Laboratoriumproeven met kleine kooien van genetisch gemanipuleerde anophelinemuggen

Samenvatting

De protocollen die hier worden gerapporteerd, illustreren drie alternatieve manieren om de prestaties van genetisch gemanipuleerde muggen te beoordelen die bestemd zijn voor vectorcontrole in laboratorium-ingesloten kleine kooiproeven. Elk protocol is afgestemd op de specifieke modificatie die de muggenstam draagt (gene drive of non-gene drive) en de soorten gemeten parameters.

Samenvatting

Bestrijding van door muggen overgedragen pathogenen met behulp van genetisch gemodificeerde vectoren is voorgesteld als een veelbelovend hulpmiddel om conventionele bestrijdingsstrategieën aan te vullen. Crispr-gebaseerde homing gene drive-systemen hebben transgene technologieën toegankelijker gemaakt binnen de wetenschappelijke gemeenschap. Evaluatie van transgene muggenprestaties en vergelijkingen met wilde tegenhangers in kleine laboratoriumkooiproeven leveren waardevolle gegevens op voor het ontwerp van daaropvolgende veldkooiexperimenten en experimentele beoordelingen om de strategieën voor ziektepreventie te verfijnen. Hier presenteren we drie verschillende protocollen die in laboratoriumomgevingen worden gebruikt om de verspreiding van transgenen in anopheline muggenvectoren van malaria te evalueren. Deze omvatten inundatieve releases (geen gene-drive systeem), en gene-drive overlappende en niet-overlappende generatie proeven. De drie onderzoeken variëren in een aantal parameters en kunnen worden aangepast aan de gewenste experimentele instellingen. Bovendien maken insectenstudies in kleine kooien deel uit van de geleidelijke overgang van gemanipuleerde insecten van het laboratorium naar open veldafgiftes. Daarom vertegenwoordigen de hier beschreven protocollen onschatbare hulpmiddelen om empirische waarden te bieden die uiteindelijk zullen helpen bij de implementatie van nieuwe technologieën voor de eliminatie van malaria.

Inleiding

Strategieën op basis van genetisch gemanipuleerde muggen worden nagestreefd om de overdracht van door vectoren overgedragen pathogenen zoals die welke malaria ^veroorzaken1 te beheersen. Deze omvatten technologieën 1) gericht op het verminderen van de aantallen en dichtheden van Anopheles-muggen (populatieonderdrukking), of 2) gericht op het verminderen van het vermogen van vectoren om parasieten over te dragen die verantwoordelijk zijn voor menselijke ziekten (populatiemodificatie, vervanging of verandering), waarbij vectorstammen zijn ontworpen om effectorgenen tot expressie te brengen die de overdracht van pathogenen voorkomen. Deze genetische benaderingen zijn versterkt door de komst van CRISPR / Cas9-gebaseerde gene drives, met proofs-of-concept in parasiet-overdragende muggen van effectieve verspreiding van payload-eigenschappen en anti-parasitaire effectormoleculen in gekooide populaties.

Kleine laboratoriumkooiproeven vormen een eerste stap voor de evaluatie van de kenmerken van transgene stammen als onderdeel van een gefaseerde aanpak van hun verdere ontwikkeling naar ^{veldtoepassingen2}. Specifieke uitkomstoverwegingen omvatten erfelijkheid van het geïntroduceerde DNA in een competitieve omgeving, penetrantie en expressiviteit van het fenotype en stabiliteit. Relevante experimentele ontwerpkenmerken omvatten de grootte van de kooien, muggendichtheden, aantal replicaties, overlappende of niet-overlappende generaties, leeftijdsgestructureerde doelpopulaties, enkele of meerdere releases van gemanipuleerde stammen, alleen voor mannen, alleen vrouwen of gemengd geslacht, afgifteverhoudingen, bloedmeelbronnen (kunstmatig of levend dier) en screeningprocedures.

We beschrijven hier protocollen die worden gebruikt om stammen van anophelinemuggen te evalueren op inundatieve releases (geen genaandrijvingssysteem) en die welke autonome gene-drive-systemen dragen die worden gemedieerd door Cas9-endonucleasen en gids-RNA's (gRNA). Toepassingen van deze protocollen verschijnen in Pham et al. (2019) ², Carballar-Lejarazú et al. (2020) ³, en Adolfi et al. (2020) ⁴.

Inundative release studies evalueren de verspreidingssnelheid van een ontworpen transgen onder Mendeliaanse overerving na meerdere releases van een groot aantal transgene muggen in een wilde populatie. Zonder de bevestiging van het transgen aan een aandrijfsysteem, bieden gegevens van inundatieve afgifteproeven informatie over de fitheid en dynamiek van het transgen van belang in een gestabiliseerde populatie.

Wanneer muggenpopulaties een autonoom gene-drive-systeem bevatten, zijn kleine kooiproeven ontworpen om de dynamiek van de verspreiding van het gewenste transgen te beoordelen door de snelheid van dominante markertoename te bepalen na een enkele introductie van transgene mannetjes. Autonome gene-drive elementen dragen de genen die coderen voor het Cas9-nuclease, gRNA en dominante marker op zo'n manier gekoppeld dat ze actief zijn in volgende generaties.

'Overlappende' generaties verwijzen naar de gelijktijdige aanwezigheid van meerdere generaties in dezelfde kooi om een leeftijdsgestructureerde continue populatie te creëren, terwijl 'niet-overlappend' verwijst naar enkele afzonderlijke generaties in elke opeenvolgende ^{kooipopulatie2}. Gene-drive kooi experimenten kunnen worden beëindigd zodra de initiële dynamiek van de drive (conversie) rate kan worden bepaald (8-10 generaties afhankelijk van het construct), en hoewel ze informatie verschaffen over de stabiliteit op korte termijn van het transgen binnen de muggenpopulatie, onthullen ze mogelijk niet wat er gebeurt wanneer en als de dominante markerfrequenties bereiken of dicht bij volledige introductie zijn (elke mug draagt ten minste één kopie van het gene-drive systeem).

Protocol

Verklaring inzake dierenethiek
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01).

1. Onderzoeken naar inundatieve afgifte op niet-gene drive muggen (figuur 1)

1. Kooiopstelling en onderhoud
   1. Stel drie sets drie drievoudige kooien van 0,216 ^m3 in door gedurende drie opeenvolgende weken 60 second-instar wild-type (WT) larven in elke kooi toe te voegen.
      OPMERKING: Het is niet mogelijk om het geslacht van second-instar larven te bepalen door middel van lichtmicroscopie, dus de monsters die aan elke kooi worden toegevoegd, bestaan uit zowel mannetjes als vrouwtjes.
   2. Voorzie volwassen vrouwtjes in elke kooi elke week van verdoofde muizen als bloedmeelbron (figuur 2A) en een ovipositiecontainer 3 dagen na het bloedmeel.
      OPMERKING: Hoewel een alternatief kunstmatig voedingsapparaat kan worden gebruikt, resulteert het leveren van levende verdoofde muizen voor bloedmeel in betere muggenvoedingsprestaties in deze grote (0,216 ^m3) kooiformaten. Dit vereist een goedgekeurd protocol voor diergebruik en relevante (bijv. Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) goedkeuring voor het gebruik van muizen.
      OPMERKING: Individuele muizen worden verdoofd met een mengsel van 4 mg/muis ketamine HCl en 0,4 mg/muis xylazine. Dieren worden geïnjecteerd met tussen 0,1 - 0,5 ml van dit mengsel.
   3. Broed wekelijks eieren uit elke kooi en selecteer willekeurig 60 second-instar (L2) larven om terug te keren naar hun respectieve kooien om de sterfte (weken 4-8) te compenseren.
      OPMERKING: De stappen 1.1.1 tot en met 1.1.3 zijn noodzakelijk om een stabiele en verdeelde leeftijdsgestructureerde populatie in de kooien tot stand te brengen - de zogenaamde "beginfase".
   4. Wijs in week 9 kooien toe die in stap 1.1.1 willekeurig in drievoud zijn geassembleerd voor releases van de gewenste mannelijke afgifteverhouding.
      1. Wijs één set drievoudige kooien aan als controles om de consistentie gedurende het hele experiment te beoordelen.
      2. Wijs één set drielicaten aan voor elke gewenste afgifteverhouding (bijvoorbeeld 1:1 of 1:0,1 transgeen:WT-mannetjes).
         OPMERKING: Dit punt wordt aangeduid als 'Experimentele Fase'.
2. Repliceert en releaseverhoudingen
   1. Voeg wekelijks 60 WT-poppen (30 mannetjes en 30 vrouwtjes) toe aan de controlekooien.
   2. Om een verhouding van 1:1 te behouden, voegt u wekelijks 30 transgene mannelijke poppen samen met 60 (30 mannelijke en 30 vrouwelijke) WT-poppen toe aan elke respectieve kooi.
   3. Om een verhouding van 1:0,1 te behouden, voegt u wekelijks 300 transgene mannelijke poppen samen met 60 (30 mannelijke en 30 vrouwelijke) WT-poppen toe aan elke respectieve kooi.
      OPMERKING: Voortdurende toevoeging van wilde muggen aan de kooien handhaaft de kooidichtheid, die naar verwachting wekelijks zal afnemen als gevolg van leeftijdsgebonden volwassen sterfte.
3. Screening van fenotypes
   1. Selecteer willekeurig in totaal 300 larven uit elke kooi. Met behulp van een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentiefilters, screenen op de expressie van de fluorescerende dominante marker in de larvale en popstadia en scoren het geslacht van de resulterende volwassenen (figuur 3).
      OPMERKING: De fenotypische screening zal afhangen van de dominante marker die is opgenomen in het transgenconstruct dat in de muggen is geïntegreerd (bijvoorbeeld Discosoma sp. rood fluorescerend eiwit [DsRed], cyaan fluorescerend eiwit [CFP], groen fluorescerend eiwit [GFP]), en van de promotor die de expressie ervan aandrijft (de meest gebruikte in muggentransgenese is de 3xP3 promotor die de expressie in de ogen en zenuwkoord aandrijft).
   2. Volg dit protocol gedurende zoveel generaties als vereist door de uitkomstparameters die zijn gedefinieerd in het experimentele ontwerp.
      OPMERKING: De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen ten minste één kopie van het transgen hebben (bepaald door de aanwezigheid van de dominante fluorescerende marker) of de verhouding van transgene tot WT-muggen in een kooi is gestabiliseerd en niet sterk fluctueert na een paar (3-5) generaties.

2. Overlappende generatieproeven met gene-drive muggen (figuur 4)

OPMERKING: Muggen die gene-drive-systemen dragen, vereisen geschreven en beoordeelde protocollen en moeten worden goedgekeurd door een institutioneel bioveiligheidscomité (IBC) of gelijkwaardig, en anderen waar nodig. Muggeninsluiting (ACL 2⁺ niveau) moet de aanbevolen procedures ^volgen5,6,7. In het bijzonder moeten de gene drive-experimenten twee strenge opsluitingsstrategieën gebruiken. De eerste is meestal fysieke barrières (Barrier Strategy) tussen organismen en de omgeving. Dit vereist het hebben van een veilige insectaire en standaard operationele procedures (inclusief monitoring) om ervoor te zorgen dat muggen niet kunnen ontsnappen. De tweede opsluitingsstrategie kan moleculair, ecologisch of reproductief ^zijn5.

1. Kooi opstelling
   1. Stel twee sets drievoudige kooien van 0,216 ^m3 in voor elke gewenste transgene: WT mannelijke afgifteverhouding.
      1. Om een mannelijke afgifteverhouding van 1:1 te bereiken, voegt u 120 transgene mannetjes, 120 WT-mannetjes en 120 WT-vrouwtjes in het popstadium toe aan elke replicatiekooi.
      2. Om een afgifteverhouding van 1:10 te bereiken, voegt u 12 transgene mannetjes, 120 WT-mannetjes en 120 WT-vrouwtjes in het popstadium toe aan elke replicatiekooi.
         OPMERKING: Verschillende afgifteverhoudingen kunnen worden getest (1: 1, 1: 3, 1: 10, enz.) en het aantal muggen dat wordt gebruikt om de experimenten te initiëren varieert dienovereenkomstig. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de effecten van lage cijfers op de statistische evaluatie van de gegevens.
2. Bevolkingsbehoud en screening
   1. Voorzie 4-7 dagen oude vrouwtjes in elke kooi van een bloedmaaltijd met behulp van verdoofde muizen (figuur 2A).
   2. Drie dagen na het bloedmeel, plaats een ovipositie container in elke kooi.
   3. Broed eieren uit in een larvale tray, selecteer ~ 240 eerste instar (L1) larven willekeurig uit elke kooi, voed ze op tot volwassenheid en breng ze terug naar hun respectieve kooien.
   4. Geef elke 3-4 dagen extra (2-3) bloedmaaltijden voor de nieuw ontstane volwassenen zoals beschreven in stap 2.2.1.
      OPMERKING: Er worden geen extra transgene mannetjes toegevoegd tijdens een van de volgende generaties.
   5. Selecteer willekeurig in totaal 300 larven uit elke kooi en screen ze op de aanwezigheid van het dominante markerfenotype in de larvale en popstadia met behulp van een fluorescentie-stereomicroscoop en scoor opkomende volwassenen voor seks (figuur 3).
      OPMERKING: Net als voorheen zal de fenotypische screening afhangen van de dominante marker en promotor die in het gene-drive-systeem zijn opgenomen en in de transgene muggen zijn geïntegreerd (bijv. DsRed, CFP of GFP). Als homozygote of heteroallelische verstoringen van de beoogde genen resulteren in een zichtbaar fenotype (bijvoorbeeld genen die verband houden met oogpigmentatie), zal screening van deze eigenschap afhangen van welk stadium het het gemakkelijkst is om het veranderde fenotype te visualiseren.
   6. Volg dit protocol gedurende zoveel generaties als vereist door de uitkomstparameters die zijn gedefinieerd in het experimentele ontwerp.
      OPMERKING: Elke generatie (begrensd door het bloedmeel) duurt ~ drie weken. De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen als homozygoot worden beschouwd voor het gen-drive construct of de populaties stabiliseren op een maximaal percentage muggen die ten minste één kopie van de gene-drive construct dragen.

3. Niet-overlappende generatieproeven met gene-drive muggen (figuur 5).

1. Kooi opstelling
   1. Stel drievoudige kooipopulaties van 0,005 ^m3 in voor elke specifieke afgifteverhouding van transgenen tot WT-mannetjes die moet worden onderzocht (bijvoorbeeld drie sets drievoudige kooien die elk zijn opgezet met 1:1, 1:3, 1:10 afgifteverhoudingen). Stel alle kooien in met een gelijk totaal aantal mannetjes en vrouwtjes.
      OPMERKING: Het aanvullend bestand is een video die de bouw van de koloniekooi van 0,005 ^m3 demonstreert.
      1. Voeg 50 transgene mannetjes, 50 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie replicaatkooien om een 1: 1 mannelijke afgifteverhouding te bereiken.
      2. Voeg 25 transgene mannetjes, 75 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie repliceerkooien om een 1: 3 mannelijke afgifteverhouding te bereiken.
      3. Voeg 9 transgene mannetjes, 90 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie replicaatkooien om een 1:10 mannelijke afgifteverhouding te bereiken.
         OPMERKING: Verschillende afgifteverhoudingen kunnen worden getest en het aantal muggen dat wordt gebruikt om de experimenten te initiëren, kan dienovereenkomstig variëren. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de impact van lage aantallen muggen op de statistische analyses. Dit zijn single releases; er worden geen extra transgene mannetjes toegevoegd bij een volgende generatie.
2. Bevolkingsbehoud en screening
   1. Voorzie de 4-7 dagen oude vrouwtjes in elke kooi van bloedmaaltijden met behulp van een kunstmatig voedingsapparaat (figuur 2B) op twee opeenvolgende dagen.
      OPMERKING: Routinematige bloedmaaltijden voor vrouwen bestaan uit een in de handel verkrijgbare bron van bloed (bijv. Kalfsbloed) afkomstig van een voedingsapparaat. Levende verdoofde muizen worden alleen gebruikt om bloedmeel te leveren in grotere (0,216 ^m3) kooiformaten voor betere voedingsprestaties.
   2. Voeg 3 dagen na het tweede bloedmeel een ovipositiecontainer toe. Verwijder na drie dagen de ovipositiecontainers.
      OPMERKING: Bij deze stap kunnen 5-10 vrouwtjes willekeurig uit elke kooi worden geselecteerd en individueel in injectieflacons worden geplaatst om indien nodig aanvullende fitnessparameters te beoordelen, zoals vruchtbaarheid en vruchtbaarheid.
   3. Scoor op geslacht alle volwassenen (dood en levend) die in de kooi achterblijven en bewaar ze bij -80 °C voor moleculaire analyse.
   4. Broed eieren uit en selecteer willekeurig 200 L1-larven uit de kooien met een verhouding van 1: 1 en 1: 3 om nieuwe kooien voor de volgende generatie te bevolken.
      OPMERKING: Vanwege de lage frequentie van het starten van transgeen individu in de kooien met een verhouding van 1:10, kan willekeurige bemonstering leiden tot overmatig verlies van transgene nakomelingen in de volgende generatie om de populatie voort te zetten.
   5. Om een nauwkeurige bemonstering voor de 1:10 kooien en voldoende transgene muggen te garanderen, screent u alle larven op de dominante marker en selecteert u 200 larven die de waargenomen transgenfrequentie weerspiegelen om de nieuwe kooien te bevolken.
      OPMERKING: De 1:10 kooien kunnen identiek worden gehouden aan 1:1 en 1:3 kooien wanneer ze een transgen frequentie van ≥80% bereiken.
   6. Selecteer willekeurig 500 larven uit elke kooi voor een diepgaande analyse. Screen onder een fluorescentie stereomicroscoop op de verwachte marker fenotypes in de larvale en popstadia en scoor het geslacht van volwassenen (figuur 3).
      OPMERKING: 'Uitzonderlijke' fenotypen kunnen worden geselecteerd om verder te worden gekruist en moleculair geanalyseerd om resistente allelvorming te volgen.
   7. Dit protocol kan gedurende zoveel generaties worden gevolgd als vereist door de uitkomstparameters die in het experimentele ontwerp zijn gedefinieerd.
      OPMERKING: Elke generatie wordt begrensd door het bloedmeel en duurt ~ drie weken. De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen als homozygoot worden beschouwd voor de gene-drive-constructie of populaties stabiliseren bij een maximale prevalentie van transgene muggen. En net als voorheen zal screening op fenotypen afhangen van de dominante markers en promotor geïntegreerd in de transgene muggen (bijvoorbeeld DsRed, CFP, GFP) of in de beoogde genen als ze een zichtbaar fenotype vertonen (bijvoorbeeld genen die verband houden met oogpigmentatie).

Resultaten

Transgene anophelinemuggen die worden gegenereerd om niet-gene drive of autonome gene-drive modificaties te dragen, worden opgezet voor kooiproeven zoals beschreven in de sectie Protocollen. De representatieve resultaten die hier worden getoond, tonen de fenotypedynamiek van de best presterende replicaties van elk van de kooiproeven uitgevoerd door Pham et al. (2019) ² voor Anopheles stephensi muggen. De drie onderzoeken (respectievelijk 1 - 3: inundatieve niet-gene drive, overlappende gene-drive en niet-overlappende gene-drive) varieerden in verschillende parameters, zoals de grootte van de kooi (0,216 ^m3 versus 0,005 ^m3), of de doelpopulatie al dan niet leeftijdsgestructureerd was, bron van bloedmeel (muizen of kunstmatige feeder) en afgifteverhoudingen. Als representatiemiddel toont figuur 6 de waargenomen gegevens die zijn geselecteerd uit dezelfde afgifteverhouding (1:1) voor alle drie de gebruikte protocollen, in de loop van zeven generaties.

De 1:1 non-drive release bereikt >80% transgen introductie binnen 6-7 generaties. Voor transgene kooiproeven met gene-drive bereiken de 1:1-releases in zowel de niet-overlappende als overlappende protocollen dit niveau binnen 3-4 generaties, waardoor de verwachting wordt gevalideerd dat een enkele release van een gene drive-systeem efficiënter kan zijn dan niet-drive inundatieve releases voor transgene introductie. Het snellere traject kan ook worden bevestigd door de helling van de trendlijnen. Beide gene-drive protocollen, ondanks verschillende opstellingen, presenteren vergelijkbare hoeken en hellingstrends. Aan het einde van de observatie bereiken niet-aangedreven kooien ~ 80% van de individuen die het transgen dragen, terwijl kooien met gene-drive individuen volledige (of bijna volledige) introductie bereiken. Volledige gegevens en verwerkingsdetails over individuele experimentresultaten met behulp van de hier beschreven protocollen zijn te vinden in figuren 1-3 van Pham et al. (2019) ², Figuren 2-3 van Carballar-Lejarazú et al. (2020) ³ en figuur 3 van Adolfi et al. (2020) ⁴.

Figuur 1. Niet-drive inundative release trial schematisch.  Negen kooien van 0,216 ^m3 zijn opgezet met 60 wild-type second-instar (gemengde geslachten) larven toegevoegd aan elk. Vanaf week 3 krijgen vrouwtjes wekelijks een bloedmaal en worden eieren verzameld en uitgebroed. Tot week 8 worden wekelijks 60 larven willekeurig geselecteerd en teruggebracht naar hun respectievelijke kooien om een leeftijdsgestructureerde populatie in de kooien te creëren (beginfase). Vanaf week 9 worden de negen kooien willekeurig toegewezen in drievoud op basis van hun transgene: wild-type mannelijke afgifteverhoudingen (experimentele fase). Kooien A (Control) hebben geen transgene poppen toegevoegd. Vrouwtjes krijgen wekelijks een bloedmaal en eieren worden verzameld, uitgebroed en grootgebracht om poppen te krijgen. 30 mannelijke en 30 vrouwelijke wilde poppen worden weer aan hun kooien toegevoegd. Kooien 1:1 hebben nog eens 30 transgene mannelijke poppen toegevoegd. Kooien 1:0.1 hebben nog eens 300 transgene mannelijke poppen toegevoegd. 300 larven uit elk van de 9 kooien worden willekeurig geselecteerd en gescreend op de fluorescerende marker. Deze procedure werd wekelijks herhaald tot transgene fixatie (gestabiliseerde verhouding van transgeen-wildtype muggen na een paar generaties). Aangepast van Pham et al. (2019) ². Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Bloedtoevoer van kooipopulaties.  (A) Verdoofde muizen of (B) Hemotek-bloedvoeders worden aangeboden voor bloedvoedende vrouwelijke muggen op respectievelijk de kooien van 0,216 ^m3 of de kleine kooien van 0,005 ^m3 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Screening van fenotypes op niet-drive, overlappende gene-drive en niet-overlappende gene-drive cage trials.  Fluorescerende beelden van een larve, pop en volwassene van transgene of wild-type fenotypes. In dit voorbeeld werden An. stephensi-individuen gescreend op de DsRed-marker aangedreven door de 3xP3-promotor in de ogen (DsRed + of DsRed-), zichtbaar in alle drie de stadia, en volwassenen werden gescreend op seks ( ♀ of ♂ ). Let op de achtergrondfluorescentie in wild-type larven geassocieerd met de voedselbolus in het midgut. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Overlappend schema van de gene-drive kooiproef.  Zes kooien van 0,216 ^m3 zijn in drievoud opgesteld volgens hun gene-drive:wild-type mannelijke afgifteverhoudingen. Aan elke kooi werden 120 wildtype mannetjes en 120 wildtype vrouwtjes toegevoegd. Kooien met een 1: 1 gene-drive mannelijke release ratio hadden nog eens 120 transgene mannetjes toegevoegd. Kooien met een 1:10 mannelijke release ratio hadden nog eens 12 transgene mannetjes toegevoegd. Tot volledige introductie van het transgen, elke 3 weken, worden volwassen vrouwtjes voorzien van bloedmeel en worden eieren verzameld en uitgebroed. In totaal werden 240 larven willekeurig geselecteerd en teruggebracht naar hun respectievelijke kooien. Driehonderd (300) larven worden willekeurig geselecteerd en gescreend op de dominante marker. Ze worden later gescreend als poppen en volwassenen voor oogkleur en seks. Er worden geen extra transgene mannetjes toegevoegd aan de oorspronkelijke kooien. Aangepast van Pham et al. (2019) ². Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Niet-overlappend gene-drive kooi trial schema.  Negen kleine kooien van 0,005 ^m3 zijn in drievoud opgesteld op basis van hun gene-drive:wild-type mannelijke afgifteverhoudingen. Kooien met een 1: 1 mannelijke release ratio hebben 100 wild-type vrouwtjes, 50 wild-type mannetjes en 50 gene-drive mannetjes toegevoegd. Kooien met een 1: 3 mannelijke release ratio hebben 100 wild-type vrouwtjes, 75 wild-type mannetjes en 25 gene-drive mannetjes toegevoegd. Kooien 1:10 mannelijke release ratio hebben 100 wild-type vrouwtjes, 90 wild-type mannetjes en 9 gene-drive mannetjes toegevoegd. Vrouwtjes krijgen een bloedmaaltijd en eieren verzameld en uitgebroed. Voor 1:1 en 1:3 kooien worden 200 larven willekeurig geselecteerd en gebruikt om nieuwe kooien te bevolken, gescheiden van die van hun ouders, voor de volgende generatie. Nog eens 500 larven worden willekeurig geselecteerd en opgevoed tot poppen, wanneer ze worden gescreend op het dominante markergen. De 500 poppen worden vervolgens opgevoed tot volwassenen en gescoord op geslacht. Alle resterende larven worden gescreend op de marker. Voor de 1:10 kooien worden alle larven gescoord in generaties 1-12 en 200 larven die de bestaande transgenfrequentie weerspiegelen, worden gebruikt om nieuwe kooien te bevolken. Vanaf generatie 13 zijn deze kooien identiek opgesteld als de 1:1 en 1:3 kooien. Aangepast van Pham et al. (2019) ² en Carballar-Lejarazú et al. (2020) ³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Voorspelde transgene fixatiedynamiek voor de verschillende populatievervangende kooiproeven.  Weergave van de verwachte fenotypedynamiek van de best presterende replicaties voor elk van de kooiproeven uitgevoerd door Pham et al. (2019) ², gemonitord over 7 generaties. Het instellen van experimenten wordt beschreven in de protocollen. De voorspellingen zijn gebaseerd op gegevens van alle 9 experimenten op de 1:1 release modellen (drievoudige replicaties voor elk van de drie verschillende kooiproefprotocollen). De X-as is het generatienummer na de eerste introductie en de Y-as is het aandeel larven dat het DsRed-markerfenotype (DsRed+) in de loop van de tijd vertoont. Stippellijnen vertegenwoordigen lineaire trendlijnen van de gegevens. Het DsRed+ fenotype is het gevolg van het hebben van ten minste één kopie van het gemodificeerde allel. Vandaar dat de resultaten de verspreiding van het transgen weerspiegelen, versneld in het gene drive-systeem, en aan het einde van de observatie (bijna) volledige introductie bereikt. Voor de variabiliteit tussen replicaties en volledige gedetailleerde gegevens over de experimenten, verwijzen wij u naar Pham et al. (2019) ², Carballar-Lejarazú R et al. (2020)³ en Adolfi A et al. (2020)⁴. Afbeeldingen aangepast van Pham TB et al. (2019) Experimentele populatiemodificatie van de malariavectormug, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 en Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. DOI: 10.1073/pnas.2010214117. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier: De bouw van de koloniekooi van 0,005 ^m3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Genetisch gemanipuleerde muggen die pathogeen blokkerend vermogen hebben of steriliteitsgenen dragen, vormen nieuwe hulpmiddelen om door vectoren overgedragen ziekten te bestrijden. Gezien de veelheid aan parameters waaruit deze alternatieve benaderingen bestaan, bestaat een cruciale stap in hun onderzoek uit laboratorium-beperkte experimentele evaluaties die een snelle en veilige voorspelling van de potentiële uitkomsten van een synthetische transgenafgifte voor controledoeleinden mogelijk ^maken1.

Omdat de monitoring van de transgendynamiek in kooipopulaties enkele maanden kan duren, is een van de centrale aspecten van de protocollen de consistentie in experimenteel ontwerp tussen replicaties (inclusief muggenopfok, kooigrootte, leeftijdsgestructureerde populaties, vaste afgifteverhoudingen, stabiele bloedmeelbronnen en minimaal invasieve screeningprocedures).

Mannelijke vrijlatingen worden als ideaal beschouwd omdat mannelijke muggen geen ziekteverwekkers overbrengen of zich voeden met mensen, daarom kunnen ze veilig erfelijke kenmerken introduceren in wilde populaties. In laboratoriumkooiexperimenten is het mogelijk om transgene stammen te detecteren met verminderde mannelijke paringsconcurrentievermogen en andere fitnessbelastingen die verband houden met transgene integratie. Directe en specifieke experimenten, zoals die uitgevoerd in grote ^kooien10, kunnen echter worden uitgevoerd om het mannelijke concurrentievermogen goed te analyseren, evenals de vrouwelijke vruchtbaarheid in meer natuurlijke ^{muggendichtheden2}. Bovendien kunnen empirische gegevens uit de kooiproeven worden gebruikt om modellen van kooipopulatiedynamiek te parametriseren, inclusief resistente allelvorming, en nuttige informatie te verschaffen over de effectiviteit en mogelijke aanpassingen in de voorgestelde technologie.

De hier beschreven protocollen kunnen naar wens eenvoudig worden aangepast aan andere experimentele ontwerpen, met minimale vereisten met betrekking tot reguliere insectaire infrastructuur en omstandigheden. Bovendien, met uitzondering van de commerciële kooien en microscopen, zijn de meeste materialen goedkoop en maken ze goedkope meerdere replicaties en iteraties van de proeven mogelijk. Dit maakt het met name ook mogelijk om meerdere transgene stammen vooraf te screenen in kleine kooiproeven om prioriteit te geven aan de best presterende kandidaten die vooruit moeten worden geholpen in de gefaseerde testroute en om het testen op degenen met suboptimale prestaties op te schorten.

Ten slotte motiveert bezorgdheid over het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen de uitwerking van kaders voor de ontwikkeling, evaluatie en toepassing van genetische strategieën voor de preventie van door muggen overgedragen ^ziekten5,8,9. De relevantie en uitvoering van de hier gedefinieerde protocollen zijn in overeenstemming met deze richtlijnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Artificial feeders	Hemotek	SP6W1-3	Starter pack – 6 feeders met 3ml reservoirs
Cage, commercial	BioQuip	1450D	Inklapbare kooi, 24 X 24 X 24" - 0,216 m3 (60 cm3)
Cage tub (popcorn)	Amazon.com	VP170-0006	0,005 m3 (170 fl oz)
Dissectiemicroscoop met fluorescentielicht en filters	Leica	M165FC
Lijmsticks	Michaels	88646598807	Lijmsticks 40 pk,  0,4X4”
Hetelijmpistool	Woodwards Ace	2382513	Stanley, 40 watt, GR20
Nylon gaas (netting)	Joann.com	1102912	Tulle 108" Breed x 50 Yards - ~35,6 cm2 (14 in2)
Ovipositiebekers	Fisher	259126	Beker PP gegradueerd 50 mL
Scheermes snijgereedschap	Office Depot	487899	Doossnijders
Schaar	Office Depot	978561	Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Schaar, 8"
Hefmachine	Office Depot	908194	Swingline Commercial Desk Hefmachine
Chirurgische manchet (stockinet)	VWR	56612-664	~48 cm (19”) gesneden uit spoel ~15 cm (6”) X ~23 m (25y)
Zakjes	Home Depot	295715	Pk van 100, 14” kabelbinders - 35,6 cm (14 in)