Methodenartikel

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62501

⸱

20 mei 2021

 ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de beenmergexplantmethode, van monstervoorbereiding tot microscopische dia-analyse, om het vermogen van megakaryocyten te evalueren die in hun fysiologische omgeving hebben gedifferentieerd om proplatelets te vormen.

Samenvatting

De laatste fase van megakaryopoiese leidt tot cytoplasmatische uitbreidingen van volwassen megakaryocyten, de zogenaamde proplatelets. Er is veel geleerd over de proplateletvorming met behulp van in vitro-gedifferentieerde megakaryocyten; er is echter een toenemend bewijs dat conventionele kweeksystemen het differentiatie- / rijpingsproces dat plaatsvindt in het beenmerg niet getrouw samenvatten. In dit manuscript presenteren we een explantmethode die oorspronkelijk in 1956 werd beschreven door Thiéry en Bessis om megakaryocyten te visualiseren die in hun oorspronkelijke omgeving zijn gerijpt, waardoor potentiële artefacten en verkeerde interpretaties worden omzeild. Verse beenmerg wordt verzameld door de dijbenen van muizen te spoelen, in 0,5 mm doorsneden en in een incubatiekamer bij 37 °C geplaatst met een fysiologische buffer. Megakaryocyten worden geleidelijk zichtbaar aan de periferie van de explant en worden tot 6 uur waargenomen onder een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een videocamera. Na verloop van tijd veranderen megakaryocyten van vorm, waarbij sommige cellen een bolvorm hebben en andere dikke uitbreidingen ontwikkelen of veel dunne proplatelets met uitgebreide vertakkingen uitbreiden. Er worden zowel kwalitatief als kwantitatief onderzoek verricht. Deze methode heeft het voordeel dat het eenvoudig, reproduceerbaar en snel is, omdat er talloze megakaryocyten aanwezig zijn, en klassiek vormt de helft van hen proplatelets in 6 uur vergeleken met 4 dagen voor gekweekte muizen megakaryocyten. Naast de studie van mutante muizen, is een interessante toepassing van deze methode de eenvoudige evaluatie van de farmacologische middelen op het proplatelet extensieproces, zonder het differentiatieproces dat in culturen kan optreden te verstoren.

Inleiding

De beenmergexplantatietechniek werd voor het eerst ontwikkeld door Thiéry en Bessis in 1956 om de vorming van megakaryocytencytoplasmatische extensies van ratten te beschrijven als een eerste gebeurtenis bij de vorming van bloedplaatjes1. Met behulp van fasecontrast en cinematografische technieken karakteriseerden deze auteurs de transformatie van volwassen ronde megakaryocyten in "inktvisachtige" trombocytogene cellen met cytoplasmatische extensies die dynamische bewegingen van verlenging en contractie vertonen. Deze armen worden geleidelijk dunner totdat ze volvormig worden met kleine zwellingen langs de armen en aan de uiteinden. Deze typische megakaryocytenverlengingen, verkregen in vitro en in vloeibare media, hebben bepaalde overeenkomsten met bloedplaatjes waargenomen in vast beenmerg, waar megakaryocyten lange verlengingen door de sinusoïdewandenin de bloedcirculatie uitsteken 2,3. De ontdekking en het klonen van TPO in 1994, maakte het mogelijk om megakaryocyten in cultuur te differentiëren die proplatelet-extensies kunnen vormen die lijken op die beschreven in beenmergexplantaten4,5,6. De rijping van megakaryocyten is echter veel minder efficiënt in kweekomstandigheden, met name het uitgebreide interne membraannetwerk van beenmergrijpe megakaryocyten is onderontwikkeld in gekweekte megakaryocyten, wat studies naar de mechanismen van biogenese van bloedplaatjes belemmert7,8.

We beschrijven hier het beenmergexplantatiemodel, gebaseerd op Thiéry en Bessis, om in real-time proplateletvorming van muis megakaryocyten te volgen, die volledig zijn gerijpt in hun oorspronkelijke omgeving, waardoor mogelijke in vitro artefacten en verkeerde interpretaties worden omzeild. Resultaten verkregen bij volwassen muizen van het wildtype worden gepresenteerd om het vermogen van megakaryocyten om proplatelets uit te breiden, hun morfologie en de complexiteit van proplatelets te illustreren. We introduceren ook een snelle kwantificeringsstrategie voor kwaliteitsvalidatie om de nauwkeurigheid en robuustheid van gegevens tijdens het megakaryocytenregistratieproces te garanderen. Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is de meest recente versie van de methode die eerder als boekhoofdstuk is gepubliceerd9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese normen 2010/63/EU en het CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments van de Universiteit van Straatsburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Bereiding van reagentia

  1. Reagentia bereiden zoals beschreven in tabel 1.
    1. Los voor de Stock I elk poeder afzonderlijk op. Zorg ervoor dat de osmolariteit van het preparaat hoger is dan 295 mOsm/L. Deze oplossing kan gedurende één jaar bij 4 °C worden bewaard.
    2. Maak voor het bufferpreparaat van tyrode de oplossing zoals beschreven in tabel 1,stel het volume met gedestilleerd water in op 100 ml en voeg 0,1 g watervrije D (+) sucrose toe. Stel in op pH 7,3 met 1 N HCl indien nodig en de osmolariteit tot 295 mOsm/L. Om bacteriegroei te voorkomen, voeg penicilline G toe bij 10 E / ml eindconcentratie en streptomycinesulfaat bij 0,29 mg / ml eindconcentratie. Filtreer de uiteindelijke oplossing door de poriën van 0,22 μm.

2. Voorbereiding van de proefopstelling

  1. Verwarm op de dag van het experiment de buffer van tyrode op 37 °C en zet de verwarmingskamer van de microscoop aan om de temperatuur op 37 °C te brengen.
  2. Bereid alle benodigde gereedschappen voor, zoals een timer, incubatiekamers, spuiten van 5 ml, 21 G, een tang, scheermesje, Pasteur-pipetten, glazen dia's en een centrifugebuis van 15 ml(figuur 1A).

3. Isolatie van het beenmerg van de muis

  1. Euthanasie C57BL/6 muizen van 8-12 weken door CO2 verstikking en cervicale dislocatie. Dit moet snel worden gedaan door een competent en gekwalificeerd persoon.
  2. Om microbiële besmetting te voorkomen, weekt u het muizenlichaam in 70% (v/v) ethanol voordat u de dijbenen verwijdert. Gebruik instrumenten gedesinfecteerd in 70% ethanol voor de dissectie. Verzamel de twee dijbenen en maak ze schoon door eventueel aanhangend weefsel te verwijderen. Na snelle onderdompeling in ethanol, plaats ze in een centrifugebuis van 15 ml met 2 ml Tyrode's buffer.
  3. Snijd de epifysen weg met een scherp scheermesje en spoel het beenmerg met een spuit van 5 ml gevuld met de buffer van 2 ml Tyrdode. Om dit te bereiken, introduceert u een naald van 21 G in de opening van het dijbeen (aan de kniezijde) en drukt u langzaam op de zuiger om een intacte mergcilinder op te halen(figuur 1B,C). Houd de mergverzamelingssessie zo kort mogelijk (minder dan 10 min).

4. Beenmergsectie en plaatsing in de incubatiekamer

  1. Gebruik een plastic pipet van 3 ml om het intacte beenmerg voorzichtig en voorzichtig over te brengen op een glazen dia. Het is belangrijk dat de monsters zijn afgedekt met buffer om uitdroging te voorkomen(figuur 1D).
    OPMERKING: Vermijd flow-reflow om scharen te minimaliseren die het weefsel kunnen dissociëren.
  2. Snijd onder een stereomicroscoop (10x) de uiteinden van het merg af die mogelijk zijn samengedrukt op het moment van de spoeling. Snijd vervolgens transversale secties met een scherp scheermesje. Secties moeten dun genoeg zijn om een gedetailleerde observatie mogelijk te maken, maar ervoor zorgen dat megakaryocyten niet worden beschadigd door compressie (meestal dikte rond 0,5 mm) (Figuur 1E,F).
    OPMERKING: De secties zijn gemaakt met een scherp scheermesje en onder een vergrootglas om hun dikte aan te passen aan ongeveer 0,5 mm. Alleen de secties van uniforme dikte worden geselecteerd. Deze procedure is niet ingewikkeld, maar de standaardisatie ervan vereist enige ervaring.
  3. Verzamel met behulp van een plastic pipet 10 secties in een buis van 1 ml met de buffer van Tyrode(figuur 1G).
  4. Breng de secties voorzichtig over naar een incubatiekamer met een diameter van 13 mm(figuur 1H).
  5. Zuig de buffer op en stel het volume in op 30 μL tyrodebuffer aangevuld met 5 % muizenserum.
    OPMERKING: Het is in dit stadium dat farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd om hun impact op de vorming van proplaatjes te evalueren.
  6. Plaats de secties op afstand. Sluit de zelfklevende kamer af met een afdekstrook met de afmeting 22 x 55 mm. Hellen van de dekenslip tijdens het plakken om de vorming van luchtbellen te voorkomen (figuur 1I).
  7. Plaats de kamer in de verwarmingskamer bij 37 °C. Vanaf dit moment wordt de chronometer gestart (T= 0 h). Het experiment duurt 6 uur bij 37 °C (T= 6 uur).

5. Real-time observatie van merg explants

  1. Gebruik een omgekeerde fasecontrastmicroscoop (40x lens voor vergroting) gekoppeld aan een videocamera om de beenmergexplantaties te observeren. Laat de cellen 30 minuten incuberen voordat de waarneming wordt gestart. Tijdens het observeren is het noodzakelijk om de focus aan te passen omdat megakaryocyten bewegen.
    OPMERKING: Andere observatiemodi zijn mogelijk (bijv. DIC, fluorescentie met muizen waarvan de megakaryocyten een endogene fluorescerende marker uitdrukken), maar fasecontrastmicroscopie is optimaal om de lange en dunne megakaryocytenuitbreidingen duidelijk te visualiseren, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is. Na 30 minuten migreren de mergcellen geleidelijk naar de periferie van de explant en vormen ze een monolaag. Na 1 uur incubatie kunnen megakaryocyten worden geïdentificeerd aan de hand van hun grote omvang en polylobulaire kernen (Figuur 1J, K). Na 3 uur incubatie neemt het aantal megakaryocyten toe en sommige hebben lange verlengingen.
  2. Maak video's om de transformatie van de megakaryocyten vast te leggen.

6. Kwantificering van de proplatelet-verlengende megakaryocyten

  1. Teken een kaart om elke sectie in de incubatiekamer te lokaliseren(figuur 1K).
  2. Identificeer na 1 uur de zichtbare megakaryocyten (d.w.z. gigantische polylobulated cellen) aan de periferie van elke sectie en plot hun posities op de tekening. Herhaal deze procedure na 3 en 6 uur.
    OPMERKING: Op basis van de tekening kan elke megakaryocyt gemakkelijk in de loop van de tijd worden gelokaliseerd en de evolutie van hun morfologie worden geanalyseerd (bijv. Grootte, vervorming, proplatelet-extensie, enz.). Een andere mogelijkheid is het gebruik van een specifieke navigatiesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwalitatieve resultaten. Aan het begin van het experiment worden alle cellen samengeperst in het beenmerggedeelte. Het duurt 30 minuten voordat de cellen duidelijk zichtbaar worden aan de periferie van de explantaten. De megakaryocyten zijn dan herkenbaar aan hun grote omvang en hun evolutie kan dan in de loop van de tijd worden bestudeerd (grootte, vorm, dynamiek, proplatelet extensie en bloedplaatjesafgifte) (Figuur 2A). Kleine megakaryocyten hebben een diameter tussen 20 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope in vitro methode om de efficiëntie van megakaryocyten te evalueren om proplatelets uit te breiden die in het beenmerg zijn gegroeid. Het beenmergexplantatiemodel voor muizen heeft vier belangrijke voordelen. Ten eerste zijn er geen geavanceerde technische vaardigheden vereist. Ten tweede is de tijd die nodig is om megakaryocytenverlengende voorplaatjes te verkrijgen vrij kort, slechts 6 uur voor de explantmethode, vergeleken met een minimum van 4 dagen voor een conv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert bedanken voor de technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 en ANR-18-CE14-0037.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 mL-spuitjesTerumoSS+05S1
21-gauge naaldenBD Microlance301155
CaCl2.6H2OSigma21108
Coverwall Incubatie KamersElectron Microscopy Sciences70324-02Diepte : 0,2 mm
HEPESSigmaH-3375pH aangepast naar 7.5
Menselijke serum albumineVIALEBEXgeautoriseerd geneesmiddel : n° 340095644699520% (200mg/mL -100mL)
KClSigmaP9333
MgCl2.6H2OSigmaBVBW8448
Micro DekglasElectron Microscopy Sciences72200-4022 mm x 55 mm
MicroscoopLeica Microsystems SA, Wetzlar, DuitslandDMI8 - 514341luchtlens
microscoop cameraLeica Microsystems SA, Wetzlar, DuitslandK5 CMS GmbH -14401137beeldresolutie : 4.2 megapixel
Muis serumBioWestS2160-010
NaClSigmaS7653
NaH2PO4.H2OSigmaS9638
NaHCO3SigmaS5761
PSG 100xGibco, Life Technologies1037-01610.000 eenheden/mL penicilline, 10.000 μg/mL streptomycine en 29,2 mg/mL glutamine
ScheermesjeElectron Microscopy Sciences72000
Sucrose D (+)SigmaG8270

Referenties

  1. Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
  2. Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
  3. Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
  4. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  5. Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
  6. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  7. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  8. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
  9. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
  10. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  11. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  12. Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).
  13. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  14. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  15. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  16. Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Megakaryocytdynamiekmuismegakaryocytenproplateletextensiemegakaryopoiesege nverteerde microscopietrombofiele ziektemorfologische classificatiefysiologische buffer

Gerelateerde artikelen