit in de darm. In dit artikel zal de Ussing-kamertechniek worden gebruikt om de paracellulaire permselectiviteit van ionen te beoordelen door transepitheliale geleiding en verdunningspotentialen te meten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Ussing-kamermethode werd voor het eerst ontwikkeld door de Deense wetenschapper Hans Ussing. Ussing gebruikte het voor het eerst om de kortsluitstroom van natriumtransport over de kikkerhuid te meten nadat was waargenomen dat NaCl over de huid kon worden getransporteerd tegen een steile concentratiegradiënt1. Zijn systeem bestond uit de kikkerhuid gemonteerd tussen twee kamers met toegang tot beide zijden van de huid. Elke kamer bevatte ringer's oplossing die werd gecirculeerd en belucht. Twee smalle agar ringerbruggen in de buurt van de huid en verbonden met verzadigde KCl-calomel elektroden maten het potentiaalverschil zoals afgelezen door een potentiator. Een tweede paar agar ringerbruggen bevonden zich aan het andere uiteinde van elke kamer verbonden met bekers met verzadigde KCl verzadigd met AgCl om een elektromotorische kracht uit te oefenen die door een batterij wordt geleverd. Een potentiaalverdeler werd gebruikt om de spanning aan te passen, zodat het potentiaalverschil over de huid nul bleef, waardoor kortsluitingsomstandigheden ontstonden. Er werd ook een microampèremeter aangesloten om de stroom af te lezen die door de huid gaat (zie de figuur in ref.1 voor het oorspronkelijke kamerontwerp).

In de afgelopen 70 jaar is deze techniek toegepast op veel verschillende weefsels, met name darmweefsel, om het transport van voedingsstoffen en ionen te bestuderen. Het mechanisme van cholera-geïnduceerde diarree werd bijvoorbeeld bestudeerd door konijnenileum in deze kamers te monteren, en het bleek dat cholera toxine-geïnduceerde diarree wordt gemedieerd door cAMP2. Daarnaast werden deze kamers ook gebruikt om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan glucosetransport via Na+-Glucose cotransporter 1 (SGLT1)3. Ons lab richt zich op transcellulair en paracellulair transport in darmepitheelcellen. Met behulp van de Ussing-kamermethode werd peptidetransport beoordeeld in Claudin 15 knock-out muizen, die een verminderd paracellulair natriumtransport hebben, met behulp van Ussing-kamers om de absorptie van het niet-hydrolyseerbare dipeptide glycylsarcosine te meten. Het bleek dat luminale Na + homeostase belangrijk is voor proton-gekoppeld peptidetransport4. Bovendien werden deze kamers ook gebruikt om anionsecretie in de muriene blindedarm te onderzoeken als reactie op submucosale activering van proteïnase-geactiveerde receptor 1 door het serineprotease trypsine5.

Ussingkamers zijn onlangs ook gebruikt om de paracellulaire routes in epitheelweefsel te beoordelen. Paracellulaire routes worden gereguleerd door tight junctions, dat zijn complexen van eiwitten die zich vormen op het punt waar twee of meer cellen elkaar ontmoeten6. De barrièrefunctie en ionenselectiviteit (of anionen of kationen selectief door de tight junction kunnen gaan) wordt bepaald door de aanwezigheid van claudin-familie-eiwitten; waarvan sommige fungeren als barrières (claudin 3 en 7), anionporiën (claudin 10a) of kationporiën (claudin 2, 10b en 15)7. Andere methoden zijn gebruikt om de paracellulaire route te beoordelen, zoals orale maagsonde van FITC vergezeld van bloedplasma FITC-concentratie8, of EDTA-Cr9; deze technieken hebben echter een lagere resolutie en kunnen de ionenselectiviteit of een specifiek deel van de delen van het darmkanaal niet beoordelen. Ussingkamers kunnen echter worden gebruikt om het verdunningspotentieel van doelionen te beoordelen en daarom de ionenselectiviteit van de tight junctions te bepalen. Met NaCl kan bijvoorbeeld de selectiviteit van de tight junctions voor Na+ en Cl- worden berekend door één kant van het membraan (meestal de mucosale kant) te verdunnen en de verandering in transepitheliaal potentiaalverschil te meten. De relatieve permeabiliteiten van Na+ en Cl- kunnen worden geschat met de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking10 en de selectiviteit van de tight junction kan worden geschat met behulp van de Kimizuka-Koketsu-vergelijking11. Deze kamers hebben daarom het voordeel dat ze de elektrofysiologische parameters van weefsel meten en als gevolg daarvan meer informatie geven over de passage van ionen door de tight junctions dan andere methoden met een lagere resolutie.

De Ussing-kamermethode is niet alleen beperkt tot het darmkanaal, hoewel het veel wordt gebruikt in onderzoeken naar de darm, het heeft ook vele andere toepassingen. Deze kamers zijn bijvoorbeeld gebruikt om Cystic Fibrosis te bestuderen, en specifiek het chloridekanaal cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)12. Cystic Fibrosis wordt veroorzaakt door een mutatie in CFTR13, wat resulteert in verminderde chloridesecretie en vloeistoftransport door respiratoire epitheelcellen, en een resulterende dikkere, drogere slijmlaag14. Studie van luchtwegepitheel CFTR is uitgevoerd met deze kamers om niet alleen de ziekte te begrijpen, maar ook om manieren te ontdekken om de ziekte te behandelen. Bij patiënten met zeldzame mutaties die cystische fibrose veroorzaken, is bijvoorbeeld analyse van respiratoire epitheelcellen van de patiënt gebruikt om therapieën zoals Orkambi en een co-therapie met versterkers te testen15.

Ussing-kamers zijn ook gebruikt om routes van medicijnafgifte te bestuderen, zoals met menselijk biopsieweefsel om medicijnopname en farmacokinetiek te bestuderen16. Intestinale opname is niet de enige route van medicijnafgifte. Deze kamers zijn ook gebruikt om nasale medicijnafgiftesystemen te bestuderen17. Geneesmiddelenafgiftestudies met Ussing-kamers zijn ook uitgevoerd voor het oog. In het hoornvlies van konijnen werden permeabiliteits- en opnamestudies uitgevoerd met Labrasol, een medicijn dat is ontworpen om de absorptie van geneesmiddelen in weefsels te verhogen18. Een andere studie onderzocht het effect van benzylalkoniumchloride op transsclerale medicijnafgifte bij het konijn sclera19.

De Ussing-kamermethode is nuttig omdat inheems weefsel kan worden gebruikt. Als zodanig heeft het de voorkeur boven in vitro modellen zoals Caco-2 cellijnen. De techniek vereist echter vaardigheid en tijd om monsters voor te bereiden, dus het is niet geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer. De elektrofysiologische eigenschappen van celmonolagen kunnen worden bestudeerd met behulp van celkweekinzetstukken in deze kamers. Recente ontdekkingen hebben de kweek van organoïden mogelijk gemaakt, mini-organen die in cultuur worden gekweekt uit de oogst van epitheliale of endotheelstamcellen20. Organoïde cultuur kan worden gemanipuleerd om in een monolaag te worden gekweekt, waardoor het mogelijk wordt om organoïden in een Ussing-kamer te monteren21. Organoïden van verschillende epitheliale en endotheelweefsels kunnen worden bestudeerd, waardoor het aantal vereiste dieren wordt verlaagd, omdat organoïdecultuur op lange termijn kan worden gehandhaafd. Dit zal ook de doorvoer verhogen, omdat tijdrovende en moeizame weefseldissectie en voorbereidingsstappen niet nodig zijn. In de toekomst zullen Ussing kamerstudies zeer nuttig blijven voor het bestuderen van weefseltransport en ze zullen vooral belangrijk zijn op het gebied van gepersonaliseerde geneeskunde.

Het volgende protocol demonstreert de toepassing van de Ussing-kamermethode om de permselectiviteit en barrièrefunctie van de tight junctions in de dunne darm van Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) muizen en wildtype (WT) controles te beoordelen door het verdunningspotentieel van NaCl te meten. Tight junctions (TJ) worden gevormd op het punt waar twee of meer cellen elkaar ontmoeten in epitheel- en endotheelweefsel. Bicellulaire tight junctions (bTJ), met name de claudin-familie-eiwitten die worden aangetroffen in de bTJ, worden verondersteld de barrièrefunctie en permselectiviteit van TJ7 te bepalen. Cldn15-/- muizen hebben een mega dunne darm22 en verminderde opnamecapaciteit van voedingsstoffen als gevolg van het verlies van intestinale Na + recycling dat optreedt via claudin 154,23,24. Cldn15-/- muizen hebben een verminderde Na+ homeostase, waardoor ze een interessant model zijn voor het bestuderen van de permselectiviteit van de TJ. Het volgende protocol beoordeelt de permeabiliteit van de TJ tot NaCl door het meten van het verdunningspotentieel van NaCl (PNa/PCl) in de middelste dunne darm. Kortom, de verandering in membraanpotentiaalverschil die optreedt door verdunning van één kant van het membraan (M-kant of S-kant, beide worden gemeten in het onderstaande protocol) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van Na + (PNa) en Cl- (PCl) te berekenen, en de verdunningspotentiaal (PNa / PCl) zal aantonen of de tight junction een kationische of anionische selectiviteit heeft.

De experimenten in dit protocol werden uitgevoerd met behulp van een aangepaste Ussing-kamer (figuur 1A), die bestaat uit twee helften, waartussen het darmpreparaat verticaal is gemonteerd, spanningsklemversterker, elektrische recorder, elektroden, zoutbruggen, Ringer's oplossing, HEPES-buffer (150 mM NaCl), verdunde HEPES-buffer (75 mM NaCl), darmvoorbereiding (voor details over apparatuur zie de tabel met materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren die in deze experimenten werden gebruikt, werden onderhouden in de dierenverzorgingsfaciliteit van de Universiteit van Shizuoka en de experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor dieronderzoek die zijn opgesteld door de Universiteit van Shizuoka. Alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Shizuoka (Permits #205272 en #656-2303).

1. Bereiding van NaCl-elektroden

OPMERKING: De elektroden die in deze experimenten worden gebruikt, bestaan uit geconcentreerde NaCl of KCl. De KCl/calomel elektroden worden commercieel ingekocht. Voordat u met het experiment begint, moet u ervoor zorgen dat alle elektroden tot de bovenkant zijn gevuld met geconcentreerde NaCl- of KCl-oplossing.

  1. Bereid kleine glazen potten met plastic deksels (volume 20 ml).
  2. Boor twee gaten in de kunststof deksels, één voor de NaCl zoutbrug (2,5 mm diameter) en één voor zilverdraad (1 mm diameter; Figuur 1C, NaCl-elektrode).
  3. Vul de glazen pot met verzadigde NaCl-oplossing (ongeveer 15 ml, totdat deze vol is).
  4. Steek zilverdraad (0,8 mm diameter, 7 cm lang) in de pot, maar zorg ervoor dat het draadgedeelte buiten de pot via krokodillenklemmen (klein formaat) op het versterkersysteem kan worden aangesloten.
  5. Wanneer ze niet in gebruik zijn, wikkelt u de elektroden en zorgt u ervoor dat de gaten bedekt zijn met parafilm om uitdroging te voorkomen.

2. Voorbereiding van zoutbruggen

OPMERKING: Bereid zoutbruggen ten minste een dag voor het experiment voor om voldoende tijd te bieden om te stollen. Zoutbruggen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt, maar gebruik na 2 maanden wordt niet aanbevolen.

  1. NaCl zoutbruggen
    1. Bereid # 7 polyethylbuizen voor (buitendiameter 2,3 mm, binnendiameter 1,3 mm), 19 G naald en slotspuit, 200 ml 1 M NaCl-oplossing, 2 g agar, afsluitbare plastic container voor zoutbrugopslag.
    2. Bereid een passend aantal zoutbruggen voor door buizen te snijden tot de grootte die nodig is voor de Ussing-kamer die is ingesteld (elke kamer vereist twee zoutbruggen).
    3. Maak vóór het injecteren van agar een U-vorm met de buizen en plaats ze in een beker met warm water (om een eenvoudige vorm te creëren voor het opzetten van zoutbruggen).
    4. Maak 200 ml van 1 M NaCl door 11,688 g NaCl op te lossen in 200 ml in gedeïoniseerd water.
    5. Splits 1 M NaCl in porties van 100 ml: Maak 100 ml 2% agar in 1 M NaCl (meng 2 g agar in NaCl, verwarm in de magnetron om op te lossen).
    6. Gebruik een naald van 19 G en een borgspuit om de spuit te vullen met 1 M NaCl/agar-oplossing. Begin voorzichtig druppelsgewijs de oplossing uit te drijven en steek daarbij de naald in het ene uiteinde van de buis en vul totdat het mengsel van de andere kant naar buiten komt.
    7. Trek de naald langzaam terug terwijl u de oplossing nog steeds uitdrukt en herhaal dit totdat alle vereiste zoutbruggen zijn gemaakt. (Als de oplossing stolt in de spuit of naald, verwarm deze dan kort in heet water totdat de oplossing weer tot expressie kan worden gebracht.)
    8. Controleer zoutbruggen om er zeker van te zijn dat er geen bubbels zijn en bewaar in de resterende 1 M NaCl-oplossing in een afsluitbare container.
  2. KCl zoutbruggen
    OPMERKING: Dunnere buizen worden gebruikt voor de KCl-agarbruggen om de toename van de K + - concentratie in de buffer te voorkomen, omdat de zoutbrugpunten kunnen oplossen en K + in de buffer kan lekken.
    1. Bereid # 3 polyethylbuizen voor (buitendiameter 1,0 mm, binnendiameter 0,5 mm), 23 G naald- en slottype spuit, 200 ml 1 M KCl-oplossing, 2 g agar, afsluitbare plastic container voor zoutbrugopslag.
    2. Bereid een passend aantal zoutbruggen voor door de buizen op de maat te snijden die nodig is voor de Ussing-kamer die is ingesteld (elke kamer vereist twee zoutbruggen).
    3. Maak 200 ml van 1 M KCl door 14,91 g KCl op te lossen in 200 ml gedeïoniseerd water.
    4. Splits in twee porties van 100 ml: Maak 100 ml 2% agar in 1 M KCl (meng 2 g agar in KCl, verwarm in een magnetron om op te lossen).
    5. Injecteer met behulp van een naald van 23 G en een borgspuit de slang met 2% agar 1 M KCl mengsel (zorg ervoor dat de buizen volledig gevuld zijn en er geen bubbels zijn) op dezelfde manier als bij de NaCl zoutbruggen.
    6. Controleer zoutbruggen om er zeker van te zijn dat er geen bubbels zijn en bewaar in de resterende 1 M KCl-oplossing in een afsluitbare container.

3. Bereiding van ringer's oplossing en HEPES buffer

OPMERKING: Afhankelijk van het weefsel dat in de Ussing-kamer is gemonteerd, kunnen de componenten van de oplossing van Ringer verschillen. De hier gepresenteerde recepten zijn specifiek voor de dunne en dikke darm.

  1. Maak de oplossing van Ringer vers op de dag van de experimenten zoals beschreven in tabel 1.
  2. Bel de oplossing met 95% O2/5% CO2 om O2 aan het weefsel en een buffercapaciteit te geven.
Ringer's oplossing (dunne darm)Ringer's oplossing (dikke darm)
NaHCO3 – 21,0 mMNaHCO3 – 21,0 mM
K2HPO4 – 2,4 mMK2HPO4 – 2,4 mM
KH2PO4 – 0,6 mMKH2PO4 – 0,6 mM
NaCl – 119,0 mMNaCl – 119,0 mM
MgCl2 – 1,2 mMMgCl2 – 1,2 mM
CaCl2 – 1,2 mMCaCl2 – 1,2 mM
Indomethacine – 10 μM (Maak 1 mM bouillon in 21 mM NaHCO3, voeg 10 ml bouillon toe voor 1 l Ringer's oplossing)Indomethacine – 10 μM (Maak 1 mM bouillon in 21 mM NaHCO3, voeg 10 ml bouillon toe voor 1 l Ringer's oplossing)
1 mM glutamine (0,146 g/l)10m glucose

Tabel 1: Ringer's Solution Recept. Om de oplossing van Ringer te maken, mengt u alle componenten samen met gedeïoniseerd water. De oplossing van Ringer kan het beste vers worden gemaakt voordat er wordt geëxperimenteerd. Bewaren in de koelkast of op ijs tot gebruik. Voor gebruik gas met 95% O2/5% CO2.

  1. Maak HEPES-buffer vers op de dag van het experiment zoals beschreven in tabel 2 door ingrediënten te mengen in gedeïoniseerd water.
  2. Pas het uiteindelijke buffervolume aan na de aanpassing van de pH.
  3. Verwarm de HEPES-buffer tot 37 °C en stel de pH in op 7,4 door tijdens het roeren langzaam druppels van 1 M Tris-oplossing toe te voegen.
  4. Pas het uiteindelijke volume aan door de juiste hoeveelheid gedeïoniseerd water toe te voegen.
HEPES-bufferVerdunning HEPES Buffer
HEPES - 10 mMHEPES - 10 mM
Glucose – 10 mM (Dikke darm)Glucose – 10 mM (Dikke darm)
1 mM Glutamine (0,146 g/L) (Dunne darm)1 mM Glutamine (0,146 g/L) (Dunne darm)
NaCl – 150mMNaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (aan te passen voor osmolaliteitsverschillen)
MgCl2 - 1 mMMgCl2 - 1 mM
CaCl2 - 2 mMCaCl2 - 2 mM
Indomethacine – 10 μM (Maak 1 mM voorraad in 21 mM NaHCO3, voeg 10 ml bouillon toe voor 1 l Ringer's Solution)Indomethacine – 10 μM (Maak 1 mM voorraad in 21 mM NaHCO3, voeg 10 ml bouillon toe voor 1 l Ringer's Solution)
Stel in op pH 7,40 (37°C) met 1 M Tris

Tabel 2: HEPES buffer recept. Om HEPES-buffer en verdunning HEPES-buffer te maken, lost u alle ingrediënten op in gedeïoniseerd water. Oplossingen moeten worden aangepast met een 1 M Tris-oplossing, dus voeg geen volledig volume water toe (los bijvoorbeeld bij het maken van 1 L alle ingrediënten op in ongeveer 800 ml water). Verwarm vervolgens de oplossing tot 37 °C, stel de pH in op 7,4 en pas vervolgens het uiteindelijke volume aan.

4. Ussing kamer setup

OPMERKING: De Ussing-kamers die in dit protocol worden gebruikt, zijn op maat gemaakte continue perfusiekamers. Om de darmbarrièrefunctie van muizen of de opname van voedingsstoffen te beoordelen, worden kamers met een opening met een diameter van 4 of 5 mm aanbevolen25 (figuur 1A-C).

  1. Om het randeffect26 te verminderen en de kamers te helpen afdichten, bevestigt u 4 of 5 mm gestanste paraffinefilm (ongeveer 4 cm2) voordat u deze instelt (figuur 1B).
  2. Ingesteld in open circuitomstandigheden voor verdunningspotentiaalmeting. Ingesteld in de huidige klemmodus. Stel de uitgang in als stroom en stel de stroompuls in op ±20 μA.
  3. Bij het instellen in kortsluitomstandigheden voor het meten van kortsluitstroom en transmucosale weerstand, ingesteld in spanningsklemmodus. Stel de uitgang in als spanning en stel de spanningspuls in op ±5 mV.
  4. Zorg ervoor dat er water van 37 °C in de watermantel circuleert.
  5. Vul elke kamer met ringer's oplossing of HEPES buffer (hoeveelheid is afhankelijk van het gebruikte systeem, de kamers die hier worden gebruikt vereisen 5 ml voor elke kant) en zorg ervoor dat er geen lekken zijn.
  6. Sluit zoutbruggen en elektroden aan.
  7. Zorg ervoor dat de spanning 0 en stabiel is, pulsstroom om ervoor te zorgen dat zoutbruggen en elektroden correct zijn ingesteld.
  8. Laat de temperatuur van het systeem en de oplossing van Ringer gedurende ten minste 20 minuten in evenwicht blijven.
  9. Corrigeer na evenwicht het asymmetrische spanningsverschil tussen KCl-elektroden en compenseer de vloeistofweerstand door deze op nul te zetten (raadpleeg de handleiding voor het Ussing-kamersysteem dat wordt gebruikt om de juiste manier te bepalen).

5. Dissectie van darmweefsel

OPMERKING: Alle dierproeven moeten worden uitgevoerd binnen de voorschriften die door het land en de universiteit zijn vastgesteld.

  1. Voordat u het darmweefsel inneemt, bereidt u verse, ijskoude Ringer's oplossing en bubbel met 95% O2 en 5% CO2 gedurende 15 minuten (stap 3).
  2. Verdoving muizen volgens richtlijnen voor het gebruik van dieren in onderzoek. Voor dit experiment werden muizen verdoofd met 2%-3% isofluraan toegediend door een verdovingsmiddel. Controleer op de juiste anesthesie door in de tenen te knijpen en ervoor te zorgen dat er geen pijnreactie is.
  3. Maak een incisie in de buik met een schaar van het bekken tot het middenrif; lokaliseer de maag en snijd het pylorische uiteinde van de maag.
  4. Pak het maaggedeelte dat aan de dunne darm is bevestigd vast met een tang en trek voorzichtig aan de dunne darm terwijl je de mesenterische aanhechtingen wegsnijdt. Zorg ervoor dat u het darmweefsel op geen enkele manier snijdt of beschadigt.
  5. Ga door met het ontleden van de darm helemaal tot aan de anus. Voor de volledige verwijdering van de dikke darm snijdt u de bekkenbotten om het distale deel van de dikke darm te onthullen en verwijdert u voorzichtig de rest van de darm door de aanhechtingen weg te snijden.
  6. Meet de lengte van de darm en verdeel in de gewenste segmenten. Verdeel voor dit experiment de dunne darm in drie segmenten en gebruik het middelste segment.
  7. Plaats de gewenste segmenten in ijskoude, bubbelige Ringer's oplossing; open vervolgens elk segment in de lengterichting door langs de mesenterische hulpstukken te snijden. Knip vet en bindweefsel weg.
  8. Breng de segmenten terug naar de ijskoude Ringer-oplossing en was grondig (zelfs in de ijskoude oplossing is oxygenatie van het luminale epitheel belangrijk om de epitheelfunctie te behouden).

6. Strippen van de spierlaag en voorbereiding van de darmplaat

OPMERKING: Verwijdering van de serosa (spierlaag) is belangrijk voor transportstudies met behulp van de darm. Als de serosa blijft, kan het darmweefsel worden onderworpen aan willekeurige spiersamentrekkingen die de elektrofysiologische gegevens zullen vervormen en kan het transport worden geremd. Ongesnaard weefsel verslechtert snel wanneer het in Ussing-kamers wordt gemonteerd, omdat de serosa een belangrijke diffusiebarrière is voor substraat en zuurstof. In sommige speciale gevallen kan het nodig zijn om de spierlaag te behouden, dus de beslissing is aan de onderzoeker en het experimentele ontwerp. De darmvellen kunnen op twee manieren worden bereid, afhankelijk van welke laag wordt verwijderd (figuur 2). Voor dit experiment zijn mucosa- en submucosale preparaten vereist (figuur 2, 2e paneel).

  1. Bereid dissectieplaten (10 cm diameter) voor bedekt met siliconenrubber, pinnen (kleine acupunctuurnaalden), 5 mm gestanst filterpapier en parafilm vierkanten (2 cm x 2 cm; mogelijk niet nodig voor andere systemen).
  2. Giet verse, ijskoude, bubbelige Ringer's oplossing in de dissectieplaat (genoeg om het weefsel te bedekken, ongeveer 2-3 ml).
  3. Pin onder een stereomicroscoop de uiteinden van darmweefsel (slijmvlieszijde naar beneden).
  4. Ontleed met behulp van een fijne tang botweg de spierlaag van het onderliggende slijmvlies.
  5. Zorg ervoor dat u niet scheurt of gaten in het weefsel brengt.
  6. Zodra de spierlaag is verwijderd, snijdt u een stuk dat groot genoeg is voor een opening met een diameter van 5 mm. Bij het bereiden van de dunne darm moet de serosa-spierlaag binnen 10 minuten worden verwijderd, omdat luminale oxygenatie onder deze omstandigheden moeilijk is.
  7. Maak 5 mm gestanst filtreerpapier vierkant in ringer's oplossing nat en plaats het darmweefsel erop met de slijmvlieszijde naar beneden, omdat submucosale preparaten spontaan rondwikkelen met de mucosale kant naar buiten.
  8. Zorg ervoor dat de opening volledig bedekt is door het darmweefsel en dat er geen rimpels aanwezig zijn. Gebruik een zwart bord onder het preparaat om te onderzoeken of de opening volledig bedekt is.
  9. Herhaal deze procedure voor het vereiste aantal mucosale preparaten (in dit experiment zijn twee preparaten vereist: één preparaat zal worden gebruikt om het verdunningspotentieel te meten en het andere zal worden gebruikt om de elektrische basisparameters te meten).

7. Montage van darmpreparaten in Ussing-kamers

OPMERKING: De installatie is afhankelijk van het type Ussing-kamersysteem en het gebruikte registratiesysteem.

  1. Zuig de oplossing/HEPES-buffer van Ringer uit de Ussing-kamer.
  2. Demonteer de Ussing-kamer en leg het filterpapier met de darmpreparaatslijmvlieszijde naar beneden op de mucosale zijkamer en pas aan zodat het venster van de kamer uitlijnt met het gat van het filterpapier (Figuur 1A, zwarte markering rond het kamervenster is nuttig voor het uitlijnen van de preparaten).
  3. Plaats de Serosal-zijkamer voorzichtig op de Mucosale zijkamer en sluit goed, maar zorg ervoor dat het darmblad niet is verplaatst tijdens de verbinding.
  4. Vul beide kamers snel bij met Ringer's oplossing of HEPES-buffer en plaats borrelende toverstokken (Ringer's oplossing: 95% O2/5% CO2; HEPES-buffer: 100% O2) aan de andere kant van de kamers, weg van het membraan (te dicht bij het preparaat borrelen kan een effect hebben op de metingen).
  5. Sluit zoutbruggen opnieuw aan en controleer of de spanning stabiel is en de pulsstroom om ervoor te zorgen dat de verbindingen in orde zijn (figuur 1C).
  6. Herhaal dit voor elk darmpreparaat.
  7. Laat het systeem ongeveer 15 minuten in evenwicht blijven. Als u een opnamesysteem gebruikt, laat dan de geleiding en het Isc/membraanpotentiaalverschil stabiliseren voordat u met de experimenten begint.

8. Verdunningspotentiaalexperiment (open circuitomstandigheden)

  1. Was beide zijden van de kamer door de HEPES-buffer af te zuigen en aan elke kant 5 ml verse voorverwarmde HEPES-buffer toe te voegen.
  2. Schakel het opnamesysteem in. Stel het bereik in op 250 mV (het hier gebruikte systeem versterkt de uitgangsspanning 10x), stel markeringsposities in en stel het opnamesysteem in op maat.
  3. Zet Ussing-kamersystemen in de klemmodus en begin met meten. Zodra de membraanpotentiaal is gestabiliseerd (~ 15-20 minuten), kan de beoordeling beginnen.
  4. Zuig de HEPES-buffer van de mucosale zijde en vervang deze snel door 5 ml verwarmde verdunning HEPES-buffer met 75 mM NaCl.
  5. Zodra de membraanpotentiaal een piek heeft bereikt (5-10 min), verwijdert u de verdunningsbuffer van de "Mucosal" -zijde en vervangt u deze door hepes-buffer.
  6. Herhaal indien nodig stap 3 voor de Serosal-zijde en voeg verdunnings-HEPES-buffer toe aan de Serosal-zijde.
  7. Om ervoor te zorgen dat het weefsel levensvatbaar is, voegt u de adenylaatcyclaseactivator Forskolin (eindconcentratie 10 μM) toe aan de Serosal-zijde.
  8. Zodra het membraanpotentiaalverschil een piek heeft bereikt en is begonnen af te nemen, is het experiment voorbij.

9. Meting van transepitheliale elektrische geleiding en baseline Isc (kortsluitingsomstandigheden)

  1. Was beide zijden van de kamer door de ringeroplossing af te zuigen en aan elke kant 5 ml verse bubbeloplossing van ringer toe te voegen.
  2. Schakel het opnamesysteem in. Stel het bereik in op 2,5 V (het hier gebruikte systeem versterkt de uitgangsspanning 10x), stel markeringsposities in en stel het opnamesysteem in op meten.
  3. Zet Ussing-kamersystemen in de klemmodus en begin met meten; zodra Isc en geleiding zijn gestabiliseerd (~ 15-20 min), kunnen nulmetingen worden verkregen.
  4. Om ervoor te zorgen dat het weefsel levensvatbaar is, voegt u de adenylaatcyclaseactivator Forskolin (eindconcentratie 10 μM) toe aan de Serosal-zijde.
  5. Zodra het membraanpotentiaalverschil een piek heeft bereikt en is begonnen af te nemen, is het experiment voltooid.

10. Resultaten analyseren

  1. Bereken onder open circuitomstandigheden de transmucosale geleiding van de verandering van spanning als reactie op stroompulsen volgens de wet van Ohm. Bepaal de equivalente kortsluitstroom (Isc) van transmucosale spanning en geleiding volgens de wet van Ohm.
  2. Gebruik de verdunningspotentiaal van NaCl voor het berekenen van de relatieve ionische selectiviteit (PNa/PCl) met de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking10.
  3. Schat de absolute selectiviteit van de tight junction voor elk ion met behulp van de Kimizuka-Koketsu-vergelijking11.
  4. Bereken PNa/PCl met behulp van de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking uit verdunningspotentialen en bepaal absolute permeabiliteiten PNa en PCl uit de Kimizuka-Koketsu-vergelijking zoals beschreven door Yu et al.10 als volgt:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    waarbij, V: Verdunningspotentiaal (mV); α: Activiteitsverhouding. De berekende activiteit van NaCl in de HEPES-buffer gedeeld door de berekende activiteit van NaCl in de verdunning HEPES-buffer (voor dit experiment werd deze berekend als 1,8966); e: Wiskundige constante, 2,71828; GM: Transmucosale geleiding (mS/cm2); F: Constante van Faraday (96.485,3329 C/mol); R: Gasconstante (8,314 J/mol K); T: Temperatuur (310.15 K)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten in dit artikel zijn resultaten die deel uitmaakten van een groter project dat is voltooid (zie ref.4,23,24).

Transepitheliale elektrische geleiding van de dunne darm is verminderd bij Cldn15-/- muizen.
De baseline transmucosale geleiding (onder kortsluitingsomstandigheden) van het midden-dunne darm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit experiment werden Ussing-kamers gebruikt om de elementaire elektrische parameters en het verdunningspotentieel van NaCl in de dunne darm van Cldn15-/- en WT-muizen te meten. Het is erg belangrijk bij het uitvoeren van Ussing-kamerexperimenten om te verifiëren of het membraanpreparaat dat in de experimenten wordt gebruikt, levensvatbaar is. Dit wordt meestal gedaan door glucose of de adenylaatcyclase activator forskolin toe te voegen en te kijken of er een geschikte stijging is in Isc

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door 17K00860 (naar HH) en 19K20152 (naar NI). WH wil graag de Otsuka Toshimi Scholarship Foundation bedanken voor hun financiële steun van 2018-2021.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#3 polyethyl tubingHibikiouter diameter 1,0 mm; inner diameter 0,5 mm
#7 polyethyl tubingHibikiouter diameter 2,3 mm; inner diameter 1,3 mm
10 mL locking syringeTerumoSS-10LZLocking syringes zijn noodzakelijk om te voorkomen dat de naald losraakt tijdens het vullen
19 g naaldTerumoNN-1938RGebruik voorzichtigheid bij het werken met naalden en gooi ze in een puntenafvalbakken
23 g naaldTerumoNN-2332RGebruik voorzichtigheid bij het werken met naalden en gooi ze in een puntenafvalbakken
5 mm punchNANAGebruik om gaten in filterpapier en parafilm te ponsen
acupunctuurnaaldenSeirinNSGebruikt als dissectienaalden om weefsel aan de dissectieplaat te bevestigen
AgarFujifilm Wako010-15815
AlligatorklemmenNANAVerbindt de elektrode met de versterker
CaCl2Fujifilm Wako038-00445
D(-)-MannitolFujifilm Wako133-00845Dit wordt gebruikt om het verschil in osmolalitéit in verdunde HEPES-buffer te corrigeren
D(+)-GlucoseFujifilm Wako049-31165
DissectiekitJe hebt schaar en gebogen pincetten nodig
DissectieplatenWe gebruikten 10 cm celkweekplaten en bedekte met siliconenrubber
DMSOSigma472301-500MLVoor het maken van forskoline stock
Elektrische recorderTOA ElectronicsPRR-5041Andere equivalente elektrische recorders zijn commercieel verkrijgbaar
EpitheelspanningsklemversterkerNihon KohdenCEZ9100Andere equivalente versterkers zijn commercieel verkrijgbaar
filterpapier, in vierkanten gesnedenNANAGeplet met een 5 mm punch, gebruikt om darmvoorbereiding vast te houden
fijne pincettenFast GeneFG-B50476Voor een scherpe dissectie van de spierlaag
ForskolineAlomone LabsF-500Maak 10 mM stock in DMSO, de uiteindelijke concentratie zal 10 µM zijn
HEPESSigmaH4034-1KG
IndomethacineSigmaI7338-5GMaak een 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, de uiteindelijke concentratie is 10 µM
K2HPO4Fujifilm Wako164-04295
KClFujifilm Wako163-03545
KCl/calomel elektrodeAsch Japan Co.SCE-100
KH2PO4Kanto chemical32379-00
L(+)-GlutamineFujifilm Wako074-00522
MgCl2Fujifilm Wako135-00165
Gemengd gas (95% O2/5% CO2)Shizuoka Oxygen CompanyWordt gebruikt voor het bebellen van Ringer-oplossing en kamers bij gebruik van Ringer-oplossing
NaClFujifilm Wako191-01665
NaCl elektrodeNANAHandgemaakte elektroden die geconcentreerde NaCl en zilverdraad vereisen
NaHCO3Fujifilm Wako191-01305
O2 GasShizuoka Oxygen CompanyWordt gebruikt voor het bebellen van kamers bij gebruik van HEPES-buffer
parafilmBemisPM-996Wordt gebruikt om Ussing-kamers te verzegelen
pH meterDKK-TOA CorpHM-305HEPES-buffer moet worden aangepast naar pH 7,4 bij 37 °C
pH meter elektrodeDKK-TOA CorpGST-5311C
siliconenrubberShinetsu ChemicalKE-12Wordt gebruikt om dissectieplaten te vullen
zilverdraadWordt gebruikt voor het maken van NaCl-elektroden
Kleine potten met plastic dekselsNANAGebruik voor NaCl-elektroden
stereomicroscoopZeissStemi 305Een stereomicroscoop stelt u in staat diepte te zien, zodat u het weefsel gemakkelijker kunt dissecteren
Tris (Trizma base)SigmaT1503-1KGMaak een 1M oplossing om de pH van HEPES-buffers aan te passen
Ussing-kamersSanki Kagaku KougeiDeze kamers zijn op maat gemaakte continue perfusie Ussing-kamers met een raamdiameter van 5 mm
Waterpomp en verwarmingssysteemTokyo Rikakikai Co. Ltd.NTT-110

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
  2. Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
  3. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
  4. Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
  5. Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
  6. Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907(2010).
  7. Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
  8. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032(2018).
  9. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
  10. Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
  11. Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
  12. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
  13. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
  14. Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
  15. Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
  16. Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
  17. Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
  18. Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
  19. Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703(2005).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  21. Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
  22. Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
  23. Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376(2020).
  24. Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
  25. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
  26. Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
  27. Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
  28. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  29. Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
  30. Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tight junctionsdarmbarri reparacellulaire permeabiliteittransepitheliale conductantieverdunningspotentialenClaudin 15 knockoutkortsluitstroom

Gerelateerde artikelen