Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Megakaryocytencultuur in 3D-hydrogel op basis van methylcellulose om de celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en opsluiting te bestuderen

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62511

⸱

26 augustus 2021

 ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

In dit artikel

Samenvatting

Inmiddels wordt erkend dat de driedimensionale omgeving van cellen een belangrijke rol kan spelen in hun gedrag, rijping en/of differentiatie. Dit protocol beschrijft een driedimensionaal celkweekmodel dat is ontworpen om de impact van fysieke insluiting en mechanische beperkingen op megakaryocyten te bestuderen.

Samenvatting

De 3D-omgeving die leidt tot zowel opsluiting als mechanische beperkingen wordt steeds meer erkend als een belangrijke determinant van celgedrag. Zo is 3D-cultuur ontwikkeld om de in vivo situatie beter te benaderen. Megakaryocyten onderscheiden zich van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) in het beenmerg (BM). De BM is een van de zachtste weefsels van het lichaam, opgesloten in het bot. Omdat het bot slecht uitrekbaar is op celschaal, worden megakaryocyten tegelijkertijd onderworpen aan een zwakke stijfheid en hoge opsluiting. Dit protocol presenteert een methode voor het herstel van muizenlijnnegatieve (Lin-) HSPC's door immunomagnetische sortering en hun differentiatie in volwassen megakaryocyten in een 3D-medium bestaande uit methylcellulose. Methylcellulose is niet-reactief ten opzichte van megakaryocyten en de stijfheid ervan kan worden aangepast aan die van normaal beenmerg of worden verhoogd om een pathologisch fibrotisch merg na te bootsen. Het proces om de megakaryocyten te herstellen voor verdere celanalyses wordt ook gedetailleerd beschreven in het protocol. Hoewel proplateletuitbreiding wordt voorkomen binnen het 3D-milieu, wordt hieronder beschreven hoe de megakaryocyten in vloeibaar medium kunnen worden geresuspendeerd en hun vermogen om proplatelets uit te breiden te kwantificeren. Megakaryocyten gekweekt in 3D-hydrogel hebben een hogere capaciteit om proplatelets te vormen in vergelijking met die gekweekt in een vloeibaar milieu. Deze 3D-cultuur maakt het mogelijk om i) voorlopers te differentiëren naar megakaryocyten die een hogere rijpingstoestand bereiken, ii) om fenotypen te recapileren die in vivo kunnen worden waargenomen maar onopgemerkt blijven in klassieke vloeibare culturen, en iii) om transductieroutes te bestuderen die worden geïnduceerd door de mechanische signalen die door een 3D-omgeving worden geleverd.

Inleiding

Cellen in het lichaam ervaren een complexe 3D-micro-omgeving en worden onderworpen aan het samenspel tussen chemische en mechanofysische signalen, waaronder stijfheid van het weefsel en opsluiting als gevolg van naburige cellen en omringende matrix 1,2,3. Het belang van stijfheid en opsluiting voor celgedrag is pas de laatste decennia erkend. In 2006 benadrukte het baanbrekende werk van Engler et al. 4 het belang van de mechanische omgeving voor celdifferentiatie. De auteurs toonden aan dat variatie in celsubstraatstijfheid resulteerde in de oriëntatie van stamcellen op verschillende differentiatielijnen. Sindsdien is de impact van mechanische signalen op het lot en gedrag van cellen steeds meer erkend en bestudeerd. Ondanks dat het een van de zachtste weefsels van het organisme is, heeft het beenmerg een 3D-structurele organisatie die is opgesloten in het bot. De mergstijfheid, hoewel technisch moeilijk precies te meten, wordt geschat tussen 15 en 300 Pa 5,6. In het stroma zijn cellen strak aan elkaar gekluisterd. Bovendien migreren de meesten van hen naar de sinusoïde bloedvaten om de bloedcirculatie binnen te komen. Deze omstandigheden creëren extra mechanische beperkingen op aangrenzende cellen, die zich aan deze krachten moeten aanpassen. Mechanische signalen vertegenwoordigen een belangrijke parameter waarvan de gevolgen voor megakaryocytendifferentiatie en proplateletvorming onlangs zijn onderzocht. Hoewel megakaryocyten in vitro kunnen differentiëren in traditionele vloeibare cultuur, bereiken ze niet de mate van rijping die in vivowordt waargenomen , deels vanwege de afwezigheid van de mechanische signalen uit de 3D-omgeving 7. Groeiende voorlopers ingebed in hydrogel brengt 3D mechanische signalen die ontbreken in een vloeibaar milieu.

Hydrogels worden al tientallen jaren op grote schaal gebruikt op hematologisch gebied, met name om cellen te laten groeien in kolonievormende assays om hematopoëtische voorlopers te kwantificeren. Dergelijke hydrogels zijn echter zelden gebruikt om de biologische impact van de 3D-mechanische omgeving op rijping en differentiatie van hematopoëtische cellen te onderzoeken. In de afgelopen jaren heeft ons laboratorium een 3D-kweekmodel ontwikkeld met behulp van een op methylcellulose gebaseerde hydrogel 8. Deze niet-reactieve fysieke gel is een nuttig hulpmiddel om de fysieke beperkingen van de inheemse megakaryocytenomgeving na te bootsen. Het wordt afgeleid van cellulose door vervanging van hydroxylresiduen (-OH) door methoxidegroepen (-OCH3). Zowel de mate van methylsubstitutie als de methylcelluloseconcentratie bepalen de hydrogelstijfheid zodra deze is vereld. Tijdens de ontwikkelingsfase van deze techniek werd aangetoond dat een Young's modulus in het bereik van 30 tot 60 Pa de optimale gelstijfheid is voor megakaryocytengroei 9.

Het volgende protocol beschrijft een methode om megakaryocytische voorlopercellen van muizen te laten groeien in een 3D-methylcellulosehydrogel. Het is eerder aangetoond dat in vergelijking met standaard vloeibare cultuur, deze hydrogelcultuur de mate van polyploïdisatie van megakaryocyten verhoogt, de rijping en intracellulaire organisatie verbetert en de capaciteit van megakaryocyten verhoogt om proplatelets uit te breiden zodra ze zijn geresuspendeerd in een vloeibaar medium 9. Dit manuscript beschrijft in detail het protocol voor de isolatie van beenmerg Lin−-cellen van muizen en hun inbedding in een methylcellulosehydrogel voor 3D-cultuur, evenals de kwantificering van hun vermogen om proplatelets te produceren en het herstel van de cellen voor verdere analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle protocollen die in de video worden getoond, zijn uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese wetgeving en de aanbevelingen van de Review Board van het Etablissement Français du Sang (EFS). Een eerste versie van dit protocol werd oorspronkelijk gepubliceerd in 2018 in Methods in Molecular Biology 8.

OPMERKING: Figuur 1 geeft een schematisch beeld van het hele proces. Dit proces omvat 1) botdissectie, mergherstel en mechanische isolatie van mergcellen, 2) magnetische sortering van afstammingsnegatieve (Lin-) cellen, 3) zaaien in vloeibare of methylcellulosehydrogel en 4) resuspensie van megakaryocyten gekweekt in 3D-gel voor onderzoek van proplateletvorming in vloeibaar medium.

1. Botverzameling van volwassen muizen

OPMERKING: In deze sectie is het belangrijk om microbiële besmetting te minimaliseren.

  1. Bereid een buis van 15 ml voor botverzameling met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 1% van het totale volume penicilline-streptomycine-glutamin (PSG) antibioticamix (penicilline 10000 U / ml, streptomycine 100000 μg / ml en L-glutamin 29,2 mg / ml).
    OPMERKING: Als alle gebruikte muizen hetzelfde genotype hebben, pool dan alle botten in dezelfde buis met 1 ml DMEM - PSG 1% per aantal muizen. Antibiotica zijn belangrijk om mogelijke verspreiding van bacteriën tijdens de botbemonstering te voorkomen.
  2. Vul een buis van 50 ml met ethanol 70% voor botdesinfectie en een andere voor spoelinstrumenten tijdens de procedure. Gebruik gesteriliseerde dissectie-instrumenten.
  3. Verdoof de muizen met behulp van isofluraaninhalatie (4%) en ga snel over tot cervicale dislocatie om de muizen te euthanaseren. Dompel het lichaam snel onder in 70% ethanol om microbiële besmetting te desinfecteren en te voorkomen.
  4. Ontleed snel de tibia's en dijbenen.
  5. Snijd met behulp van een scalpel de epifysen van het enkelzijde-uiteinde voor het scheenbeen en van het heupzijde-uiteinde voor het dijbeen weg.
  6. Dompel de botten een seconde onder in 70% ethanol voordat je ze onderdompelt in DMEM-medium met 1% PSG.

2. Mergdissociatie en lincellenisolatie

OPMERKING: Dit deel van het protocol wordt uitgevoerd onder een laminaire stromingskap. Voor één cultuur maken alle putten deel uit van hetzelfde experiment en kunnen ze niet worden beschouwd als onafhankelijke biologische replicaties. De cellen van alle muizen worden samengevoegd om de homogeniteit van alle putten te garanderen en om ze met elkaar te kunnen vergelijken terwijl mogelijke interindividuele variabiliteit wordt geëlimineerd. Voor onafhankelijke biologische replicaties moet de cultuur worden herhaald.

  1. Plaats de botten in een petrischaaltje en laat ze twee keer rijzen in steriel Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) om mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
  2. Bereid DMEM - 1% PSG in een buis van 50 ml.
    OPMERKING: Geef 2 ml DMEM - 1% PSG per muis die voor het experiment is gebruikt.
  3. Vul een spuit van 5 ml uitgerust met een naald van 21 gauge met DMEM - 1% PSG.
  4. Houd het bot met een tang vast en introduceer alleen de schuine kant van de naald aan het uiteinde van de kniezijde.
    OPMERKING: De epifyse aan de kniezijde moet intact blijven van de dissectie, waardoor een kleine holte in het midden overblijft waardoor de naald kan worden ingebracht. De resterende epifyse zal het bot dat aan de naald is bevestigd tijdens het spoelen behouden. Zorg ervoor dat u niet meer dan de schuine kant in het bot introduceert, omdat dit het merg kan verpletteren en beschadigen.
  5. Druk snel op de zuiger van de spuit om het merg uit te spoelen in een buis van 50 ml.
    OPMERKING: Om spatten te voorkomen en de mergspoeling en -bevrijding te vergemakkelijken, plaatst u het vrije uiteinde van het bot op de buiswand, ondergedompeld in DMEM - 1% PSG. In de praktijk is een volume tussen 500 μL en 1 ml over het algemeen voldoende om het merg uit het bot te verdrijven. Wanneer het merg volledig is verdreven, is het bot wit geworden. In het geval dat het merg niet volledig uit de diafyse is verdreven, zoals beoordeeld door een resterende rode kleur, is het mogelijk om de spoeling te herhalen met vers medium.
  6. Herhaal stap 2.4. en 2.5. voor alle botten, het bijvullen van de 5 ml spuit met DMEM - 1% PSG indien nodig.
  7. Gebruik dezelfde spuit van 5 ml met de naald van 21 gauge om het totale volume medium met gespoeld merg over te brengen in buizen van 10 ml met ronde bodem.
    OPMERKING: Het is niet absoluut noodzakelijk om over te schakelen naar een buis met ronde bodem van 10 ml, maar het maakt het gemakkelijker om door te gaan naar de volgende dissociatiestappen. Aarzel niet om de spuit en/of naald te verwisselen als er gevaar voor besmetting wordt vermoed.
  8. Ga verder met celdissociatie door de medium- en mergcellen achtereenvolgens twee keer door een naald van 21 gauge, drie keer door een 23-gauge en eenmaal door een 25-gauge naald te aspirateren en te verdrijven.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen omdat dit schadelijk kan zijn voor de cellen.
  9. Breng de suspensie over in buizen van 15 ml.
  10. Meet het celnummer en controleer de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller of een celkamer voor handmatig tellen in aanwezigheid van trypan blue om dode cellen uit te sluiten.
  11. Centrifugeer de buizen van 15 ml gedurende 7 minuten bij 300 x g. Pipetteer met behulp van een transferpipet van 1 ml voorzichtig uit en gooi het supernatant weg.
  12. Isoleer stam- en voorlopercellen door negatieve immunomagnetische sortering met behulp van een muishematopoietische celisolatiekit.
    OPMERKING: Het doel van deze celsortering is om de cellen op te halen die negatief zijn voor alle selectieantistoffen (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119, 7-4) en daarom om de cellen te elimineren die al betrokken zijn bij een andere differentiatielijn dan de megakaryocytische.
  13. Volg de instructies van de kit om de cellulaire pellet opnieuw op te suspenderen in vers bereid M-medium (PBS met 2% van het uiteindelijke volume foetaal runderserum (FBS), EDTA 1 mM) tot een concentratie van 1 ×10 8 cellen/ml en verdeel de suspensie in polystyreenbuizen met ronde bodem van 5 ml tot een maximaal volume van 2 ml.
  14. Voeg toe aan de polystyreenbuizen: normaal rattenserum in een concentratie van 50 μL / ml en de gebiotinyleerde antilichaammix (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119, 7-4) in een concentratie van 50 μL mix per ml en homogeniseren door voorzichtig op de buizen te vegen.
    OPMERKING: Deze antilichamen binden zich aan cellen die al betrokken zijn bij een differentiatieroute, behalve de megakaryocytische route.
  15. Incubeer de buizen op ijs gedurende 15 minuten.
  16. Voeg streptavidin-gecoate magnetische kralen toe in een concentratie van 75 μL / ml en homogeniseren door voorzichtig met de buizen te vegen.
  17. Broed opnieuw op ijs gedurende 10 min.
  18. Stel indien nodig een eindvolume van 2,5 ml per buis met M-medium in.
  19. Homogeniseer de suspensie door voorzichtig met de buis te vegen vlak voordat u ze, zonder hun doppen, in een magneet plaatst en wacht drie minuten.
    OPMERKING: De cellen die al betrokken zijn bij een differentiatiepad en bedekt met magnetische kralen, worden vastgehouden op de wand van de buis in de magneet.
  20. Keer magneet en buis om de buisinhoud over te brengen in een nieuwe 5 ml polystyreenbuis met ronde bodem.
    OPMERKING: Haal de buis niet uit de magneet voor de overdracht; het wordt gedaan door de magneet om te keren met de buis er nog in. Gebruik een constante beweging en schud de buis niet.
  21. Gooi de eerste buis met ongewenste magnetisch gelabelde cellen weg en plaats de nieuwe, zonder dop, nog drie minuten in de magneet.
  22. Ga verder zoals in stap 2.20 en breng de geïsoleerde Lin−-cellen over in een nieuwe buis van 15 ml.
    OPMERKING: Als er meerdere polystyreenbuizen van 5 ml zijn gebruikt voor de vorige stappen, bundelt u alle cellen in dezelfde buis van 15 ml. De cellen die na de celsortering worden hersteld, zijn hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen. De aanwezigheid van trombopoietine (TPO), de belangrijkste fysiologische regulator van megakaryopoiese 10, zal de celdifferentiatie naar de megakaryocytische cellijn leiden.
  23. Meet het lin−-celnummer en de levensvatbaarheid zoals in stap 2.10.
  24. Bereken het vereiste volume celsuspensie om te centrifugeren om 1 x 106 levensvatbare cellen x Putnummer te hebben, Well Number is het aantal putten om per conditie te zaaien.
  25. Bereid één buis per toestand met het juiste volume celsuspensie en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 300 x g.
  26. Voor vloeibare culturen gooit u het supernatant weg en resuspend de celkorrel in het volledige kweekmedium (DMEM, PSG 1% van het uiteindelijke volume, FBS 10% van het uiteindelijke volume, hirudin 100 U/ml, TPO 50 ng/ml) om de uiteindelijke concentratie van 2 × 106 levensvatbare cellen/ml (gelijk aan 1 × 106 cellen per 500 μL goed) te bereiken. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2. (= dag 0 cultuur)
    OPMERKING: Zie de volgende paragraaf voor methylcelluloseculturen Als voorbeeld, om een volledig kweekmedium voor één put te bereiden, gebruikt u 435 μL DMEM, 50 μL 100% FBS voor 10% finale, 5 μL 100% PSG voor 1% finale, 5 μL 10 000 E/ml voor 100 E/ml definitief en 5 μL 5 μg/ml TPO voor 50 ng/ml definitief. 4-well of 24-well kweekplaten worden meestal gebruikt omdat hun putdiameter goed past bij de 500 μL die per put nodig is.

3. Celinbedding in methylcellulosehydrogel

OPMERKING: Houd er rekening mee dat het volgende protocol de methode beschrijft om een enkele put hydrogelcelkweek te verkrijgen, aan te passen aan het aantal benodigde putten.

  1. Ontdooi 1 ml aliquots van 3% methylcellulose stockoplossing bij kamertemperatuur. Bereid een apart extra aliquot methylcellulose voor spuitcoating.
    OPMERKING: Bij een concentratie van 3% blijft methylcellulose vloeibaar bij kamertemperatuur (20-25 °C).
  2. Bekleed een Luer-slotspuit van 1 ml uitgerust met een naald van 18 gauge met methylcellulose door 1 ml methylcellulose uit de extra aliquot te trekken. Verdrijft de methylcellulose volledig.
    OPMERKING: Deze coatingstap zorgt ervoor dat het volume methylcellulose dat in stap 3.3 wordt verzameld, exact is.
  3. Trek met dezelfde spuit en naald, maar met behulp van een nieuwe methylcellulose aliquot, het juiste volume methylcellulose (Figuur 2A).
    OPMERKING: Om een eindconcentratie van 2% methylcellulose in een eindvolume van 500 μL per put te bereiken, is 333 μL 3% methylcellulose vereist.
  4. Verwijder voorzichtig de naald. Schroef met behulp van een gesteriliseerde tang een Luer-vergrendelingsconnector op het uiteinde van de spuit(figuur 2B-C).
  5. Bevestig een tweede, niet-gecoate Luer-slotspuit van 1 ml op de Luer-slotconnector om de twee spuiten met elkaar te verbinden(figuur 2D).
    OPMERKING: Het is niet nodig om deze tweede spuit te coaten.
  6. Verdeel het methylcellulosevolume gelijkmatig over de twee spuiten (figuur 2E) en leg ze opzij tot stap 3.11.
  7. Bereid het geconcentreerde DMEM-kweekmedium zo dat in het uiteindelijke methylcellulosevolume (stap 3.11) een concentratie wordt verkregen die identiek is aan die van het vloeibare kweekmedium voor elke verbinding (PSG 1% van het uiteindelijke volume, FBS 10% van het uiteindelijke volume, hirudin 100 E/ml, TPO 50 ng/ml).
    1. Bereid 167 μL geconcentreerd kweekmedium per eindput van 1 × 106 cellen. Dit volume medium wordt berekend om een uiteindelijke methylcelluloseconcentratie van 2% te verkrijgen. Het totale volume in de put zal 500 μL (167 μL celsuspensie in geconcentreerd kweekmedium + 333 μL methylcellulose) zijn en alle componenten zullen een concentratie hebben die identiek is aan die in vloeibare putten.
    2. Als voorbeeld, om een volledig kweekmedium voor één put te bereiden, gebruikt u 102 μL DMEM, 50 μL 100% FBS voor 10% finale, 5 μL 100% PSG voor 1% finale, 5 μL 10 000 U/ml voor 100 U/ml finale en 5 μL 5 μg/ml TPO voor 50 ng/ml finale. Het geeft een volume van 167 μL dat wordt gebruikt om de cellen te resuspenderen en met de toevoeging van 333 μL methylcellulose zal het uiteindelijke volume 500 μL zijn.
  8. Na het voltooien van de centrifugatiestap 2.26 gooit u het supernatant weg en resuspendeert u de celkorrel in het geconcentreerde kweekmedium in een verhouding van 1 × 106 cellen per 167 μL.
  9. Neem de spuiten terug en koppel een van hen los van de connector.
  10. Pipet 167 μL van de celsuspensie.
  11. Voeg de celsuspensie rechtstreeks toe aan de spuitconnector(figuur 2F),zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingebracht.
    OPMERKING: Terwijl u de celsuspensie toevoegt, trekt u de zuiger van de spuit langzaam tegelijkertijd op om ruimte vrij te maken voor de celsuspensie.
  12. Sluit de twee spuiten(figuur 2G)voorzichtig opnieuw aan zonder de suspensie in de schroefdraad te verliezen.
    OPMERKING: Trek voordat u opnieuw aansluit de zuiger op om de connector half leeg te laten en voldoende ruimte te laten voor de tweede spuit om verbinding te maken zonder dat de suspensie overloopt.
  13. Homogeniseer het methylcellulosemedium langzaam met de celsuspensie met tien heen-en-weer zuigerbewegingen tussen de twee spuiten (figuur 2H).
  14. Trek het totale volume in één spuit en koppel de twee spuiten los, waarbij de connector op de lege spuit blijft zitten.
  15. Leeg de inhoud van de spuit in een put van een 4-putplaat(figuur 2I).
  16. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2 (= dag 0 kweek).
    OPMERKING: Het is mogelijk om twee methylcelluloseputten te bereiden met één paar spuiten. Verhoog met twee het volume methylcellulose en het volume van de celsuspensie om 2 x106 cellen te hebben. Na het voltooien van stap 3.13. verdeel het volume gelijkmatig over de twee spuiten om 500 μL in elk van hen te hebben. Koppel ze los en leeg degene zonder de connector in een cultuurput. Sluit de spuiten opnieuw aan om het volume over te brengen van de spuit die de connector heeft vastgehouden naar de andere. Koppel de spuiten los, die met de 500 μL mag de connector niet hebben bevestigd, en zaai de cellen in een tweede kweekput. De 3% methylcellulose wordt gekocht als een voorraadoplossing in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), terwijl geconcentreerde cellen worden gesuspendeerd in DMEM. Vergelijkende tests zijn in eerste instantie uitgevoerd om ervoor te zorgen dat dit gemengde medium geen invloed had op de uitkomst van het experiment, vooral in vergelijking met de vloeibare cultuur in 100% DMEM.

4. Cel resuspensie voor proplateletanalyse

OPMERKING: Analyse van het vermogen om proplatelets te vormen moet worden uitgevoerd onder vergelijkbare omstandigheden tussen vloeibare en met methylcellulose gekweekte megakaryocyten. De fysieke beperkingen die de methylcellulosehydrogel uitoefent, remmen de uitbreiding van proplaatjes. Daarom worden met methylcellulose gekweekte cellen op dag 3 van de kweek geresuspendeerd in vers vloeibaar medium om ze in staat te stellen proplatelets uit te breiden. Methylcellulose hydrogel is een fysische hydrogel die gemakkelijk kan worden verdund bij toevoeging van vloeibaar medium. Belangrijk is dat om artefacten van resuspensie en centrifugering te voorkomen, cellen in de vloeibare mediumconditie van de controle tegelijkertijd op dezelfde manier moeten worden behandeld als met methylcellulose gekweekte cellen. Raadpleeg de schematische weergave van het experiment(figuur 1).

  1. Bereid 10 ml DMEM - 1% PSG voorverwarmd bij 37 ° C in een buis van 15 ml voor elke put om te resuspendiëren.
  2. Resuspend de cellen voorzichtig uit elke put in de 10 ml DMEM - 1% PSG.
    OPMERKING: Voer voorzichtig verschillende op-en-neer bewegingen uit om de methylcellulose volledig te verdunnen. Zorg ervoor dat je voor de vloeistofputten alle cellen verzamelt die op de bodem van de put zijn afgezet.
  3. Centrifugeer de buizen 5 min bij 300 × g.
  4. Bereid ondertussen het volledige kweekmedium voor (DMEM, PSG 1% van het uiteindelijke volume, FBS 10% van het uiteindelijke volume, hirudin 100 U/ml, TPO 50 ng/ml).
    OPMERKING: Bij deze stap wordt elke put opgehaald om met de helft te worden verdund, bereid daarom 1 ml volledig kweekmedium per put voor.
  5. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 1 ml kweekmedium voor elke buis.
  6. Opnieuw 500 μL celsuspensie per put in een plaat met 4 of 24 putten en incubeer bij 37 °C onder 5% CO2.
    OPMERKING: Verkrijg uit één initiële put 2 putten voor proplateletvisualisatie in tweevoud. Houd er rekening mee dat aangezien deze duplicaten afkomstig zijn van hetzelfde monster, ze niet als onafhankelijke replicaties kunnen worden beschouwd.
  7. 24 uur na het opnieuw inzaaien, op dag 4 van de cultuur, willekeurig 10 beelden per put verkrijgen met behulp van heldere veldmicroscopie en het 20× objectief.
    OPMERKING: De cellen hebben de neiging om zich in het midden van de put te groeperen, zorg ervoor dat u niet te veel cellen op het veld hebt, omdat dit proplatelet visualisatie en kwantificering moeilijk kan maken. Zorg ervoor dat je minstens 5 megakaryocyten per veld vangt.
  8. Tel het totale aantal megakaryocyten en megakaryocyten die proplatelets verlengen in elke afbeelding en bereken het aandeel megakaryocyten dat proplatelets verlengt.
    OPMERKING: De kwantificering is niet geautomatiseerd; voer het tellen van cellen handmatig uit. Tellen kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van de celtellerplug-in van ImageJ om op de cellen te klikken om ze te markeren terwijl ze worden geteld. 10 velden verworven per put en putten in tweevoud vertegenwoordigen ongeveer 150-300 megakaryocyten per conditie.

5. Celfixatie en -opvraging voor toekomstige analyses

LET OP: Dit protocol maakt gebruik van fixatieven die onder een zuurkast moeten worden gehanteerd, met beschermende uitrusting.

OPMERKING: Het doel is om de gelbeperkingen die op de cellen worden aangebracht intact te houden totdat ze volledig zijn gefixeerd. Daarom, en ongeacht het gebruikte fixatief, moet het worden toegevoegd in de put bovenop de methylcellulose, zonder de gel te verstoren. Hetzelfde protocol wordt toegepast op vloeibare culturen.

  1. Voeg een volume fixatieve oplossing toe dat gelijk is aan het gezaaide volume (500 μL in dit protocol), bovenop de methylcellulose zonder de gel te verstoren. Wacht op het juiste moment volgens het gebruikte fixatiemiddel (ten minste 10 minuten).
    OPMERKING: De fixatieve diffusie door de gel moet zeer snel zijn, zoals blijkt uit een snelle verandering in de gelkleur (van roze naar een geeloranje tint). Paraformaldehyde (8% in DPBS, 500 μL per put) wordt meestal gebruikt voor immunolabeling, terwijl glutaraldhehyde (5% in cacodylaatbuffer, 500 μL per put) wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie-analyse.
  2. Gebruik een P1000-pipet om voorzichtig verschillende op en neer pipetteren met het fixeermiddel en de gel om de methylcellulose homogeen te verdunnen.
  3. Breng met dezelfde pipet en punt al het volume van de put over in een buis van 15 ml met 10 ml DPBS en homogeniseer.
  4. Centrifugeer het mengsel gedurende 7 minuten bij 300 × g.
    OPMERKING: Een tweede wasstap kan nodig zijn om alle methylcellulose te elimineren
  5. Gooi het supernatant weg en resuspend de megakaryocytkorrel in het juiste medium volgens de gewenste analyse (immunolabeling, flowcytometrie9, elektronenmicroscopie ...) (voor elektronenmicroscopie zie ook de papieren methode"In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy" in dit JoVE nummer).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gegevens verkregen met behulp van dit protocol werden oorspronkelijk gepubliceerd in Blood in 20169.

Volgens het protocol werden de cellen gezaaid in vloeibaar of methylcellulose hydrogel medium. Cellen in vloeibaar medium zijn allemaal bezinkseld op de bodem van de put, in contact met het stijve plastic oppervlak en soms met andere cellen. Cellen ingebed in methylcellulosehydrogel worden daarentegen homogeen verdeeld in de gel en geïsoleerd uit naburige cellen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In het afgelopen decennium heeft mechanobiologie steeds meer belangstelling gewekt voor veel gebieden van de biologie. Het wordt nu algemeen erkend dat de mechanische omgeving rond de cellen een rol speelt in hun gedrag, met de nadruk op het belang om te bestuderen hoe megakaryocyten voelen en reageren op extracellulaire mechanische signalen. Het is een uitdaging om de stijfheid van het beenmergweefsel in situnauwkeurig te meten11, vooral als we het hematopoëtische rode merg beschouwen, o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Fabien Pertuy en Alicia Aguilar bedanken die deze techniek aanvankelijk in het laboratorium ontwikkelden, evenals Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) die de visco-elastische eigenschappen van de methylcellulosehydrogel karakteriseerde. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) en door een ARN-subsidie (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher is een ontvanger van de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-subsidienummer FDT202012010422).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18-gauge naaldenSigma-Aldrich1001735825
21-gauge naaldenBD Microlance301155
23-gauge naaldenTerumoAN*2332R1
25-gauge naaldenBD Microlance300400
4-puts kweekschotelsThermo Scientific144444
5 mL spuitenTerumoSS+05S1
CytoclipsMicrom MicrotechF/CLIPSH
Cytofunnels uitgerust met filterkaartenMicrom MicrotechF/JC304
Cytospin centrifugeThermo ScientificCytospin 4
DakopenDako
DMEM 1xGibco, Life Technologies41 966-029
DPBSLife Technologies14190-094Steriele Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing
EasySep magnetenStem Cell Technologies18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolatiekitStem Cell Technologies19856Agebiotineerde antilichamen (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) en met streptavidine gecoate magnetische kralen
EDTAInvitrogen15575-020
Fetaal runderserumHealthcare Life ScienceSH30071.01
Luer lock 1 mL spuitenSigma-AldrichZ551546-100EAof 309628 spuiten van BD MEDICAL
Luer lock spuitconnectorenFisher Scientific11891120
MC 3%R&D systemsHSC001
Met polylysine gecoate slidesThermo ScientificJ2800AMNZ
PSG 100xGibco, Life Technologies1037-01610.000 eenheden/mL penicilline, 10.000 μg/mL streptomycine en 29,2 mg/mL glutamine
RattenserumStem Cell Technologies13551
Recombinant hirudineTransgènerHV2-Lys47
Recombinant humaan trombopoietine (rhTPO)Stem Cell Technologies282210.000 eenheden/mL
Rond gebogen 10 mL kunststofbuizenFalcon352054
Rond gebogen 5 mL polystyreen buizen

Referenties

  1. Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  2. Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
  3. Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
  6. Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
  7. Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
  8. Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
  9. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
  10. Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
  11. Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
  12. Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
  13. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  14. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

3D-hydrogelmethylcellulosehydrogelgemiddelde stijfheidcelopsluitinghematopoëtische progenitorcellenproplaatjesvormingflowcytometrieelektronenmicroscopie
Megakaryocytencultuur in 3D-hydrogel op basis van methylcellulose om de celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en opsluiting te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.